RIPOR3在制备用于乳腺癌检测和治疗的生物制品中的应用的制作方法

本发明涉及肿瘤分子生物学
技术领域：
，具体涉及ripor3在制备用于乳腺癌检测和治疗的生物制品中的应用。
背景技术：
：乳腺癌已成为世界上女性中发病率最高的肿瘤，严重影响女性的生命健康。尽管筛查方案和辅助疗法的发展取得了成功，但相当大比例的乳腺癌患者死于癌症转移。与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症；每年中国乳腺癌新发数量占全球的12.2％，死亡数量占全球的9.6％。90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多，城市地区尤为显著。乳腺癌诊治的关键在于早发现、早诊断和早治疗。癌基因的激活，或者抑癌基因的失活在肿瘤发生发展过程中起着关键作用。随着大规模、高通量测序技术的推广应用，发现新的癌基因和抑癌基因不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶点奠定基础。fam65蛋白家族包括成员fam65a(也称为rho家族相互作用细胞极化调节蛋白1)，fam65b(也称为rho家族相互作用细胞极化调节蛋白2)和fam65c(也称为rho家族相互作用细胞极化调节蛋白3，即rhofamily-interactingcellpolarizationregulator3,ripor3)。已显示fam65a定位于足细胞主要过程和肾细胞体。fam65b在肌细胞分化期间早期下调，并且以两种长和短的同种型发生，其在不同组织中差异表达。fam65c(ripor3)似乎也发生在两种同种型中，通过可变剪接产生。ripor3基因位于染色体20的nc_000020.11位置，ripor3的参考包括ncbi(genbank)参考序列转录变体1(nm_080829.3)及其编码的较短蛋白同种型1(np_543019.2)；以及ncbi(genbank)参考序列转录变体2(nm_001290268.1)及其编码的具有更长n-末端的较长蛋白同种型2(np_001277197.1)，与变体1相比该变体2在5'utr中不同并且使用替代的上游aug。目前，关于ripor3基因或蛋白在乳腺癌中的作用机制尚不清楚，其功能和表达变化的临床意义尚未有报道。因此，分析ripor3基因与乳腺癌发生发展的关系，探索针对ripor3途径的肿瘤治疗和预警策略至关重要。技术实现要素：为解决上述问题，本发明一个目的是提供乳腺癌分子标记物ripor3在制备用于乳腺癌检测、预后或治疗的生物制品中的应用，其中所述分子标记物为ripor3基因或蛋白，其具有ncbi数据库的基因id:140876所示人ripor3的nm_001290268.1或np_001277197.1所示序列。如本发明所用，术语ripor3(rho家族相互作用的细胞极化调节蛋白3)是指人ripor3基因或蛋白、或其同源物、或具有其生物活性的变体形式。本发明采用rt-pcr方法检测了ripor3基因在人乳腺癌组织和癌旁组织中的表达，并验证了ripor3基因在乳腺癌组织或乳腺癌细胞中表达下调。如本发明所用，术语“表达下调”是指所表达基因的序列量测量证明，相对于癌旁正常乳腺组织或健康人乳腺组织，所检测的患者乳腺癌组织中测量的该基因表达量具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如乳腺癌组织中该基因表达量为正常乳腺组织中的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或更低。本发明一个方面提供了分子标记物ripor3在制备用于乳腺癌检测或预后的试剂盒中的应用，在一些实施方案中，所述ripor3为人ripor3。在本发明的一些实施方案中，所述检测或预后为根据所检测对象的生物样本中的ripor3表达水平来判断对象中乳腺癌的疾病状况、进行疗效评估或转移复发监控，优选所述生物学样本为乳腺癌组织或乳腺癌细胞。本发明另一个方面提供了用于乳腺癌检测或预后的试剂盒，其包含特异性扩增人ripor3基因的引物对，其中正向引物为如seqidno.1所示的序列，反向引物为如seqidno.2所示的序列；另外，用于扩增内参gapdh的引物对为如seqidno.3所示的正向引物和如seqidno.4所示的反向引物。进一步地，所述试剂盒还包括rna提取试剂、反转录试剂，以及pcr反应常用试剂如逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、depc水和taq酶等，还可以含有标准品和/或对照品。本发明又一个方面提供了ripor3或其类似物或激动剂在制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物中的应用，其中所述类似物或激动剂为具有ripor3生物活性的其变体形式。在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物包括有效量的ripor3或其类似物或激动剂和药学上可接受的载体，进一步地所述药物组合物还包括预防或治疗乳腺癌的其他药剂。如本文所用，所述“有效量”是指可对哺乳动物(优选人)产生功能或活性的且可被哺乳动物(优选人)所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂；所述载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。所述合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。所述药物组合物中的药学上可接受的载体可含有液体如水、盐水、缓冲液，并且还可能存在辅助性物质如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述载体中还可以含有细胞(如宿主细胞)转染试剂。本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将ripor3蛋白、其类似物或激动剂、或其编码基因、或其药物组合物施用于患者如哺乳动物，优选人。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。也可选择采用基因治疗的手段进行乳腺癌的治疗，如直接将ripor3、其类似物或激动剂通过诸如注射等方法施用于患者；或者，可通过一定的途径将携带ripor3、其类似物或激动剂的表达单位如表达载体或病毒等递送到靶点上，并使之表达具有活性的ripor3、其类似物或激动剂，具体情况需视所述的药剂类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种促进ripor3基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的药物组合物中的化疗剂，包括但不限于：dna-烷化剂、抗肿瘤抗生素剂、抗代谢剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、hmg-coa抑制剂、cdk抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三链螺旋dna、核酸适体和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解乳腺癌生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检测标志物来评估，所述标志物为一个或多个基因。预后评估可以这样进行：根据标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是否良好，或者确定良好预后或不良预后的概率。本发明的药物组合物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要活性成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。有益效果：本发明人发现分子标记物ripor3在患者的乳腺癌组织中相对于在癌旁组织中表达明显下调，因此可以将ripor3用作乳腺癌辅助诊断和预后的标志物，以及制备用于乳腺癌检测和/或治疗的生物制品。本发明提供的用于检测乳腺癌的试剂盒，可以用于乳腺癌的辅助诊断和预后评估；另外本发明提供的治疗乳腺癌的药物组合物也可用于乳腺癌的基因治疗、药物治疗等临床应用。附图说明图1所示为ripor3在乳腺癌组织和癌旁组织中的相对表达量比较，其中相对于正常的癌旁组织，ripor3在乳腺癌组织中的表达水平明显下调。图2所示为ripor3在乳腺癌细胞系mcf-7、mda-mb-453中的相对表达量明显低于其在乳腺正常上皮细胞系mcf-10a中的相对表达量。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1本实施例证明，ripor3在患者乳腺癌组织样本中的含量明显低于其在癌旁组织样本中的含量。1、取样取2013年10月到2017年12月期间在北京大学深圳医院外科手术中获得乳腺癌癌旁组织和乳腺癌组织各50例，所有标本均经病理学检查证实，编号后置-80℃低温冰箱保存。提取rna用来做实时荧光定量pcr。所有病人均书面告知，标本收集均经北京大学生物医学伦理审查委员会同意。2、对组织样本进行总rna提取采用reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本rna提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入depc处理过的水溶解沉淀；⑥用nanodrop2000紫外分光光度计测量rna纯度及浓度，冻存于-80℃。rna质量判定标准：rna样本的od260/od280值为1.7-2.2之间；总rna电泳图谱有清晰的28s、18s条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。3、逆转录合成cdna采用iiireversetranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cdna反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆反录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样本取1μg总rna作为模板rna。获得的cdna保存放-20℃冰箱备用。4、rt-pcr用abi7500型荧光定量pcr仪，采用2-δδct法进行数据相对定量分析。采用在线引物设计软件，基因序列参照ncbi：ripor3(基因id:140876,nm_001290268.1)，内参选gapdh，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：表1：引物序列操作过程如下：表2：rt-pcr反应体系反应体系：用powergreenpcrmastermix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，tm退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，具体tm参照表1。样本rt-pcr检测：将各样本cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。实验结果显示，实时定量pcr扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬存在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qrt-pcr的相对定量公式：2-δδct×100％，比较基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qrt-pcr扩增结果稳定，如图1所示，ripor3基因在乳腺癌组织中的相对表达量明显低于其在癌旁组织中的相对表达量，并且该差异具有统计学意义(p<0.05)；这表明ripor3在患者的乳腺癌组织中表达下调。实施例2ripor3在乳腺癌细胞系中的表达情况首先，培养人乳腺癌细胞系mcf-7、mda-mb-453和乳腺正常上皮细胞系mcf-10a，其中，mda-mb-453培养于10％胎牛血清的l15培养基中，mcf-7和正常乳腺上皮细胞系mcf-10a培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中。培养液中加入1％p/s(青霉素-链霉素混合溶液)。在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。然后，使用qiagen的细胞rna提取试剂盒提取细胞中的总rna并测定其浓度，具体操作和qpcr具体步骤同实施例1。实验按照重复3次来完成，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析，乳腺癌细胞系与正常乳腺细胞系的配对比较采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。如图2所示的结果表明，ripor3基因在乳腺癌细胞系mcf-7、mda-mb-453中的相对表达量明显低于其在乳腺正常上皮细胞系mcf-10a中的相对表达量，该差异具有统计学意义(p<0.05)。实施例3ripor3基因在乳腺癌细胞中的过表达1、细胞培养人乳腺癌细胞系mda-mb-453，以含10％fbs和1％p/s的l15培养基在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×105个/孔，加入l15细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。2、基因过表达载体的构建根据人ripor3基因的cdna序列合成特异性pcr扩增引物，在5’端引物和3’端引物分别添加hindiii和xhoi两个限制性酶切位点。以乳腺癌患者血液提取和反转录得到的cdna作为扩增模板，上述cdna序列经限制性内切酶hindiii和xhoi双酶切后插入到经hindiii和xhoi双酶切的真核细胞表达载体pcdna3.1中，连接获得的重组载体pcdna3.1-1用于后续实验。3、转染将实验分为三组：对照组(mda-mb-453)、阴性对照组(pcdna3.1-nc)和实验组(pcdna3.1-1)，使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。4、qpcr检测ripor3基因的水平1)细胞总rna的提取利用qiagen细胞提取试剂盒提取细胞中的总rna，具体操作详见说明书。2)qpcr扩增具体步骤同实施例1。5、统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，ripor3基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。6、结果结果与对照组相比，实验组中mda-mb-453细胞的ripor3基因表达水平显著增加，并且该差异具有统计学意义(p<0.05)。实施例4ripor3基因对乳腺癌细胞增殖的影响采用cck-8实验检测ripor3基因对乳腺癌细胞增殖能力影响。1、mda-mb-453细胞培养与转染步骤同实施例3，转染后6h换液，放置细胞培养箱过夜。2、胰酶消化细胞，加入l15细胞培养基混匀使细胞悬浮，进行细胞计数。3、96孔板中进行接种，3000个/孔，接种8个复孔。共铺4块96孔板分别用于24h、48h、72h和96h4个检测时间点。。4、24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入10μl的cck-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据。5、在48h、72h、96h后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。6、统计学分析实验都是按照重复3次来完成的，采用spss18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。7、结果结果与对照相比，实验组在转染pcdna3.1-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，并且该差异具有统计学意义(p<0.05)，说明ripor3与乳腺癌的细胞增殖相关，并且ripor3过表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖。实施例5乳腺癌检测或预后评估试剂盒基于实施例1中表1的引物组，组装本发明所述的用于检测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增人ripor3基因的引物对(seqidno:1所示的正向引物和seqidno:2所示的反向引物)和特异扩增管家基因(gapdh)的引物对(seqidno:3的正向引物和seqidno:4所示的反向引物)；还包括sybrgreen聚合酶链式反应体系，如pcr缓冲液、sybrgreen荧光染料、dntps。所述pcr缓冲液的成分为25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4；还包括乳腺正常组织cdna：作为阴性对照与待检测样本cdna共同定量pcr检测，每个反应体系使用与检测样本cdna相同量。优选pcr反应体系如表3所示：表3pcr反应体系组分加入量sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl上游引物(10μm)0.5μl下游引物(10μm)0.5μl模板cdna2.0μl加入灭菌蒸馏水至25μl最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京大学深圳医院（北京大学深圳临床医学院）<120>ripor3在制备用于乳腺癌检测和治疗的生物制品中的应用<130>p18033<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gacactgacaagcaatcggc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgataatgcagccgggactc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aatgggcagccgttaggaaa20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcgcccaatacgaccaaatc20当前第1页12