一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及疾病检测辅助领域，特别是一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。可以感染人的四种疟原虫，含恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(plasmodiumovale)及间日疟原虫(plasmodiumvivax)。此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。非洲每年因疟疾需花费高达上百亿美元，且每年至使其国内生产总值出现减缓。疟疾会导致生产力损失，使得社会陷入更深的贫困和对投资和旅游业造成负面影响。此外，由于疟疾对于五岁龄以下儿童的高死亡率，对社会结构也造成了较大的影响。在许多疟疾流行的国家，快速和准确地诊断疟疾成为一项挑战。据世界卫生组织统计，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例死亡。在疟原虫属的四个种中，恶性疟原虫引起的疟疾危险度最高，死亡率最高，因此必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟原虫种中将其区分出来。另外，大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述疟原虫的混合感染；这些混合感染经常难以被检测到或被低估。混合感染检测的失败会导致治疗不全面，以及可能会导致更为严重的疾病。因此，急需开发一种在疟疾流行区简便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。目前疟疾诊断的金标准是血涂片的显微镜检。如果疟原虫密度很高，这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定疾病发展的阶段和感染种属。然而，当疟原虫密度较低的时，该方法则比较繁琐，需要训练良好的专家，并且可能导致治疗上的延误。在一些无法开展标准实验室诊断的地区，为提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验。然而，该类产品的灵敏度有较大波动，并且只有针对恶性疟原虫的种特异性的产品。且当寄生虫密度较低、在混合感染期间、在药物治疗之后或在感染慢性期过程中的情形下需要较长的观察时间和通过显微镜检来验证诊断。因此，这种状况可导致假阴性结果或不可靠的诊断。此外，还有针对的疟原虫18srdna的巢式pcr检测，由于疟原虫基因组的富含at，使得该检测方法所需引物设计较为复杂，特异性较低且该方法需进行两轮扩增反应，操作较为繁琐。总之，上述常用的疟疾诊断方法，存在检测的情况有限、操作比较繁琐、需要训练良好的专家或无法检测出疟原虫种属差异等问题；市场需要一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒，本发明解决这样的问题。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，本发明的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对p.v、p.f、p.o、p.m四种疟原虫进行准确分型；本发明以疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，相较于18srrna拷贝数更多，且cox3基因为线粒体基因，其免疫压力更小、突变率更低，从而本发明具有更高的特异性和灵敏度。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，包括：含有混合引物的pcr反应液i，含有分型探针的pcr反应液ⅱ，taq/ung酶混合液，含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；混合引物包括：用于扩增p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增hbb基因的引物序列；分型探针包括：用于分型鉴定p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定hbb基因的探针序列。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，pcr反应液i包括：水；10×pcrbuffer；1-25mmmg离子；1-25mmdntps；1-100μmp.vcox3基因上游引物vf：seq.id.no:1，ccttacgtactctagctttta；1-100μmp.vcox3基因下游引物vr：seq.id.no:2，gagttctttttctattcagaataa；1-50μmp.vcox3基因探针vp：seq.id.no:9，caatattattgtctatactagatactatagtt；1-100μmp.fcox3基因上游引物ff：seq.id.no:3，ccttacgtactctagctatga；1-100μmp.fcox3基因下游引物fr：seq.id.no:4，gagttcttattctattcagaataa；1-50μmp.fcox3基因探针fp：seq.id.no:10，caattgtctattcgtacaattattcatatatatattt；1-50μm人hbb基因上游引物if：seq.id.no:13，gaaagtgctcggtgcctttagt；1-50μm人hbb基因下游引物ir：seq.id.no:14，cagctcactcagtgtggcaaag；1-25μm人hbb基因探针ip：seq.id.no:15，atggcctggctcacctggacaacc。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，探针的末端使用荧光基团标记；p.vcox3基因探针vp的末端采用荧光集团标记，标记物为：fam-bhq1；mp.fcox3基因探针fp的末端采用荧光集团标记，标记物为：joe-bhq2；人hbb基因探针ip的末端采用荧光集团标记，标记物为：rox-bhq2。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，pcr反应液ⅱ包括：水；10×pcrbuffer；1-25mmmg离子；1-25mmdntps；1-100μmp.ocox3基因上游引物of：seq.id.no:5，ccttacgtactctagctattt；1-100μmp.ocox3基因下游引物or：seq.id.no:6，gagttcttattctattctgaataa；1-50μmp.ocox3基因探针op：seq.id.no:11，caaacataatatcgtcaaatataagtactttattc；1-100μmp.mcox3基因上游引物mf：seq.id.no:7，ccttacgtactctagctttgt；1-100μmp.mcox3基因下游引物mr：seq.id.no:8，gagttcctattctattcagaataa；1-50μmp.mcox3基因探针mp：seq.id.no:12，caaattaattcgtctacattagatactatattt；1-50μm人hbb基因上游引物if：seq.id.no:13，gaaagtgctcggtgcctttagt；1-50μm人hbb基因下游引物ir：seq.id.no:14，cagctcactcagtgtggcaaag；1-25μm人hbb基因探针ip：seq.id.no:15，atggcctggctcacctggacaacc。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，p.ocox3基因探针op的末端采用荧光集团标记，标记物为：fam-bhq1；mp.mcox3基因探针mp的末端采用荧光集团标记，标记物为：joe-bhq2；人hbb基因探针ip的末端采用荧光集团标记，标记物为：rox-bhq2。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，taq/ung酶混合液包括：热启动dna聚合酶，尿嘧啶dna糖基化酶。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，阳性对照包括：含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的混合液，bsa的te缓冲液。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的制备过程为：将p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列和人hbb基因特定区域序列插入puc18克隆载体得到重组质粒puc18-p.v-cox3、puc18-p.f-cox3、puc18-p.o-cox3、puc18-p.m-cox3、puc18-hbb；p.vcox3基因扩增序列5'-3'：tttttccttacgtactctagcttttaacacaatattattgtctatactagatactatagttgaaacaggacatatacatatattcattattctgaatagaaaaagaactctataaa；p.fcox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctatgaacacaattgtctattcgtacaattattcatatatatatttgaaacaggacatacatgttcatttattctgaatagaataagaactctataaat；p.ocox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctatttacacaaacataatatcgtcaaatataagtactttattcgaaacaggacatatatgttacattattcagaatagaataagaactctataaataa；p.mcox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctttgtacacaaattaattcgtctacattagatactatatttgaaacaggacatatatgttcaattattctgaatagaataggaactctataaataa；人hbb基因扩增序列5'-3'：ggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggtacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagc。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，阴性对照包括：含有bsa的te缓冲液。一种疟原虫核酸分型检测试剂盒的使用方法，包括：步骤一，样本的采集和保存取样edta抗凝人外周血，再通过全血dna提取试剂盒提取疟原虫dna；步骤二，建立疟原虫核酸分型检测反应体系，阴性对照，含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照；在试剂盒的反应管i内放入的反应体系包括：在试剂盒的反应管ⅱ内放入的反应体系包括：混合引物包括：用于扩增p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增hbb基因的引物序列；所述分型探针包括：用于分型鉴定p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定hbb基因的探针序列；步骤三，建立疟原虫核酸分型检测pcr反应程序；pcr反应程序如下：95℃5min，95℃10sec，40cycles，60℃40sec，40cycles；收集标记物；步骤四，本试剂盒在阴性对照和阳性对照成立的前提下，根据以下条件进行结果判定：若疟原虫特异性探针对应的检验样本无明显的扩增曲线，且检测不到ct值时，hbb基因探针对应的检测通道有明显的扩增曲线，且ct≤30，则判断样品为阴性；若hbb基因探针对应的检测通道无明显的扩增曲线，且检测不到ct值时，则样本核酸提取失败，需重新制备样本；若pcr反应液i对应的反应管检测出fam通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.v阳性；若pcr反应液i对应的反应管检测出joe通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.f阳性；若pcr反应液ⅱ对应的反应管检测出fam通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.o阳性；若pcr反应液ⅱ对应的反应管检测出joe通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.m阳性；若某种属疟原虫探针对应的检测样本的ct值大于35且小于40，则判断该样本处于检测灰区，应重新检测；若重做结果仍有明显扩增曲线，则判断为种属疟原虫阳性，否则为阴性。本发明的有益之处在于：试剂盒以疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，相较于18srrna拷贝数更多，且cox3基因为线粒体基因，其免疫压力更小、突变率更低，从而本发明具有更高的特异性和灵敏度；利用不同荧光标记的探针，采用同一样本进行2管pcr扩增的方法，能样本中的疟原虫进行检测并对p.v、p.f、p.o、p.m四种疟原虫进行准确分型，检测出4种疟原虫核酸和人hbb，从而确定种属，与现有其他疟原虫检测试剂盒相比，具有更高的特异性和灵敏度，操作简便，无需专业培训；可检测混合感染。附图说明图1是本发明的阳性样本在pcr反应液i中的扩增曲线，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值；图2是本发明的阳性样本在pcr反应液ⅱ中的扩增曲线，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值；图3是本发明的阴性样本在pcr反应液i中的扩增曲线，其中，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值；图4是本发明的阴性样本在pcr反应液ⅱ中的扩增曲线，其中，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，包括：含有混合引物的pcr反应液i，含有分型探针的pcr反应液ⅱ，taq/ung酶混合液，含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；pcr反应液i包括：水；10×pcrbuffer；1-25mmmg离子；1-25mmdntps；1-100μmp.vcox3基因上游引物vf：seq.id.no:1，ccttacgtactctagctttta；1-100μmp.vcox3基因下游引物vr：seq.id.no:2，gagttctttttctattcagaataa；1-50μmp.vcox3基因探针vp：seq.id.no:9，caatattattgtctatactagatactatagtt；1-100μmp.fcox3基因上游引物ff：seq.id.no:3，ccttacgtactctagctatga；1-100μmp.fcox3基因下游引物fr：seq.id.no:4，gagttcttattctattcagaataa；1-50μmp.fcox3基因探针fp：seq.id.no:10，caattgtctattcgtacaattattcatatatatattt；1-50μm人hbb基因上游引物if：seq.id.no:13，gaaagtgctcggtgcctttagt；1-50μm人hbb基因下游引物ir：seq.id.no:14，cagctcactcagtgtggcaaag；1-25μm人hbb基因探针ip：seq.id.no:15，atggcctggctcacctggacaacc。探针的末端使用荧光基团标记；p.vcox3基因探针vp的末端采用荧光集团标记，标记物为：fam-bhq1；mp.fcox3基因探针fp的末端采用荧光集团标记，标记物为：joe-bhq2；人hbb基因探针ip的末端采用荧光集团标记，标记物为：rox-bhq2。pcr反应液ⅱ包括：水；10×pcrbuffer；1-25mmmg离子；1-25mmdntps；1-100μmp.ocox3基因上游引物of：seq.id.no:5，ccttacgtactctagctattt；1-100μmp.ocox3基因下游引物or：seq.id.no:6，gagttcttattctattctgaataa；1-50μmp.ocox3基因探针op：seq.id.no:11，caaacataatatcgtcaaatataagtactttattc；1-100μmp.mcox3基因上游引物mf：seq.id.no:7，ccttacgtactctagctttgt；1-100μmp.mcox3基因下游引物mr：seq.id.no:8，gagttcctattctattcagaataa；1-50μmp.mcox3基因探针mp：seq.id.no:12，caaattaattcgtctacattagatactatattt；1-50μm人hbb基因上游引物if：seq.id.no:13，gaaagtgctcggtgcctttagt；1-50μm人hbb基因下游引物ir：seq.id.no:14，cagctcactcagtgtggcaaag；1-25μm人hbb基因探针ip：seq.id.no:15，atggcctggctcacctggacaacc。探针的末端使用荧光基团标记；p.ocox3基因探针op的末端采用荧光集团标记，标记物为：fam-bhq1；mp.mcox3基因探针mp的末端采用荧光集团标记，标记物为：joe-bhq2；人hbb基因探针ip的末端采用荧光集团标记，标记物为：rox-bhq2。作为一种优选，taq/ung酶混合液包括：热启动dna聚合酶，尿嘧啶dna糖基化酶。阳性对照包括：含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的混合液，bsa的te缓冲液。含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的制备过程为：将p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列和人hbb基因特定区域序列插入puc18克隆载体得到重组质粒puc18-p.v-cox3、puc18-p.f-cox3、puc18-p.o-cox3、puc18-p.m-cox3、puc18-hbb；p.vcox3基因扩增序列5'-3'：tttttccttacgtactctagcttttaacacaatattattgtctatactagatactatagttgaaacaggacatatacatatattcattattctgaatagaaaaagaactctataaa；p.fcox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctatgaacacaattgtctattcgtacaattattcatatatatatttgaaacaggacatacatgttcatttattctgaatagaataagaactctataaat；p.ocox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctatttacacaaacataatatcgtcaaatataagtactttattcgaaacaggacatatatgttacattattcagaatagaataagaactctataaataa；p.mcox3基因扩增序列5'-3'：tttccttttccttacgtactctagctttgtacacaaattaattcgtctacattagatactatatttgaaacaggacatatatgttcaattattctgaatagaataggaactctataaataa；人hbb基因扩增序列5'-3'：ggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggtacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagc。阴性对照包括：含有bsa的te缓冲液。一种疟原虫核酸分型检测试剂盒的使用方法，包括：步骤一，样本的采集和保存取样edta抗凝人外周血，再通过全血dna提取试剂盒(qiaampdnabloodextractionminikit)提取疟原虫dna；提取的总dna于-20℃低温保存。全血dna提取试剂盒的使用方法为：(1)在1.5ml离心管底加入20μl蛋白酶k。(2)加200μl血样至离心管中，如果样本不足200μl，用pbs补齐。(3)加200μl缓冲液al至离心管中，脉冲振荡15s混匀。(4)56℃孵育10min。(5)短暂离心。(6)加入200μl无水乙醇，脉冲振荡15s混匀。短暂离心。(7)将第六步的混合液吸至过滤柱上，6000g离心1min。将过滤柱置于干净的收集管上。(8)打开过滤柱盖子，加入500μl洗液aw1，盖上盖子，6000g离心1min。将过滤柱置于干净的收集管上。(9)打开过滤柱盖子，加入500μl洗液aw2，盖上盖子，20000g离心3min。将过滤柱置于干净的收集管上。(10)20000g离心1min.(11)将过滤柱置于1.5ml离心管上，打开盖子，加入200μl缓冲液ae或无菌双蒸水，室温放置1min，6000g离心1min。(12)洗脱下来的液体即为疟疾的dna。步骤二，建立疟原虫核酸分型检测反应体系，阴性对照，含有p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照；△疟原虫核酸分型检测试剂盒的组成下表所示：其中，pcr反应液i中各组分的终浓度为1×pcrbuffer、p.vcox3基因、p.fcox3基因、hbb基因引物各100nm、p.vcox3基因、p.fcox3基因、hbb基因探针各50nm、dntps(0.4mmdatp、0.4mmdgtp、0.4mmdctp、0.4mmdttp)、4mmmgcl2；其中，pcr反应液ⅱ中各组分的终浓度为1×pcrbuffer、p.ocox3基因、p.mcox3基因、hbb基因引物各100nm、p.ocox3基因、p.mcox3基因、hbb基因探针各50nm、dntps(0.4mmdatp、0.4mmdgtp、0.4mmdctp、0.4mmdttp)、4mmmgcl2；其中，taq/ung酶混合液为终浓度1u热启动dna聚合酶和0.5u尿嘧啶dna糖基化酶。在试剂盒的反应管i内放入的反应体系包括：pcr反应液i8ultaq/ung酶混合液1.5uldna模板3ul水12.5ul在试剂盒的反应管ⅱ内放入的反应体系包括：pcr反应液ⅱ8ultaq/ung酶混合液1.5uldna模板3ul水12.5ul△引物探针制备：以p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定的保守区域的设计引物；p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定的多态性区域设计探针，其末端使用两种不同荧光基团标记；以人hbb基因序列设计引物和探针，其末端使用区别于分型探针的其他荧光基团标记。△对照品制备将p.v、p.f、p.o、p.m线粒体cox3基因特定区域序列和人hbb基因特定区域序列插入puc18克隆载体得到重组质粒puc18-p.v-cox3、puc18-p.f-cox3、puc18-p.o-cox3、puc18-p.m-cox3、puc18-hbb。a.p.vcox3基因扩增序列(5'-3'):tttttccttacgtactctagcttttaacacaatattattgtctatactagatactatagttgaaacaggacatatacatatattcattattctgaatagaaaaagaactctataaab.p.fcox3基因扩增序列(5'-3'):tttccttttccttacgtactctagctatgaacacaattgtctattcgtacaattattcatatatatatttgaaacaggacatacatgttcatttattctgaatagaataagaactctataaatc.p.ocox3基因扩增序列(5'-3'):tttccttttccttacgtactctagctatttacacaaacataatatcgtcaaatataagtactttattcgaaacaggacatatatgttacattattcagaatagaataagaactctataaataad.p.mcox3基因扩增序列(5'-3'):tttccttttccttacgtactctagctttgtacacaaattaattcgtctacattagatactatatttgaaacaggacatatatgttcaattattctgaatagaataggaactctataaataae.人hbb基因扩增序列(5'-3'):ggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggtacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagc将重组质粒等比例混合后用含有bsa的te缓冲液逐级稀释，使其浓度达到200000拷贝/ml，即为阳性对照品。阴性对照为含有bsa(100mg/ul)的te缓冲液(ph8.0)。步骤三，建立疟原虫核酸分型检测pcr反应程序；pcr反应程序如下：60℃收集荧光，荧光检测通道为fam、joe和rox。步骤四，本试剂盒在阴性对照和阳性对照成立的前提下，根据以下条件进行结果判定：若疟原虫特异性探针对应的检验样本无明显的扩增曲线，且检测不到ct值时，hbb基因探针对应的检测通道有明显的扩增曲线，且ct≤30，则判断样品为阴性；若hbb基因探针对应的检测通道无明显的扩增曲线，且检测不到ct值时，则样本核酸提取失败，需重新制备样本；若pcr反应液i对应的反应管检测出fam通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.v阳性；若pcr反应液i对应的反应管检测出joe通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.f阳性；若pcr反应液ⅱ对应的反应管检测出fam通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.o阳性；若pcr反应液ⅱ对应的反应管检测出joe通道有明显的扩增曲线，且ct≤30则p.m阳性；若某种属疟原虫探针对应的检测样本的ct值大于35且小于40，则判断该样本处于检测灰区，应重新检测；若重做结果仍有明显扩增曲线，则判断为种属疟原虫阳性，否则为阴性。为了证明本发明具有高度的特异性和检测灵敏度，做试剂盒与镜检的对比试验：对40份血样采用上文实施例的方法进行检测，与镜检结果进行对比，详见下表：注：加粗字体表示镜检结果与荧光pcr检测结果不一致。结果分析：分析上述实验结果可知，当疟原虫数量较多时，荧光pcr法与镜检法结果完全一致；当疟原虫数量较少或存在多种疟原虫混合感染时，荧光pcr法仍可检测出疟原虫的存在且可特异性分型检测。由此可见荧光pcr法检测的特异性和灵敏度要高于传统的镜检。图1、2是本发明的阳性样本在pcr反应液i和pcr反应液ⅱ中的扩增曲线，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值；图3、4是本发明的阴性样本在pcr反应液i和pcr反应液ⅱ中的扩增曲线，其中，横坐标为pcr循环数，纵坐标为荧光值。由图可知，本发明可特异性的分型检出疟原虫感染，且存在内部质控，有效减少了假阴性结果的出现。本发明提供一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，本发明的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对p.v、p.f、p.o、p.m四种疟原虫进行准确分型；本发明以疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，相较于18srrna拷贝数更多，且cox3基因为线粒体基因，其免疫压力更小、突变率更低，从而本发明具有更高的特异性和灵敏度。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。序列表<110>合肥欧创基因生物科技有限公司<120>一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法<141>2018-11-15<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>1ccttacgtactctagctttta21<210>2<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>2gagttctttttctattcagaataa24<210>3<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>3ccttacgtactctagctatga21<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>4gagttcttattctattcagaataa24<210>5<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>5ccttacgtactctagctattt21<210>6<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>6gagttcttattctattctgaataa24<210>7<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>7ccttacgtactctagctttgt21<210>8<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>8gagttcctattctattcagaataa24<210>9<211>32<212>dna<213>artificialsequence<400>9caatattattgtctatactagatactatagtt32<210>10<211>37<212>dna<213>artificialsequence<400>10caattgtctattcgtacaattattcatatatatattt37<210>11<211>35<212>dna<213>artificialsequence<400>11caaacataatatcgtcaaatataagtactttattc35<210>12<211>33<212>dna<213>artificialsequence<400>12caaattaattcgtctacattagatactatattt33<210>13<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>13gaaagtgctcggtgcctttagt22<210>14<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>14cagctcactcagtgtggcaaag22<210>15<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>15atggcctggctcacctggacaacc24<210>16<211>116<212>dna<213>artificialsequence<400>16tttttccttacgtactctagcttttaacacaatattattgtctatactagatactatagt60tgaaacaggacatatacatatattcattattctgaatagaaaaagaactctataaa116<210>17<211>123<212>dna<213>artificialsequence<400>17tttccttttccttacgtactctagctatgaacacaattgtctattcgtacaattattcat60atatatatttgaaacaggacatacatgttcatttattctgaatagaataagaactctata120aat123<210>18<211>123<212>dna<213>artificialsequence<400>18tttccttttccttacgtactctagctatttacacaaacataatatcgtcaaatataagta60ctttattcgaaacaggacatatatgttacattattcagaatagaataagaactctataaa120taa123<210>19<211>121<212>dna<213>artificialsequence<400>19tttccttttccttacgtactctagctttgtacacaaattaattcgtctacattagatact60atatttgaaacaggacatatatgttcaattattctgaatagaataggaactctataaata120a121<210>20<211>104<212>dna<213>artificialsequence<400>20ggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctcacctggacaacct60caagggtacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagc104当前第1页12