一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法与流程

本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及利用大孔树脂柱层析结合高速逆流色谱（hsccc）技术，从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法。

背景技术：

竹子是禾本科竹亚科多年生植物，在我国具有悠久的食用和药用历史。研究表明，竹叶中含有许多丰富的化学成分，包括黄酮类、酚酸类、多糖、香豆素内酯、蒽醌类、氨基酸、芳香物质和锰、锌、硒等微量元素。其中竹叶黄酮主要以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷等为主，具有抑菌杀菌、消炎、消肿、降血脂以及清除氧自由基等功能。而绿原酸是竹叶的一种主要酚酸成分，也是传统中药金银花、杜仲叶等的重要活性成分之一，具有广泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用；现代科学对绿原酸生物活性的研究和应用已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。因而，开发竹叶提取物中绿原酸的分离纯化方法具有很大的实用价值。

大孔吸附树脂是常用的天然产物分离材料，具有吸附选择好、成本低、操作简便等多方面优点。中国专利申请号200910223926.6的发明专利中，公开了一种hp-20大孔吸附树脂制备竹叶黄酮的方法。

高速逆流色谱（hsccc）是一种基于液-液分配机理的新型色谱分离纯化技术，由于它不用任何固态的支撑物或载体，具有样品回收率高、操作步骤少等优点，特别适合于天然活性单体成分的分离。此前已有应用hsccc分离绿原酸的相关研究报道。中国专利申请号为201010542548.0公开了一种从应用乙酸乙酯-正丁醇-水体系进行hsccc从杜仲叶提取物中得到绿原酸的方法。中国专利申请号为201510316229.0的发明公开了一种从应用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系进行hsccc从十大功劳叶提取物中获得绿原酸的方法。中国专利申请号为201710120670.0的发明公开了一种从应用乙酸乙酯-甲醇-水体系进行hsccc从牛蒡提取物中获得绿原酸的方法。

上述方法虽然能够分别获得竹叶黄酮或绿原酸成分，但是没有针对竹叶提取物的自身特点，开发出一种既能有效利用大孔树脂分离绿原酸和竹叶黄酮，又能利用hsccc高效去除竹叶色素和杂质获得高纯度绿原酸的方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法的技术方案。该方法首先通过优选的大孔树脂分离纯化，有效分离获得绿原酸；然后采用乙酸乙酯-甲醇（或乙腈）-乙酸-水溶剂系统进行hsccc分离，从绿原酸富集物获得中高纯度的绿原酸。该方法能够有效获得绿原酸，同时实现了其与竹叶提取物的竹叶黄酮成分的有效分离。

所述的一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）大孔树脂分离：以竹叶提取物为原料，上样于大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、60%乙醇、95%乙醇洗脱，将上样后未吸附部分和水洗脱部分分别收集，浓缩后分别获得浓缩物a和浓缩物b；经分析，浓缩物a和浓缩物b均含有大量的绿原酸成分（总回收率≥90%），仅含有少量的竹叶总黄酮成分（总回收率≤10%）。将60%乙醇洗脱部分（流分c）收集，浓缩后获得浓缩物c，经分析该富集物中含有大量的竹叶总黄酮（总回收率≥80%）成分，仅含有少量（总回收率≤5%）的绿原酸成分；

2）高速逆流色谱分离：取乙酸乙酯-甲醇或乙腈-乙酸-水两相溶剂体系在hsccc色谱仪中对浓缩物a和浓缩物b进行分离纯化处理，并按照hsccc色谱仪的运行时间自动收集出口处流出液，对流出液进行hplc检测，分别将绿原酸纯度大于90％的收集液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到绿原酸单体；

所述的两相溶剂体系为乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水体积百分比为30～45:5～15:5～15:30～50，或乙酸乙酯∶乙腈∶乙酸∶水体积百分比为30～45:5～15:5～15:30～50，上相为固定相，下相为流动相。

所述的一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法，其特征在于所述的步骤1）中竹叶提取物的浓度为：以提取物干重计5～100mg/ml的水溶液。

所述的一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法，其特征在于所述的步骤1）中大孔吸附树脂型号为d101或xad-7hp。

所述的一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法，其特征在于所述的步骤1）中上样流速为1～4bv/h，上样提取物质量≤1g/g树脂，水的洗脱体积为3～6bv，60%乙醇洗脱体积≥4bv，洗脱流速为1～4bv/h。

所述的一种从竹叶提取物中制备高纯度绿原酸的方法，其特征在于所述的步骤2）中高速逆流色谱分离具体为：取乙酸乙酯-甲醇或乙腈-乙酸-水两相溶剂体系在分液漏斗中配制成混合溶液，取上层为固定相，下层为流动相；以10～20ml/min的速度向hsccc色谱仪中泵入固定相，待管路完全充满固定相后以600～1000rpm转动主机，同时以1～3ml/min的速度泵入流动相，直至流动相流出且在紫外检测器监控显示基线平稳后，取适量溶于流动相的浓缩物a或b用进样器注入hsccc色谱仪，按照运行时间自动收集出口处流出液，对流出液进行hplc检测，分别将绿原酸纯度大于90％的收集液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到绿原酸单体。

本发明能够简便、高效地从竹叶提取物中获得绿原酸化合物，同时实现了其与竹叶提取物的竹叶黄酮成分的有效分离，适用于两者生产制备过程中的小规模或工业化的应用，有助于提高生产的附加值。

附图说明

图1为竹叶提取物的hplc谱图，图中峰1-5分别为绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷；

图2为实施例1大孔分离流分a的hplc图，图中峰1分别为绿原酸；

图3为实施例1大孔分离流分b的hplc图，图中峰1分别为绿原酸；

图4为实施例1大孔分离流分c的hplc图，图中峰1-4分别为异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷；

图5为实施例1中大孔树脂流分a的hsccc分离色谱图，图中峰1分别为收集的绿原酸峰；

图6为绿原酸标准品的hplc色谱图；

图7为实施例1中大孔树脂流分ahsccc分离制得绿原酸的hplc色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

本发明中的竹叶提取物为竹叶经过水提取浓缩后的物质，如图1为该竹叶提取物hplc谱图，图中峰1-5分别为绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷。

实施例1

（1）大孔树脂分离

取冷冻干燥后的竹叶提取物16.8克，用水稀释成的20mg/ml竹叶提取物840ml，以2bv/h流速上样于50gd101大孔吸附树脂（1bv=40ml），然后依次用5bv蒸馏水、4bv60%乙醇、4bv95%乙醇洗脱，洗脱流速为2bv/h。将上样后流出液（流分a）和水洗脱部分（流分b）分别收集，浓缩后分别获得浓缩物a和b；收集60%乙醇洗脱部分（流分c），浓缩获得竹叶黄酮富集物c。图2为大孔分离流分a的hplc图，图中峰1为绿原酸；图3为大孔分离流分b的hplc图，图中峰1分别为绿原酸；图4为实施例1大孔分离流分c的hplc图，图中峰1-4分别为异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷。

实验采用分析竹叶提取液中绿原酸和4种黄酮的液相色谱（hplc）条件为：以岛津c18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为填充剂，以乙腈a为流动相，以含有0.1%甲酸溶液为流动相b，梯度洗脱时间程序为：0～10分钟流动相a为15%，10～30分钟流动相a为15→30%。检测波长为325nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl。

（2）高速逆流色谱分离纯化

以乙酸乙酯∶乙腈∶乙酸∶水（体积比35:10:5:50）为hsccc溶剂系统在分液漏斗中充分振摇后放置半小时，使其充分分层。然后将两相分开，在上相作为固定相，下相作为流动相，超声脱气30min。取浓缩物a510mg，溶于10ml流动相中，过滤后作为待分离样品。向hsccc色谱仪中以20ml/min的速度泵入固定相，待管路充分充满固定相后以850rpm转动主机，同时2ml/min泵入流动相，检测波长设为325nm，待两相达到平衡，基线稳定后用进样器注入样品；从出口处自动收集流出物，经hplc检测分析合并在140-160min流分，浓缩干燥获得纯度为90.5%绿原酸28mg。另取浓缩物b634mg，溶于10ml流动相中，采用相同hsccc条件，收集140-160min流分，浓缩干燥获得纯度为92.1%绿原酸24mg。

实验采用分析竹叶提取液中绿原酸纯度的液相色谱（hplc）条件为：以岛津c18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为填充剂，以乙腈-0.1%甲酸溶液（15：85）为流动相。检测波长为325nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl。图5为实施例1中大孔树脂流分a的hsccc分离色谱图，图中峰1分别为收集的绿原酸峰。图6为绿原酸标准品的hplc色谱图。图7为实施例1中大孔树脂流分ahsccc分离制得绿原酸的hplc色谱图。

实施例2

（1）大孔树脂分离

取冷冻干燥后的竹叶提取物16.1克，用水稀释成后的20mg/ml竹叶提物805ml，以2bv/h流速上样于50gxad-7hp大孔吸附树脂（1bv=35ml），然后依次用5bv蒸馏水、6bv60%乙醇、4bvml95%乙醇洗脱，洗脱流速为2bv/h。将上样后流出液（流分a）和水洗脱部分（流分b）分别收集，浓缩后分别获得浓缩物a和b；收集60%乙醇洗脱部分（流分c），浓缩获得竹叶黄酮富集物c。实验采用分析竹叶提取液中绿原酸和4种黄酮的液相色谱（hplc）条件同上。

（2）高速逆流色谱分离纯化

以乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水（体积比40:10:5:45）为hsccc溶剂系统在分液漏斗中充分振摇后放置半小时，使其充分分层。然后将两相分开，在上相作为固定相，下相作为流动相，超声脱气30min。取浓缩物a523mg，溶于10ml流动相中，过滤后作为待分离样品。向hsccc色谱仪中以20ml/min的速度泵入固定相，待管路充分充满固定相后以850rpm转动主机，同时2ml/min泵入流动相，检测波长设为325nm，待两相达到平衡，基线稳定后用进样器注入样品；从出口处自动收集流出物，经hplc检测分析合并在165-185min流分，浓缩干燥获得纯度为93.5%绿原酸7mg。另取浓缩物b634mg，溶于10ml流动相中，采用相同hsccc条件，收集165-185min流分，浓缩干燥获得纯度为95.1%绿原酸20mg。实验采用分析竹叶提取液中绿原酸纯度的液相色谱（hplc）条件同上。