本申请属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法。
背景技术：
玫烟色棒束孢(isariafumosoroseawize)是一种重要的虫生真菌，属子囊菌亚门(ascomycota)，粪壳菌纲(sordariomycetes)，肉座菌目(hypocreales)，虫草菌科(cordycipitaceae)，棒束孢属(isaria)。该菌分布广，广泛存在于热带、亚热带和温带地区，而且致病力强，易培养且对人及环境无毒，不易产生抗药性等特点，长期以来是害虫综合防治措施研究和筛选中的重要内容。目前该菌种作为一种重要的生防真菌，已用于防治同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目、鳞翅目、膜翅目等多种害虫。
随着生物防治的日益发展，病原微生物的生产规模向制剂化及其商业化方向发展。用于商品化的真菌制剂多数以分生孢子作为害虫的感染源，但是不同地理环境条件及不同寄主来源的昆虫病原真菌菌株具有一定的地理特异性及寄主专化性，导致其产孢量与致病性均存在明显差异，直接影响其杀虫效果。因此，筛选适合的产孢条件是昆虫病原真菌菌株筛选及利用的基础和保障。目前的研究中，有关玫烟色棒束孢在实验室内培养及产孢研究有相关研究报道，但对于规模化产孢技术尚未见研究报道。
虫生真菌作为一类重要的天敌生物资源，因其选择性高、寄主范围广、安全性好、对生态系统影响小、不易产生抗药性、易于生产、防治效果持久和稳定等诸多优点始终倍受人们的关注。就目前来看，虫生真菌在生产与应用方面仍存在一些问题：例如虫生真菌存在着菌种退化问题。如何维持优良菌株的特性，保持稳定的高产孢率和高毒力一直是工业生产中的关键。依靠自然筛选和诱变育种获得高毒力菌种资源已远远满足不了实际生产的需求，今后原生质体融合技术和基因工程技术将是遗传育种的方向之一。同时，应进一步研究菌种毒力退化机制，加强研究引起菌株变异的分子生物学和生物化学基础以及影响基因表达的因素，以进一步寻找保持菌株稳定性的有效途径；在其资源的开发上，存在着剂型单一，种类少的问题。由于害虫的种类繁多，各自的生物学特性不一，对环境的要求也不相同，同时虫生真菌的施用效果受环境中的温湿度影响较大，且防治效果较慢，制约了虫生真菌的大规模推广应用。因此，针对性地选择病原真菌进行防治是提高虫害防治效果的关键。而现有的虫生真菌种类和剂型仍然满足不了对防治不同地区不同害虫的需要；即使是目前最为先进的液固两相工艺，在孢子生产过程中也存在着规模小、机械化程度低、不易扩大生产、物耗浪费严重等诸多缺点，限制了真菌杀虫剂在科研与生产方面的发展，使虫生真菌以及其他微生物农药的生产难于产业化，大都只停留在作坊式的简单化生产水平上。以上这些问题相互影响，共同制约着虫生真菌的生产技术，使其难以推广与应用。
技术实现要素：
本申请提供一种玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，用以克服现有玫烟色棒束孢固体发酵工艺中的不足，提供一种产孢量大、孢子含量高、孢子萌发率高的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法。
本申请公开的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，包括以下步骤：
步骤一、对玫烟色棒束孢wswl21837菌株进行活化：采用萨氏培养基，于25±1℃、光照条件为16l:8d的培养箱中恒温培养15d；
步骤二、制备一级液体菌种：采用蛋白胨含量为2.5g/l、酵母粉含量为2.5g/l、葡萄糖含量为10.0g/l、ph为6.5的1/4萨氏培养液，每5块菌饼置于100ml萨氏培养液中，然后置于25℃、光照条件为16l:8d、转速为200rpm/min的恒温摇床中培养3d，制得一级液体菌种，将每300ml菌液存放于容积为500ml的锥形瓶中；所述菌饼为利用直径为15mm的打孔器将经萨氏培养基活化后的菌落制成的直径为15mm，厚度为5mm的菌饼；
步骤三、制备二级液体菌种：在摇床转速为100rpm/min条件下，采用蛋白胨含量为2.5g/l、酵母粉含量为2.5g/l、葡萄糖含量为10.0g/l、ph为6.5的1/4萨氏培养液，将制得的每5瓶一级液体菌种和200l萨氏培养液加入发酵罐中发酵，发酵温度环境在26-28℃之间，罐压在0.02-0.03mpa之间；发酵的前16-24h保持摇床转速范围为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min；整个发酵过程培养3d，制得二级液体菌种；
步骤四、进行固体发酵培养：采用无菌麦麸作为培养基质，无菌食用菌单口菌种袋作为产孢容器，以无盖塑料框作为乘载容器，无菌食用菌单口菌种袋的长、宽、高分别为：350mm、105mm、200mm，无盖塑料框的长、宽、高分别为350mm、250mm、100mm，每个菌种袋装固相麦麸基质0.5kg，采用液-固双相法，按照接种量固相麦麸基质：菌液＝1g：3.75ml的比例进行接种，之后平铺到塑料框中，放到培养架上进行培养，四周用经过灭菌处理的白色湿润棉布包围，保持相对湿度在90％以上、温度为25℃的密闭环境中培养3-4d；待菌丝长满整个培养基质且表面出现孢子后，将固体培养基反扣于培养架上进行开放式培养，在相对湿度为85％、温度为27℃的环境中继续培养4-5d，整个培养过程光照条件为l:d＝24:0；
步骤五、对孢子粉进行干燥与收集：待固体培养基内、外部均布满玫烟色分生孢子后即停止产孢培养，将产孢盘置于30℃的温度环境中烘干处理72h，然后采用振荡筛收集孢子粉。
如上所述的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，其中，在步骤五后还包括：
步骤六，对孢子粉质量进行评价：以每克固相麦麸基质产孢子粉的量、孢子粉含孢量、每克固相麦麸基质产孢数、孢子粉含水量、孢子萌发率作为评价指标，对孢子粉质量进行评价。
如上所述的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，其中，固相麦麸基质的制备方法为：
将经20目筛子初筛后的麦麸在蒸馏水中浸泡，待其含水量达35％之后沥去多余水分，添加kno3和食用油，每100g物料添加0.4gkno3和5ml食用油，充分混匀后进行高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后即得待装入产孢容器的固相麦麸基质。
本发明提供的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法具有以下优点：
1、本发明采用液-固双相法进行发酵生产玫烟色棒束孢wswl21837的分生孢子，全部发酵培养周期在20天左右，收获的孢子粉产量与质量均非常高，能够为玫烟色棒束孢大规模生产提供依据，为其产业化应用奠定基础。
2、本发明选用麦麸作为固体培养基质，在灭菌前首先进行初筛，选择20目的筛子去除麦麸中的细小杂质，其目的在于减少发酵过程中的污染来源；同时选择较大的麸皮，在孢子粉收集的时候可以避免细小杂质在孢子粉中的掺杂数量，以提高孢子粉纯度。通过不同接种量的比对，最终确定最佳接种量为麦麸(g)：菌液(ml)＝1：3.75。
3、采用食用菌单口菌种袋作为发酵容器进行玫烟色棒束孢的固相发酵生产，结合真菌发酵特点，利用菌包进行发酵生产，既能提高通气量促进菌株生长，又能减少基质与外界接触的面积，减少污染。同时可以充分使用发酵室空间。该方法综合性好，系统性强等特点，可在玫烟色棒束孢的大规模生产中应用。
具体实施方式
以下将详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
我国是一个农业大国，作物种类多，害虫的危害严重，但化学农药的大量使用，高残留、抗药性、污染环境、安全性差等一系列问题越来越突出。为寻求可持续的害虫防治新途径，虫生真菌是一类十分重要的控制因子，以其生产方便、成本低廉、使用安全、无残毒、可扩散流行和害虫不易产生抗药性等特点，已成为世界各国竞相发展的高科技之一，同时也是绿色减灾的最重要途径之一。虫生真菌可以侵染各类昆虫和昆虫的各个发育阶段，不少能大量产孢并扩散流行，因而在ipm中有其独到的作用。本发明以此为切入点，以2018年3月在云南省西双版纳自然保护区内采集分离的玫烟色棒束孢wswl21837菌株为对象，对其固体发酵工艺展开研究，筛选出适于该菌株扩大产孢的培养基种类及培养条件，为该菌株的开发利用提供理论依据。
本申请公开的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，包括以下步骤：
步骤一、对玫烟色棒束孢wswl21837菌株进行活化：采用萨氏培养基，于25±1℃、光照条件为16l:8d的培养箱中恒温培养15d；
步骤二、制备一级液体菌种：采用蛋白胨含量为2.5g/l、酵母粉含量为2.5g/l、葡萄糖含量为10.0g/l、ph为6.5的1/4萨氏培养液，每5块菌饼置于100ml萨氏培养液中，然后置于25℃、光照条件为16l:8d、转速为200rpm/min的恒温摇床中培养3d，制得一级液体菌种，将每300ml菌液存放于容积为500ml的锥形瓶中；所述菌饼为利用直径为15mm的打孔器将经萨氏培养基活化后的菌落制成的直径为15mm,厚度为5mm的的菌饼；
步骤三、制备二级液体菌种：在摇床转速为100rpm/min条件下，采用蛋白胨含量为2.5g/l、酵母粉含量为2.5g/l、葡萄糖含量为10.0g/l、ph为6.5的1/4萨氏培养液，将制得的每5瓶一级液体菌种和200l萨氏培养液加入发酵罐中发酵，发酵温度环境在26-28℃之间，罐压在0.02-0.03mpa之间；发酵的前16-24h保持摇床转速范围为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min；整个发酵过程培养3d，制得二级液体菌种；
步骤四、进行固体发酵培养：采用无菌麦麸作为培养基质，无菌食用菌单口菌种袋作为产孢容器，以无盖塑料框作为乘载容器，无菌食用菌单口菌种袋的长、宽、高分别为：350mm、105mm、200mm，无盖塑料框的长、宽、高分别为350mm、250mm、100mm，每个菌种袋装固相麦麸基质0.5kg，采用液-固双相法，按照接种量固相麦麸基质：菌液＝1g：3.75ml的比例进行接种，之后平铺到塑料框中，放到培养架上进行培养，四周用经过灭菌处理的白色湿润棉布包围，保持相对湿度在90％以上、温度为25℃的密闭环境中培养3-4d；待菌丝长满整个培养基质且表面出现孢子后，将固体培养基反扣于培养架上进行开放式培养，在相对湿度为85％、温度为27℃的环境中继续培养4-5d，整个培养过程光照条件为l:d＝24:0；
步骤五、对孢子粉进行干燥与收集：待固体培养基内、外部均布满玫烟色分生孢子后即停止产孢培养，将产孢盘置于30℃的温度环境中烘干处理72h，然后采用振荡筛收集孢子粉。
如上所述的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，其中，在步骤五后还包括：
步骤六，对孢子粉质量进行评价：以每克固相麦麸基质产孢子粉的量、孢子粉含孢量、每克固相麦麸基质产孢数、孢子粉含水量、孢子萌发率作为评价指标，对孢子粉质量进行评价。
如上所述的玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法，其中，固相麦麸基质的制备方法为：
将经20目筛子初筛后的麦麸在蒸馏水中浸泡，待其含水量达35％之后沥去多余水分，添加kno3和食用油，每100g物料添加0.4gkno3和5ml食用油，充分混匀后进行高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后即得待装入产孢容器的固相麦麸基质。
实施例1
玫烟色棒束孢wswl21837菌株液体发酵液制备，具体步骤如下：
(1)采用平板划线法将菌株接种于sday培养基上，并置于25±1℃、光照条件16l:8d的培养箱中恒温培养15d。
(2)制备液体培养基。配置100ml的1/4sdy培养液作为发酵液，置于500ml锥形瓶中，每100ml培养液中包含蛋白胨0.25g，酵母粉0.25g和葡萄糖1.00g，ph为6.5。置于121℃、0.1mpa条件下高压灭菌15min，冷却至室温备用。
(3)将步骤一中活化后的玫烟色棒束孢wswl21837，利用直径为15mm的灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔5处，将菌块置于培养液中，置于转速200rpm/min、25℃、光照条件16l:8d的条件下恒温培养3d。作为一级菌种。
(4)发酵罐、物料灭菌消毒。发酵罐的主要规格参数见表1，发酵罐的主要性能参数见表2。首先将种子罐、发酵罐在121℃、0.1mpa条件下进行空罐灭菌1h，冷却至室温；发酵罐外表用75％酒精进行擦拭灭菌。灭菌期间按照1/4sdy培养液配制发酵培养液。首先将称重后的培养液成分溶解于少量无菌水中，测定其ph为5.5。随后在500l发酵罐中添加无菌水，再将配好的发酵培养液通过物料口加入罐中，最终用无菌水将罐内液体体积添至200l。用10％hcl、naoh最终将其ph调节到6.5及以下。于121℃、0.1mpa条件下高温灭菌1h。待灭菌结束后冷却至室温后添加菌液。
表1发酵罐主要规格参数表
表2发酵罐主要性能参数表
(5)接种与发酵培养。以500ml的锥形瓶中存放300ml一级菌液为标准，在低转速条件下，将菌液加入发酵罐中，每罐接种4-5瓶。发酵温度在26-28℃之间，罐压在0.02-0.03mpa之间。发酵前期(发酵至溶氧迅速下降期间，一般16-24h保持转速范围为50rpm/min，发酵中期逐渐提高转速到100rpm/min。整个过程培养3d。作为二级菌种。
实施例2
玫烟色棒束孢wswl21837菌株固体发酵培养。
2.1固相产孢培养基准备与灭菌
采用无菌食用菌单口菌种袋(空袋长、宽、高分别为350mm、105mm、200mm)作为产孢容器，以无盖塑料框(长、宽、高分别为350mm、250mm、100mm)作为乘载容器，利用75％酒精进行表面消毒备用。固体培养基质选用20目筛子初筛后的麦麸。首先将其在蒸馏水中浸泡，待其含水量达35％之后沥去多余水分，添加kno3和食用油，每100g物料添加0.4gkno3和5ml食用油，充分混匀后进行高压蒸汽灭菌30min，冷却至室温后即得待装入产孢容器的固相麦麸基质，每袋装0.5kg。
2.2固相接种产孢
接种前先用75％酒精将接种室地面喷湿除菌，发酵液现接现用，其余发酵液接种过程中存放在发酵罐中，不用旋转但要保压，最迟3d之内用完。接种量采用麦麸(g)：菌液(ml)＝1：3.75的比例进行接种，以液体不外渗为宜。之后平铺到塑料盘中，放到培养架上，四周用灭菌白色湿润棉布包围，保持相对湿度。
培养前期3-4d属于菌丝生长阶段，要求低温高湿密闭培养，温度和湿度分别为25℃、90％以上；待菌丝长满整个培养基质且表面出现孢子后，将固体培养基轻轻反扣于培养架上进行开放式培养，要求高温低湿，温度和湿度分别要求为27℃和85％。继续培养4-5d。整个培养过程光照条件为l:d＝24:0。
2.3结果分析
接种后每隔12h观察一次，每天两次定时观察记录孢子在麦麸上的生长与颜色变化情况，待目标菌开始在基质上定殖后，每天观察一次。整个培养过程中定时取样，以检测相同质量的固体发酵基质表面、中间、底部各部位的产孢数量来衡量产孢量高低。菌株在麦麸固相基质上的不同位置其产孢量存在明显差异，在固体基质上从中间开始产孢，在麦麸中央从第8天到第10天其产孢量均达到最高，达到5.28×106孢子/g，其次是基质下层的产孢量，为3.89×106孢子/g，而上部最少。从第12天开始，麦麸的上、下层其产孢量开始增多，均高于基质中间的产孢量，且上层的产孢量极显著高于下层，到第18天上层产孢量达5.64×107孢子/g，下层产孢量达1.47×107孢子/g，而中央的产孢量仅有8.83×106孢子/g。固体培养基单位面积产孢量见表3。
表3固体培养基单位面积产孢量表
实施例3
玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉干燥收集与质量评价
3.1孢子粉干燥与收集
待固体培养基内、外部均布满玫烟色分生孢子后即停止产孢培养进行干燥处理。将产孢盘置于28-30℃烘干后采用振荡筛收集孢子粉。
3.2孢子粉质量评价
3.2.1每克基质产粉量测定
分别对产孢基质(g)以及收集到的孢子粉(mg)进行称重，计算每克基质产粉量。
3.2.2孢子粉产孢量测定
准确称取上述孢子粉0.1g，装入盛有100ml，0.01％tween-80无菌水的锥形瓶内，于28℃、180rpm/min震荡30min，用血球计数板计数，如果孢子浓度过高，适当稀释，直到在光学显微镜(40×)下能清楚看到单个孢子为止。每个处理重复5次，计算孢子粉含孢量。
3.2.3每克基质产孢数测定
每克基质产孢数计算公式为：每克基质产孢数＝每克基质产粉量×每克孢子粉含孢量。
3.2.4孢子粉含水量测定
先将200ml锥形瓶在120℃干燥箱内烘干至恒重。准确称取0.3g上述孢子粉于锥形瓶内，至于120℃干燥箱内烘干至恒重。冷却至室温后称重。每个样品重复测定三次。计算孢子粉的含水量。
3.2.5孢子萌发率测定
准确称取收集好的孢子粉0.1g，装入盛有100ml，0.01％tween-80无菌水的锥形瓶内，将其稀释10倍，制成培养液，备用。培养皿中垫3层湿润滤纸，保持相对湿润。用毛刷将未凝固的sday培养基均匀涂布在载玻片上，晾干。用移液枪将孢子悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，放入垫有3层滤纸的培养皿中，置于25℃、光照为l:d＝16:8的培养箱中。每隔12h观察一次，检测孢子萌发，计算孢子萌发率。
3.3试验分析
在麦麸培养基上，玫烟色棒束孢wswl21837菌株的每克基质产粉量可达50.73mg/g；其每克孢子粉含孢量为2.06×108孢子/g；每克基质产孢数可达为9.92×109孢子/g；孢子含水量为23.72％。从孢子萌发率来看，孢子活性较高，到第60h其累计萌发率可达98.00％。
表4不同培养基对玫烟色棒束孢wswl21837产孢的影响
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。