一种减毒的重组人4型腺病毒的制作方法

本发明涉及一种减毒的重组人4型腺病毒。

背景技术：

腺病毒是二十面体对称，无包膜的双链dna病毒。腺病毒分为a-g七组，其中人4型腺病毒had4为e组的唯一一种腺病毒，主要引发急性呼吸道感染和肺炎。从进化上分析4型腺病毒来源于人b组腺病毒和黑猩猩腺病毒的人畜共患病的基因组重组事件，因此4型腺病毒不存在先天免疫的情况，比较适合作为疫苗和治疗载体。

在腺病毒的复制过程中，反向末端重复区(invertedterminalrepeatregion，itr区)起了重要作用，itr区是病毒包装所需要的重要顺式作用元件。腺病毒双链dna的每条单链的5′端有ptp蛋白结合，ptp通过其ser-oh与dna5′端的dcmp5′磷酸之间形成磷酸二脂键。腺病毒的dna复制首先是以5′端结合有ptp的dcmp作为引物，以3′端的itr区为模板，进行链置换合成，置换出的单链分子可以自我退火环化，形成锅柄样环形分子，然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链dna分子。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种减毒的重组人4型腺病毒。

本发明首先保护一种重组腺病毒，其特征在于：与人4型腺病毒的基因组dna相比，重组腺病毒的基因组dna仅发生了如下两个突变：第1至8位核苷酸由“ctatctat”突变为了“catcatca”，第35983-35990位核苷酸由“atagatag”突变为了“tgatgatg”。所述人4型腺病毒为ri67株。

本发明还保护一种重组腺病毒，其特征在于：与genbank:ay594253.1的序列相比，重组腺病毒的基因组dna仅发生了如下两个突变：第1至8位核苷酸由“ctatctat”突变为了“catcatca”，第35983-35990位核苷酸由“atagatag”突变为了“tgatgatg”。

本发明还保护一种对腺病毒进行减毒的方法，包括如下步骤：将腺病毒基因组dna中5’末端的“ctatctat”突变为“catcatca”，并且，将3’末端的“atagatag”突变为“tgatgatg”。所述腺病毒为人4型腺病毒。所述人4型腺病毒为ri67株。

本发明还保护一种制备重组腺病毒的方法，包括如下步骤：将出发腺病毒基因组dna中5’末端的“ctatctat”突变为“catcatca”，并且，将3’末端的“atagatag”突变为“tgatgatg”，得到与出发腺病毒相比毒性减弱的重组腺病毒。所述出发腺病毒为人4型腺病毒。所述出发腺病毒为人4型腺病毒ri67株。

本发明还保护一种dna分子，其特征在于：与genbank:ay594253.1的序列相比，所述特异dna分子仅发生了如下两个突变：第1至8位核苷酸由“ctatctat”突变为了“catcatca”，第35983-35990位核苷酸由“atagatag”突变为了“tgatgatg”。

本发明还保护一种重组质粒，如序列表的序列1所示。

本发明还保护一种重组腺病毒，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备突变后的腺病毒dna；

(2)将突变后的腺病毒dna转染宿主细胞，培养后得到重组腺病毒。

制备突变后的腺病毒dna的方法具体如下：线性化后的所述重组质粒与出发腺病毒的基因组dna共同导入宿主菌，重组后得到突变后的腺病毒dna。所述宿主菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌bj5183，更具体为大肠杆菌bj5183电转感受态细胞。所述出发腺病毒为人4型腺病毒。所述出发腺病毒为人4型腺病毒ri67株。所述线性化后的重组质粒具体可通过如下方法制备：为用限制性内切酶hindiii酶切所述重组质粒，然后使用碱性磷酸酶cip去除线性化质粒5’末端的磷酸基团。

所述宿主细胞具体可为293t细胞。

与人4型腺病毒ri67株相比，本发明提供的重组腺病毒生长速率降低，对细胞的毒性减弱，具有减毒效果。本发明提供的重组人4型腺病毒具有以下应用空间：可以作为基因载体表达多种外源基因；可应用于腺病毒疫苗的研发；可利用该载体表达其他病原体抗原研制多种疫苗；用于生物学研究的示踪系统。

附图说明

图1为p1代病毒液感染293t细胞培养24-48h时的细胞形态。

图2为p2代病毒液基因组dna进行5k、10k、25k位置的pcr检测的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为westernblot鉴定腺病毒六邻体蛋白的图。

图4为重组腺病毒的形态观察的照片。

图5为生长速率的结果。

图6为对细胞的毒性检测的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有数据均经过统计学分析，计算平均值及标准差。数据的显著性用统计软件prism5.0分析。组间比较分析用anova检验。p值小于0.05被认为具有显著性差异。质粒pbr322：addgene。人4型腺病毒ri67株：atccvr-1572。cck-8细胞增殖检测试剂盒：美国promega公司。腺病毒滴度测定的方法(壳蛋白免疫染色法)参见文献：bewigb&schmidtwe(2000)acceleratedtiteringofadenoviruses.biotechniques28(5):870-873.。

实施例1、重组腺病毒的制备

一、构建重组质粒

1、提取人4型腺病毒ri67株的基因组dna。

2、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用4vru和4vrd组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。

4vru：

4vrd：

4vru中，单下划线为hindiii识别序列。

4vrd中，单下划线为sphi识别序列，双下划线为asisi识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列，斜体为目标突变部分。

3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶hindiii和sphi进行双酶切，回收酶切产物。

4、取质粒pbr322，用限制性内切酶hindiii和sphi进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。

6、以步骤1提取的基因组dna为模板，采用4vlu和4vld组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。

4vlu：

4vld：

4vlu中，单下划线为ecori识别序列，双下划线为asisi识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列，斜体为目标突变部分。

4vld中，单下划线为hindiii识别序列，粗体为与病毒基因组中对应的序列。

7、取步骤6得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收酶切产物。

8、取步骤5得到的重组质粒，用限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收载体骨架。

9、将步骤7的酶切产物和步骤8的载体骨架连接，得到重组质粒，将其命名为穿梭质粒pbr4vad4lr。经测序，穿梭质粒pbr4vad4lr为序列表的序列1所示的环形质粒。

二、制备重组病毒

1、提取人4型腺病毒ri67株的基因组dna。

2、取穿梭质粒pbr4vad4lr，用限制性内切酶hindiii进行酶切以进行线性化，然后使用碱性磷酸酶cip去除线性化质粒5’末端的磷酸基团，然后回收线性化质粒。

3、取预冷的0.1ml电击杯，加入50ng步骤2得到的线性化质粒、500ng步骤1得到的基因组dna和40μl大肠杆菌bj5183电转感受态细胞，使用bio-radgenepulser电转仪，按1.8kv、25μf、200ohms条件电穿孔转化。电击后立即加入1ml预先在37℃水浴锅中预热的液体lb培养液，37℃、180rpm振荡培养1h。然后取100μl菌液涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的固体lb培养基平板，筛选阳性单克隆，扩大培养后进行鉴定。鉴定方法：提取基因组dna，进行asisi酶切，释放出pbr322载体骨架和约36kb的腺病毒dna，对腺病毒dna进行测序验证。结果表明，得到了突变后的腺病毒dna。与野生型腺病毒dna(genbank:ay594253.1，linearvrl03-feb-2005)相比，突变后的腺病毒dna仅发生了如下两个突变：第1至8位核苷酸由“ctatctat”突变为了“catcatca”，第35983-35990位核苷酸由“atagatag”突变为了“tgatgatg”。

4、取步骤3得到的突变后的腺病毒dna，借助转染试剂lipo3000转染293t细胞，然后培养5-7天，然后进行反复冻融，然后12000rpm离心10min，收集上清(即为p0代病毒液)；将p0代病毒液感染293t细胞，然后培养5天，收集上清(即为p1代病毒液)；将p1代病毒液感染293t细胞，培养5天后，收集上清(即为p2代病毒液)；连续按照上述步骤进行传代，得到p3代病毒液、p4代病毒液和p5代病毒液。步骤4得到的病毒命名为ad4itrmut重组腺病毒。

5、用“步骤1得到的人4型腺病毒ri67株的基因组dna”代替“突变后的腺病毒dna”，按照步骤4进行操作。步骤5得到的病毒命名为ad4腺病毒(野生型的ad4腺病毒)。

p1代病毒液感染293t细胞培养24-48h时的细胞形态见图1。ad4itrmut重组腺病毒培养24-48h时细胞已出现典型cpe，与野生型的ad4腺病毒诱导293t细胞产生的cpe相比两者无明显差别。

p2代病毒液提取基因组dna，进行5k、10k、25k位置的pcr检测，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。5ksense：5'-gcgaactcttcaaccctg-3’；5kanti：5'-atccaatcccacctctacc-3'。10ksense：5'-ctcctcttcatccactaacatc-3’；10kanti：5'-gcctatttcaacttcatcacc-3’。25ksense：5'-ccgctatgagcaaagaaat-3'；25kanti：5'-aggtcgcaaacccagtg-3'。结果见图2。图2中，1对应ad4腺病毒，2对应ad4itrmut重组腺病毒。ad4itrmut重组腺病毒和野生型的ad4腺病毒条带一致，没有发生片段缺失。

ad4itrmut重组腺病毒的p2代病毒液，提取基因组dna，进行末端测序，与理论末端一致。

取ad4itrmut重组腺病毒的p1代病毒液、p2代病毒液、p3代病毒液、p4代病毒液和p5代病毒液，利用鼠抗六邻体抗血清a7nh做westernblot鉴定腺病毒六邻体蛋白。将野生型的ad4腺病毒为阳性对照，转染空白为阴性对照。结果见图3。图3中，pc代表阳性对照，nc代表阴性对照，p1至p5依次代表p1代病毒液至p5代病毒液。在83kda和175kda蛋白条带之间有一条带，与4型腺病毒104kda的六邻体蛋白大小一致。首次转染后即可检出较多的hexon蛋白，随着传代次数的增加，条带浓度越来越高，表明重组腺病毒在293t细胞内已开始不断大量增殖。

实施例2、重组腺病毒的形态观察

培养a549细胞至融合度达80％～90％，然后感染实施例1制备的ad4itrmut重组腺病毒的p5代病毒液或ad4腺病毒的p5代病毒液，moi＝1，37℃培养至cpe达到80％，然后刮取皿底的细胞，转移到离心管中，室温1000rpm离心10min，弃上清，用pbs缓冲液洗涤沉淀，然后用3％戊二醛溶液4℃固定3h，然后进行超薄切片以及电镜超显微观察。

照片见图4。ad4itrmut重组腺病毒粒子成蜂巢状排列，大小均一，与野生型的ad4腺病毒大小相近。

实施例3、生长速率(一步法测定腺病毒的生长曲线)

供试病毒液为实施例1制备的ad4itrmut重组腺病毒的p5代病毒液或ad4腺病毒的p5代病毒液。

将293t细胞铺12孔板，每孔加入500μl供试病毒液(moi＝1或10)，孵育2小时，然后吸弃上清，用含2％fbs的dmem培养基洗涤细胞两次，然后每孔加入1ml含2％fbs的dmem培养基，从此刻开始计时，分别于0h、24h、48h、72h、96h时间点进行检测。

检测方法：每孔吸取600μl培养上清，剩余的细胞和培养体系转移到新的离心管中，得到离心管1(-80℃保存)；将600μl培养上清转移到离心管中，200rpm离心5min，然后吸取400μl上清到新的离心管，得到离心管2(-80℃保存)；取离心管1，进行三次冻融，然后转移到新的离心管中，12000rpm离心2min，取200μl上清转移到新的离心管中，得到离心管3；将离心管2和离心管3中的液体混合，然后所进行腺病毒滴度测定，然后将每孔的病毒数进行均一化处理(即滴度乘以体积)，绘制腺病毒生长曲线。

结果见图5(五个重复处理的平均值)。不管是moi＝1还是moi＝10，重组腺病毒ad4itrmut较之ad4腺病毒在相同时间段内均显示较慢的复制速率。

实施例4、对细胞的毒性(cck-8法检测腺病毒对细胞的毒性)

a549细胞铺24孔板(5000细胞/孔)，培养2-4h以使细胞贴壁。

ad4itrmut组：以moi＝1的剂量感染实施例1制备的ad4itrmut重组腺病毒的p5代病毒液；ad4组：以moi＝1的剂量感染实施例1制备的ad4腺病毒的p5代病毒液；对照组：不感染病毒的平行细胞对照；每组设置3个复孔。ad4itrmut组和ad4组统称为试验组。

分别于感染时间点0h、24h、48h、72h、96h、120h取细胞，采用cck-8细胞增殖检测试剂盒进行检测。

相对值＝试验组50nm吸光度值/对照组50nm吸光度值。

cck-8对活细胞进行染色，因此相对值越大，表示腺病毒的毒性越低。

结果见图6(五个重复处理的平均值)。ad4itrmut重组腺病毒对细胞的毒性要低于ad4腺病毒，p<0.01。

sequencelisting

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种减毒的重组人4型腺病毒

<130>gncyx182276

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<211>13028

<212>dna

<213>artificialsequence

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