与种子重量调控相关的大豆蛋白GmUBCa及其相关生物材料的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域中与种子重量调控相关的大豆蛋白gmubca及其相关生物材料的应用。

背景技术：

大豆是重要传统作物，蕴含丰富营养价值，是提供粮油和饲料的重要经济作物，在工业生产中大豆油也有很多用途，例如生物燃料，表面活性剂，软化剂等。中国曾是世界最大的大豆生产国，然而，近年来，我国大豆生产只占需求的四分之一，致使中国成为全球最大的大豆进口国，进口总额为全球大豆总出口量的一半。大豆生产远远落后于国内其他粮食作物发展的步伐，不能满足国民需要。近50年来，大豆生产仅增长了62％，而其他粮食作物已增长了5倍以上。因此提高大豆单产已成为目前亟待解决的问题。

种子的重量(粒重)是作物生产中的一个重要指标，是影响作物产量的重要农艺性状之一。植物可以通过增加粒重来达到增产的目的。

大豆产量由株型、结荚率、荚粒数、种子百粒重等因素组成,其中粒重是遗传力最高的因素。粒重对产量的影响不限于豆科植物，对其它单双子叶植物也是产量潜力的重要因素，因此成为作物品种选育过程中要考虑的重要选择性状。已有的研究表明，粒重受栽培环境和遗传的影响。在正常的栽培条件下，遗传，也即相关基因起重要作用。因此与千粒重相关的分子机制的研究成为热点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何提高种子植物的粒重。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了种子植物粒重相关蛋白及其相关生物材料。

本发明所提供的种子植物粒重相关蛋白，名称为gmubca，来源于大豆(glycinemax(l.)merrill)，是下述a1)或a2)或a3)的蛋白质：

a1)氨基酸序列如seqidno.2所示的蛋白质；

a2)在seqidno.2所示的蛋白质的羧基末端或/和氨基末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)或a2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与种子植物粒重相关的蛋白质；

所述生物材料为下述b1)至b5)中任一种：

b1)编码所述gmubca的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b5)所述gmubca基因的分子标记。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，所述gmubca可来源于大豆。

上述蛋白质中，seqidno.2(序列表中的序列2)由个148个氨基酸残基组成。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

上述生物材料中，b1)中编码所述gmubca的核酸分子可为gmubca基因(gmubca)。所述gmubca基因可为编码序列是seqidno.1(序列表中序列1)所示的dna分子。

其中，seqidno.1由447个核苷酸组成，其编码序列是seqidno.1的第1-447位核苷酸，编码seqidno.2所示的蛋白质。

上述生物材料中，b2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达gmubca的dna，该dna不但可包括启动gmubca基因转录的启动子，还可包括终止gmubca转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i⁹⁸⁵)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。

上述生物材料中，可用植物表达载体构建含有所述gmubca基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用gmubca构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一种应用：

u1、所述gmubca或所述生物材料在制备调控种子植物粒重产品中的应用。

u2、所述gmubca或所述生物材料在植物育种中的应用。

u3、所述gmubca或所述生物材料在培育高粒重种子植物中的应用。

u4、所述gmubca或所述生物材料在制备培育高粒重种子植物产品中的应用。

上述应用中，u2具体可为将含有所述gmubca或所述生物材料(如gmubca基因)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述两种方法：

m1、一种培育高粒重种子植物的方法，包括提高目的种子植物中所述gmubca或其编码基因的表达量，得到高粒重种子植物；所述高粒重种子植物的粒重高于所述目的种子植物的粒重。

m2、一种培育高粒重的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入所述gmubca的编码基因，得到粒重高于所述受体种子植物粒重的转基因种子植物。

上述方法中，所述编码基因可为编码序列为序列表中序列1所示的dna分子。

上述m2中，向受体种子植物中导入所述gmubca的编码基因可通过携带有本发明gmubca的植物表达载体导入受体种子植物中。携带有本发明gmubca的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

携带有本发明gmubca的植物表达载体可为pgwb411-gmubca。pgwb411-gmubca是将序列表中序列1所示的dna分子重组到载体pgwb411中得到的gmubca基因表达载体。

上文中，所述种子植物、植物、目的种子植物和受体种子植物均可为双子叶植物，如十字花科植物。

本发明的实验证明，将gmubca基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥种子的粒重显著高于野生型拟南芥(野生型拟南芥对照、gmubca过表达株系oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26的种子千粒重分别为14.7±1.8,19.5±0.2,17.4±0.5,16.8±1.1、18.2±0.5,21.8±0.7和17.3±1.5毫克)，说明gmubca及其编码基因可以调控植物种子的粒重，过表达后提高了植物种子粒重。gmubca及其相关生物材料可用于提高作物产量，培育高产品种。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为gmubca在大豆各器官中的表达特性。

图2为克隆载体的物理图谱。

图3为植物表达载体pgwb411–gmubca的结构示意图。

图4为gmubca过表达拟南芥纯系的分子鉴定。

图5为gmubca转基因株系和对照种子千粒重比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的hn44为大豆黑农44(满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：cna20020216.2，审定号为：黑审豆2002003)

下述实施例中的表达载体pgwb411(tsuyoshinakagawa,etal.,gatwayvectorsforplanttransformation,plantbiotechnology,2009,26,275-284)由tsuyoshinakagawa博士提供，公众经tsuyoshinakagawa博士同意后可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌gv3101(leecw等，agrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinarabidopsisthaliana,plantcell,2009,21(9),2948-62)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、来源于大豆的与种子粒重相关蛋白质gmubca基因(gmubca)的cdna克隆和植物表达载体的构建

本发明的发明人在进行大豆种子发育过程转录组分析时获得一个高表达基因gmubca。对该基因的功能进行了检测。gmubca在大豆花中的转录量最高，其次是种子和根，在苗和荚中转录量很低，叶中转录量极低(图1)。

提取hn44幼苗的总rna，将rna用逆转录酶反转录合成cdna。

根据在plantgdb的大豆基因组序列及测定的hn44基因组序列中gmubca全长cdna序列的信息，设计引物，引物序列如下：

gmubca-up：5’-atggcctccaagcggatt

gmubca-dp：5’-ctagcccattgcatacttctgagtc

以hn44cdna为模板，用gmubca-up和gmubca-dp为引物，进行pcr扩增,得到约0.5kb的pcr产物。经过测序，该pcr产物为447bp,具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸所示的基因为gmubca，gmubca的编码序列是序列表中的序列1，该基因编码的蛋白为gmubca，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

基因克隆使用invitrogen公司提供的gateway系统，载体3′-t突出端，用于直接连接taq酶扩增的pcr产物。运用ta克隆的原理将上述gmubca的pcr产物连接在克隆载体上(图2)，得到重组载体ptopo-gmubca。ptopo-gmubca和表达载体pgwb411上均带有重组位点attl1和attl2，含有gmubca的ptopo-gmubca与表达载体pgwb411在重组酶的作用下进行lr重组反应，最终将目的基因gmubca成功构建到表达载体pgwb411上，将得到的重组载体命名为pgwb411-gmubca(图3)。pgwb411-gmubca是将序列表中序列1所示的dna分子重组到表达载体pgwb411中得到的gmubca基因表达载体。

实施例2、gmubca过表达拟南芥的获得

一、重组农杆菌的获得

将实施例1中得到的含有gmubca的重组载体pgwb411-gmubca用电击法导入农杆菌gv3101得到含有pgwb411-gmubca的重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌

gv3101/gmubca。

二、转gmubca拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌gv3101/gmubca培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)(种子来自arabidopsisbiologicalresourcecenter(abrc))中,经培育后收获种子(t1代)，将种子播于含卡那霉素(50mg/l)的ms筛选培养基上，待筛选得到的t1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获t1代单株，各单株种子(t2代)分别播种，用相同的ms筛选培养基继续筛选以观察t2代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，获得18个转gmubca拟南芥纯系(t5代)。随机取18个株系中的名称为oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26这6个株系进行gmubca基因表达量的检测。分别提取上述这6个株系和哥伦比亚生态型拟南芥(col-0，作为野生型拟南芥对照，简称对照)的幼苗总rna，进行反转录，分别以反转录得到的cdna作为模板，引物为：gmubca-up：5’-atggcctccaagcggatt和gmubca-dp：5’-ctagcccattgcatacttctgagtc，进行realtime-pcr鉴定。拟南芥atactin2基因为内标，所用引物为primer-tf：5’-atgcccagaagtcttgttcc，和primer-tr：5’-tgctcatacggtcagcgata-3’。以内标atactin2基因的表达量为1，测定gmubca基因的相对表达量。实验重复三次，结果取平均值。oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26中gmubca的相对表达量分别为0.17、0.28、0.18、0.47、0.16和0.25，在野生型拟南芥对照中未能检测出gmubca的表达量(图4)。

上述结果进一步证明，gmubca转入拟南芥中，且得到表达。oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26这6个株系为gmubca过表达株系。

三、转gmubca基因拟南芥的表型分析

首先检测了对照和oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26这6个gmubca过表达株系在正常条件下的表型。在正常条件下，对照和gmubca过表达株系的表型如莲座、株高等均与对照没有显著差异。

测量了野生型拟南芥对照、gmubca过表达株系oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26的种子千粒重，即彻底干燥的种子千粒重。

每个株系取20株的种子，每个株系称量200粒种子,生物学实验重复三次，结果取平均值±标准差。

结果如图5所示，野生型拟南芥对照、gmubca过表达株系oe2、oe5、oe9、oe20、oe25和oe26的种子千粒重分别为14.7±1.8,19.5±0.2,17.4±0.5,16.8±1.1、18.2±0.5,21.8±0.7和17.3±1.5毫克。

结果表明，6个gmubca过表达转基因株系种子千粒重显著或极显著高于野生型对照(图5)。图5中，*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异；**表示与野生型拟南芥相比，具有极显著差异。

上述实验表明，gmubca的过量表达提高了转基因植株种子千粒重，并且其在提高转基因植株种子重量(粒重)的同时，不影响植株的正常生长。因此该基因可作为提高植物种子产量的目的基因。gmubca是与种子重量相关的蛋白质。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>与种子重量调控相关的大豆蛋白gmubca及其相关生物材料的应用

<130>gncfh182209

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>447

<212>dna

<213>大豆属大豆（glycinemax(l.)merrill）

<400>1

atggcctccaagcggattctgaaggagcttaaggacctccagaaagaccctccaacctct60

tgcagcgccggtcctgtagcggaagatatgtttcattggcaagcgactataatgggtccc120

cctgatagcccttatgctgggggtgtttttctagttactattcattttcctccggattat180

ccattcaagccacccaaggttgcatttaggactaaagttttccacccaaatatcaacagc240

aatggtagtatttgtcttgatatcttaaaggagcagtggagccccgccttgacaatatct300

aaggttttgctctccatttgctccctattgacggatccaaacccagatgatcccttggtg360

cctgaaattgctcatatgtacaagacagacaggtccaagtatgagacaactgctaggagc420

tggactcagaagtatgcaatgggctag447

<210>2

<211>148

<212>prt

<213>大豆属大豆（glycinemax(l.)merrill）

<400>2

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151015

proprothrsercysseralaglyprovalalagluaspmetphehis

202530

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354045

valpheleuvalthrilehispheproproasptyrprophelyspro

505560

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asnglyserilecysleuaspileleulysgluglntrpserproala

859095

leuthrileserlysvalleuleuserilecysserleuleuthrasp

100105110

proasnproaspaspproleuvalprogluilealahismettyrlys

115120125

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tyralametgly

145