本发明属于烟草制品的安全性生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期影响的方法。
背景技术：
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。加热不燃烧卷烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。
加热非燃烧型卷烟，其特征在于加热烟草而非燃烧烟草，向消费者提供一定的烟草特征感受。加热不燃烧卷烟制品研发人员在产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整，形成最终的产品配方。但初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。
细胞是通过一个过程来完成复制的，这一过程被称为细胞周期(cellcycle)。细胞周期被划分为5个不同的时期：g0期(gap0phase)，指具有分裂的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期；g1期(gap1phase)，dna合成前期，主要合成rna和核糖体；s期，dna合成期(dnasynthsisphase)，除了合成dna外，同时还要合成组蛋白。g2期(gap2phase)，为dna合成后期，是有丝分裂的准备期；m期，细胞分裂期(mitosisphase)，细胞由一个母细胞分裂成为两个子细胞。当细胞内的dna受到损伤时，可通过激活反应通路暂停细胞周期，对损伤的dna进行修复，当损伤不能被修复时可通过诱发凋亡，清除变异细胞。细胞周期的阻滞是先于细胞凋亡和死亡的检测终点，能够更为灵敏的检测到受试物对细胞潜在的作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期影响的方法，其以加热不燃烧卷烟总粒相物作为检测基础，为准确评价加热不燃烧卷烟制品对安全性评估提供有效测定方法。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。
本发明中所使用的rpmi1640细胞培养基购买于市场任何可购买到的商品公司。
一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期影响的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；
mtpm＝m1-m0(1)
式中：
m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；
(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；
表1细胞周期检测加样表
(6)收集细胞：取出步骤(5)中的细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；
(7)细胞固定：在步骤(6)每支离心管中加入1ml4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定2h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液，加入500μl4℃预冷的pbs缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清液，获得细胞；
(8)染色：在步骤(7)每支离心管中加入200μl用pbs配制的染液，避光染色30min，染液中rnase酶的浓度为1mg/ml，碘化丙啶染料的浓度为50μg/ml；
(9)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行dna含量分析。
本发明有益效果：
本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟总粒相物前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期影响的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
实施例1
制备3种(1#、2#、3#)加热不燃烧卷烟用剑桥滤片捕集的总粒相物作为样品，测试其对细胞周期的影响。
具体检测过程，包括以下步骤：
(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；
mtpm＝m1-m0(1)
式中：
m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；
(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至85％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；
表1细胞周期检测加样表
(6)收集细胞：取出步骤(5)中的细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；
(7)细胞固定：在步骤(6)每支离心管中加入1ml4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定2h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液，加入500μl4℃预冷的pbs缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清液，获得细胞；
(8)染色：在步骤(7)每支离心管中加入200μl用pbs配制的染液，避光染色30min，染液中rnase酶的浓度为1mg/ml，碘化丙啶染料的浓度为50μg/ml；
(9)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行dna含量分析。
表2.3加热不燃烧卷烟制品对rpmi2650细胞各期细胞比率的影响
由表2可以看出，加热不燃烧卷烟1#、2#、3#总粒相物样品在检测剂量范围内对rpmi2650细胞g1/g0期、s期、g2/m期细胞无影响。
本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟总粒相物前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为细胞周期试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期影响的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期的影响。