一株具有吲哚降解能力的不动杆菌NTA1-2A及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域中，一株具有吲哚降解能力的不动杆菌nta1-2a及其应用。

背景技术：

随着畜牧养殖业在我国的快速发展，集约化的规模养殖已使改善畜禽场的环境成为一个紧迫的问题。在畜禽生产和粪便储存过程中会产生大量的恶臭物质，对人和动物的健康产生严重威胁，这些成分复杂的恶臭气体主要包括氨气、硫化氢和吲哚等，而目前关于养殖业的恶臭处理主要针对氨气与硫化氢，对吲哚没有相关的排放标准及治理措施。已有研究证明，大量的吲哚挥发不但能直接产生恶臭、刺激眼睛和皮肤，还能抑制动植物体内蒽醌的生物合成，影响周边植物的生长以及危害动物和人类的健康，因此，控制畜禽粪便中吲哚及其衍生物的挥发显得尤为重要。

粪便中的吲哚是由色氨酸分解产生的一类含氮杂环化合物，可作为某些微生物生长所必须的碳源和氮源，这些微生物利用其丰富的酶系，可通过脱氢、加h2o、碳链断裂等多种反应使吲哚转化为简单的醇、醛或有机酸等，因此可通过生物法降解粪便中的吲哚达到控制粪便中吲哚类臭气挥发的目的。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何降解吲哚。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.14001。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a。

所述菌剂可以所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a作为其活性成分，还可将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a于具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

所述菌剂可为用于降解吲哚的菌剂。

上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。

本发明还提供了所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a或其菌体悬液或其发酵液或其代谢产物或所述菌剂的下述任一应用：

a1)在降解样品中吲哚中的应用；

a2)在制备降解吲哚产品中的应用；

a3)在抑制样品中吲哚挥发中的应用；

a4)在制备抑制吲哚挥发产品中的应用。

上述应用中，利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在25-37℃的温度下进行。进一步，利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在25-34℃的温度下进行。更进一步，利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在28-31℃的温度下进行。

利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在ph为5-9的环境中进行。利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在ph为5-8的环境中进行。进一步，利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在ph为5-7的环境中进行。更进一步，利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a降解吲哚可在ph为6的环境中进行。

所述样品中吲哚的含量可为65.58-196.75mg/l。所述样品中吲哚的含量进一步可为65.58-131.17mg/l。

上述应用中，所述样品可为粪便或水。

本发明还提供了下述任一产品：

b1)利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a制备的降解吲哚的产品；

b2)利用所述菌剂制备的降解吲哚的产品；

b3)利用所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a制备的抑制吲哚挥发的产品；

b4)利用所述菌剂制备的抑制吲哚挥发的产品。

本发明还提供了降解吲哚的方法，所述方法包括：将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a接种在含有吲哚的样品中，得到混合物，培养该混合物，实现所述样品中吲哚的降解。

本发明还提供了抑制吲哚挥发的方法，所述方法包括：将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a接种在含有吲哚的样品中，得到混合物，培养该混合物，实现抑制所述样品中吲哚的挥发。

上述方法中，培养所述混合物可在25-37℃的温度下进行。进一步，培养所述混合物可在25-34℃的温度下进行。更进一步，培养所述混合物可在28-31℃的温度下进行。

上述方法中，将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a接种在含有吲哚的样品中可将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a的菌体悬液接种在所述样品中。接种所述菌体悬液的接种量可为1％。所述菌体悬液的浊度可为浊度400ntu。

上述方法中，所述样品可为粪便或水。

本发明还提供了下述c1)或c2)的方法：

c1)培养所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a的方法，包括将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a在用于培养不动杆菌的培养基中培养；

c2)所述菌剂制备方法，包括：将所述不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a作为活性成分，得到所述菌剂。

c1)中所述培养基可为msm培养基或msm分离培养基。

所述msm培养基中，每升培养基含有如下物质：k2hpo40.80g；kh2po40.20g；cacl20.05g；mgcl20.5g；fecl20.01g；(nh4)2so41.0g；nacl5.0g；ph＝5-9。所述msm培养基的ph可为5-8。所述msm培养基的ph进一步可为5-7。所述msm培养基的ph进一步可为6。

所述msm分离培养基中，每升培养基含有如下物质：k2hpo40.80g；kh2po40.20g；cacl20.05g；mgcl20.5g；fecl20.01g；(nh4)2so41.0g；nacl5.0g；3-mi0.5mm；ph＝5-9。所述msm分离培养基的ph可为5-8。所述msm分离培养基的ph进一步可为5-7。所述msm分离培养基的ph进一步可为6或7。

本发明中，所述吲哚为3-甲基吲哚。

所述粪便可为畜禽粪便，如鸡粪。

本发明提供的不动杆菌acinetobactertownerinta1-2a，其吲哚降解能力测定结果表明吲哚的降解效果良好，能有效的降解粪便中的吲哚，降解率最高可达到90.19％，表现出了较高的应用潜力。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：不动杆菌(acinetobactertowneri)

生物材料的菌株编号：nta1-2a

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2017年4月7日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.14001

附图说明

图1为显微镜下acinetobactertownerinta1-2a菌落照片。

图2为温度对acinetobactertownerinta1-2a生长的影响。

图3为ph对acinetobactertownerinta1-2a生长的影响。

图4为温度对acinetobactertownerinta1-2a吲哚降解能力的影响。

图5为ph对acinetobactertownerinta1-2a降解能力的影响。

图6为不同初始浓度对acinetobactertownerinta1-2a吲哚降解率的影响。

图7为acinetobactertownerinta1-2a在降解粪便中吲哚的应用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

msm培养基：k2hpo40.80g/l；kh2po40.20g/l；cacl20.05g/l；mgcl20.5g/l；fecl20.01g/l；(nh4)2so41.0g/l；nacl5.0g/l。

msm分离培养基：k2hpo40.80g/l；kh2po40.20g/l；cacl20.05g/l；mgcl20.5g/l；fecl20.01g/l；(nh4)2so41.0g/l；nacl5.0g/l；0.5mm3-mi；ph＝7。

msm分离培养基中的吲哚为3-mi(3-甲基吲哚)。

上述培养基的固体培养基为加入1.4％的琼脂。

上述培养基灭菌方式为121℃高压灭菌20min，培养基中的吲哚采用单独灭菌的方式，具体方式为采用0.22μm的滤膜过滤灭菌后与培养基中其他成分混合。

实施例1、吲哚降解菌的分离、纯化及鉴定

1、吲哚降解菌的分离纯化

采集常温保存3天的鸡粪样品10g接种于装有150ml生理盐水的的锥形瓶中，140r/min震荡30min，静置20min后取上清液1ml接种于150ml的msm分离培养基中，30℃、140r/min培养2天后，再次取1ml培养液接种于新的msm分离培养基中，如此反复10代。取富集10代后的培养液1ml，经10^-1梯度稀释后，取200μl涂布于msm分离培养基固体平板上，于30℃培养24～72h，24h后开始观察菌的生长情况，选取生长快、菌落大、数量多的菌落采用三线法进行纯化。将纯化后的单菌落接种到150ml的msm分离培养基中，30℃、140r/min培养48h后测定吲哚含量，选取吲哚降解率最高的菌株，作为实验菌株，命名为nta1-2a。

2、形态学观察

通过在固体培养基上观察与染色后镜检发现，该菌株为革兰氏阴性菌，在显微镜下以链状或单独的棒状存在。菌丝分隔，透明，光滑(图1)。

3、分子生物学鉴定

从分离平板上挑取单克隆nta1-2a，接种于msm分离培养基中，30℃，140rmp条件下震荡24h，离心，收集菌体，提取总dna。以菌株nta1-2a的总dna作为模板，进行16srdna的扩增。得到pcr产物，经过测序，该pcr产物的核苷酸序列为序列表中序列1，将该序列进行blast比对分析，发现菌株nta1-2a与acinetobactertowneri的相似度最高，为99％。

综合菌株形态特征和16srdna序列，鉴定nta1-2a为不动杆菌(acinetobactertowneri)。

不动杆菌(acinetobactertowneri)nta1-2a于2017年4月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号cgmccno.14001，分类命名为不动杆菌(acinetobactertowneri)。

实施例2、不动杆菌nta1-2a降解吲哚功能研究

一、不同温度和ph对菌株生长的影响

菌丝悬浊液：挑取实施例1获得的acinetobactertownerinta1-2a的单菌落接种于msm分离培养基中进行活化。48h后将培养液用灭过菌的4层纱布过滤得到菌体，用无菌生理盐水冲洗2次，之后将转移到手动匀浆器中，加无菌去离子水进行轻微匀浆，制成均匀的菌体悬浊液(浊度为400ntu(浊度单位))，备用。

1)将acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浊液按1％的体积比接种到含1mm3-甲基吲哚的msm培养基(ph调至7.0)中进行培养，培养温度设置为25℃、28℃、31℃、34℃和37℃，140rmp震荡培养60h，在培养后的12h、24h、36h、48h和60h分别采集培养液，测定培养液od600值，探究温度对acinetobactertownerinta1-2a生长性能的影响。

结果如图2所示，菌体细胞进入新的培养体系后出现一段适应期，此时培养液中菌株浓度增长较为缓慢，12h以后开始快速上升，到48h以后呈现缓慢降低趋势。随着温度的升高，菌株浓度呈先升高后降低的趋势，其中温度为31℃时，菌株浓度增长最快，故31℃为该菌株最适生长温度。

2)将acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浊液按1％的体积比接种到含1mm3-甲基吲哚的msm培养基中进行培养，调节msm培养基的ph分别为5、6、7、8和9，培养温度保持30℃不变，140rmp震荡培养60h，在培养后的12h、24h、36h、48h和60h分别采集培养液，测定培养液od600值，探究ph对acinetobactertownerinta1-2a生长性能的影响。

不同ph对acinetobactertownerinta1-2a生长的影响结果见图3。随着时间的延长，菌株浓度整体显示先升高后降低的趋势，其中ph为6时菌株浓度增长最快，24小时达到最高浓度且并未出现明显的降低，故acinetobactertownerinta1-2a培养的最佳ph为6。

二、不同温度和ph对菌株降解吲哚能力的影响

msm培养基加入1mm3-甲基吲哚；用1mol/l的hcl和1mol/lnaoh调节ph，得到ph分别为5、6、7、8、9的四种培养基。

1)将步骤一得到的acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浊液按1％的体积比接种到初始ph值为6的msm培养基中进行培养，培养温度设置为25℃、28℃、31℃、34℃和37℃，140rmp震荡培养96h后采集培养液，测定培养液吲哚含量，探究温度对acinetobactertownerinta1-2a降解吲哚能力的影响。

结果如图4所示，可以看出，随着温度的升高，吲哚降解率呈先升高后降低的趋势，并在31℃时达到最大降解率88.13％，随着温度的继续升高，菌株生长受到限制，吲哚降解率亦呈现降低的趋势。

其中，培养液中吲哚含量的测定方法如下：取培养液2ml，离心(离心力8000×g)10分钟，用0.22μmptfe疏水性微孔滤膜过滤，吸取20μl滤液注入高效液相色谱仪(岛津lc-15c,kyoto,japan)检测，记录色谱图。色谱条件为：c18柱(agilenttechnologies,inc.,santaclara,ca,usa)，柱长250mm，柱径4.6mm，柱温30℃，流动相为1％乙酸水溶液和甲醇等体积混合，流速流速0.6ml/min，检测器波长260nm。另取3-甲基吲哚标准品(上海麦克林生化科技有限公司，cas：83-34-1，mdl：mfcd00005627)，同法测定按外标法以峰面积计算吲哚含量。

吲哚降解率＝(1-培养液吲哚含量)/1mm×100％。

2)将acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浊液按1％的体积比分别接种到ph分别为5、6、7、8和9的msm培养基中进行培养，培养温度保持31℃不变，140rmp震荡培养96h后采集培养液，测定培养液中吲哚含量，探究ph对acinetobactertownerinta1-2a降解吲哚能力的影响。

不同ph对acinetobactertownerinta1-2a生长的影响结果见图5。随着ph的增加，吲哚降解率先升高后降低，与生长趋势保持一致，在ph为6时达到最高吲哚降解率88.13％。

三、不同初始吲哚浓度对acinetobactertownerinta1-2a降解吲哚能力的影响

将步骤一得到的acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浊液按1％的体积比接种到加入含有不同初始浓度3-甲基吲哚的msm培养基中，在培养后的第24h、第48h、第72h、第96h、第120h和第144h分别采集培养液，测定培养液中吲哚浓度。msm培养基中3-甲基吲哚初始浓度分别为65.58mg/l、131.17mg/l、196.75mg/l、262.34mg/l、327.92mg/l。

3-甲基吲哚的降解率如图6所示。从图中可以看出，在含低浓度吲哚的培养体系中(吲哚浓度65.58mg/l)，72h内吲哚的降解率可达到97％以上；随着吲哚浓度的增加，吲哚降解率开始下降，当吲哚浓度达到196.75mg/l时，72h内的降解率保持在57％以上，144h的降解率保持在85％以上；在吲哚水平较高的环境下(吲哚浓度≥262.34mg/l)，吲哚浓度下降速度极为缓慢；当吲哚浓度达到327.92mg/l，吲哚的降解率不明显。

本实施例中所用的acinetobactertownerinta1-2a表现出了较高的吲哚耐受性，在吲哚浓度不超过196.75mg/l的情况下吲哚降解率始终保持在85.98％以上。

实施例3、acinetobactertownerinta1-2a在降解粪便中吲哚的应用

菌株在实验室条件下，能够很好降解培养基中的吲哚，但实际应用当中，环境极其复杂、影响因素众多，该菌能否在粪便中发挥主导作用，以及对粪便的耐受程度，直接关系到其应用前景。为此，发明人就该菌株降解粪便中吲哚的效果进行了验证。

称取鸡新鲜粪样4kg放入20l的塑料桶中，将实施例1培养得到的acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浮液按体积百分含量5％的接种量与塑料桶中的粪便样品充分混匀作为实验组，以无菌水接种作为空白对照。将塑料桶用6层保鲜膜密封，于室温(18-25℃))下放置8天，分别于第二天、第四天、第六天和第八天取样测定其中吲哚含量。

吲哚含量的测定方法同实施例2。

结果如图7所示，空白对照组中3-mi的2d降解率为1.32％，8d降解率为41.32％。与空白对照组相比，接种5％acinetobactertownerinta1-2a菌体悬浮液的实验组在粪便堆放期间能够有效降解粪便中吲哚含量，在第4d时吲哚降解率最高可达90.19％，表明菌株acinetobactertownerinta1-2a对外界复杂环境有良好的适应性，易于发挥优势作用。随时间的延长吲哚降解率呈先升高后降低的趋势。

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一株具有吲哚降解能力的不动杆菌nta1-2a及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1406

<212>dna

<213>不动杆菌（acinetobactertowneri）

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