一种根瘤菌YZLH133及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一种根瘤菌yzlh133及其应用。

背景技术：

根瘤菌（rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，能侵染豆科植物根部或茎部后形成根瘤（rootnodule）或茎瘤（stemnodule），以共生体形式固定空气中的n2成为植物可吸收利用的nh4⁺。豆科植物与根瘤菌之间的共生体系在整个生物固氮中占有极其重要的地位。据估计，地球表面每年从空气中固定的氮素约有1亿吨，通过豆科植物和根瘤菌所固定的氮素约有5500万吨。根瘤菌与豆科植物形成共生固氮体系，除了满足植物自身的氮素需要外，还可以将多余的氮提供给与之混种或间种的非豆科植物，如与禾本科植物混播的非豆科植物可以少施氮肥；利用¹⁵n示踪技术，研究发现，与豆科植物混播的禾本科植物30%的氮来源于豆科植物所固定的氮。根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强的优点，可以提高土壤肥力和为人畜提供蛋白质营养。研究根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，有利于实现农业、环境和生态可持续利用与发展。接种根瘤菌是提高豆科作物生产的重要措施。国内外大量试验证明，接种根瘤菌在多数土壤中可以提高豆科作物的产量和品质（李力曹等，2000；李友国等，2002）。bohlool在总结多种作物在多年接种根瘤菌效果时指出，豆科作物接种根瘤菌的产量比不接种根瘤菌提高89.5%（bohlooletal.,1973）。

花生是重要的豆科作物，也是我国主要的油料作物。根瘤菌和花生根系能够形成根瘤进行共生固氮，为花生生长提供氮素。接种高效根瘤菌，是促进花生共生固氮，改善花生氮素营养的重要措施。然而，目前还缺乏成熟有效的花生高效固氮根瘤菌剂。本研究利用来自不同生长区的花生品种进行盆栽、大田试验，从其根瘤中分离、纯化高效固氮根瘤菌；然后利用pcr技术对纯化的根瘤菌进行鉴定，并通过16srdna技术进行测序鉴定；在温室利用回接的方法验证宿主专一性及根瘤固氮酶活性，最后在大田试验筛选适宜南方酸性土壤生长的花生高效根瘤菌菌株，并根据土壤养分特性配制花生高效根瘤菌菌剂。研究结果将对花生高产高效生产提供实际有效的技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种花生根瘤菌株，该菌株系是慢生根瘤菌属的新菌株系，具有结瘤率高和固氮能力强的特点。

本发明的另一个目的是利用上述根瘤菌株，将其应用在豆科植物花生农业生产上，通过提高花生的生物固氮能力，促进生长达到花生生产中减肥增效的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的：

一种根瘤菌yzlh133菌株（即福农3号），于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018216，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

其16srdna序列如seqidno.1所示。

分离得到的根瘤菌yzlh133菌株在菌落形态上，为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在yma平板上生长5～7天后的直径为0.8～2.0mm

本发明的优点在于：

（1）本发明的根瘤菌具有结瘤率高和固氮能力强的特性，回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌可显著提高花生鲜重和干重，可用于实际生产；

（2）花生接种本发明的根瘤菌，极显著地提高植株全氮含量(p<0.01)，从而达到促进花生植株生长和提高花生产量的目的；

（3）本发明的根瘤菌适用于南方酸性土壤地区，可作为花生常规栽培的重要措施之一。

附图说明

图1为根瘤菌yzlh133在yma培养基上的菌落形态。

图2为根瘤菌yzlh133的16srdna部分序列分析系统发育树(方框内为根瘤菌yzlh133)。

图3为根瘤菌yzlh133水培回接效果图。

图4为固氮酶活性及结瘤数。

图5为水培接种根瘤菌yzlh133对花生生长的影响。

图6为大田接种根瘤菌yzlh133对花生生长、产量的影响。

图7为大田接种根瘤菌yzlh133对花生生长、产量的影响效果图。

具体实施方式

实施例1根瘤菌yzlh133的分离和纯化

（1）在花生正常生长的开花期，取新鲜的整个花生根部，在根部取花生新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。

（2）先放入体积分数95%的乙醇中处理3～5分钟，取出用无菌水冲洗5～6次，再放入1g/lhgcl2灭菌3～5分钟，取出用无菌水冲洗5～6次。

（3）于火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向yma(表1)培养基表面划线，倒置后在28℃下培养。

（4）待长出菌体后，用灭菌的牙签从平板上刮取少量根瘤菌菌落，用无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3天之后观察菌落情况，一直观察到15天(慢生根瘤菌需7～15天出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。

表1yma（yeastmannitolagar）培养基配方

根据以下方法可初步判断是否为根瘤菌：

菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质较多。培养3～5天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养7～10天菌落直径达1mm则为慢生型根瘤菌。

本实施例菌株yzlh133为慢生型根瘤菌，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在yma平板上生长5～7天后的直径为0.8～2.0mm（附图1）；最适生长条件为：ph＝7.0，温度28℃，转速180r/min，可利用广泛的碳源和氮源。

运用此分离纯化方法，经若干代反复纯化，在yma固体培养基（表1）中划线培养，得到多株纯菌株系，纯菌株系经水培回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到结瘤率高和固氮能力强菌株系yzlh133。

实施例2根瘤菌yzlh133的16srdna序列测序

对根瘤菌单克隆菌液进行pcr特异性扩增，引物分别为v3-v4-f和v4-v5-r，正向引物v3-v4-f为5′-gwattaccgcggckgctg-3′；反向引物v4-v5-r为5′-ccgtcaattcmtttragttt-3′，酶选用2×starmix。pcr扩增产物做电泳成像技术进行检测，观察其是否具有条带，将剩余pcr扩增产物用于序列测定。测序结果如seqidno:1所示。其pcr反应体系如下：

表216srdna2×starmix酶反应体系

从ncbi(genbank)数据库中获取12个参比菌株序列，运用软件bioedit和mega6对分离菌株和参比菌株的16srdna部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树(附图2)。从而确定根瘤菌yzlh133为慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)的新菌株系，并命名为福农3号。

实施例3回接试验

1、菌株培养：

将-80℃保存的供试菌株转接于yma液体培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测，利用od值计算含菌量；yma(yeastmannnitolagar)液体培养基成分为：称取甘露醇10g，mgso4∙7h2o0.2g，nacl0.1g，酵母粉3g，k2hpo40.25g，kh2po40.25g，caco33g(保存时添加)，琼脂15g溶于1l纯水中。

2、灭菌处理

将试验所需用的2.5l塑料桶、烧杯、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒包好，将蛭石用保鲜袋装好，121℃，灭菌30min。yma液体培养基、蒸馏水用瓶子装好，121℃，灭菌20min。

将花生的种子放入1g/lhgcl2中3min进行表皮灭菌，并用清水反复冲洗干净，放入装有蛭石的2.5l塑料桶在人工生长室催芽7天，待胚根长出3-5cm即可回接水培。

3、水培及接种：

(1)将催芽完成的花生放置于培养皿中，并置入纯化的根瘤菌（附图4），将花生根部完全没入根瘤菌中30min，菌含量为10⁹∙ml^-1。

(2)将上述已经回接好的花生移栽入2.5l塑料盆中并加入2l植物低氮营养液，并在人工生长室进行培养。生长室(光周期为：日/夜=16h/8h，温度为：日/夜=26℃/24℃)；所述植物低氮营养液配方为：ca(no3)2∙4h2o0.03g，mgso4·7h2o0.12g,cacl2·2h2o0.10g，kh2po40.10g，na2hpo4·12h2o0.15g，c6h5o7fe·5h2o0.005g，微量元素1ml，蒸馏水1000ml,ph5.8-6.0。微量元素配方(g∙l^-1):h2moo40.02g，mnso41.81g，h3bo32.86g，cuso4·5h2o0.8g，znso4·7h2o0.22g。

以不接种为对照，做3个重复，接种30天后收获，以植株鲜重、干重、结瘤数、植株含氮量和spad值作为测定根瘤菌的结合性和固氮能力的判断指标。

结果显示，空白对照(ck)无结瘤现象，回接处理平均每棵花生可结瘤17.67个。切开根瘤发现，根瘤内部为红色，基本判定供试菌株yzlh133为具有固氮效率的根瘤菌(附图4)，且对其根瘤固氮酶活性进行测定，其值为3.57umol∙(g∙h)^-1。

由图3和图5可知，与不接种根瘤菌相比，闽花8号接种根瘤菌yzlh133可显著提高其植株鲜重、植株干重、spad值和植株含氮量(p<0.01)。说明根瘤菌yzlh133的结合性和固氮效率均较高。

实施例4田间接种试验

1、菌株培养：

将-80°c保存的供试菌株转接于yma液体培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测，利用od值计算含菌量。

2、大田试验实施：

本试验在福建省安溪县龙涓乡举源村举源茶业合作社茶园进行。播种时期为2018年3月28日。本试验设有2个处理：接根瘤菌yzlh133（福农3号）与不接根瘤菌剂处理，同时按5kg钙镁磷肥/亩的施肥量施用钙镁磷肥，钙镁磷肥以底肥的方式按照统一的标准一次性施入。本试验设3次重复。试验采取随机区组设计，于茶行间种植，每个茶行播种1行，播种密度为200cm×25cm(茶行距×株距)。播种、施肥、灌溉、杂草及病虫害按花生常规管理执行。

田间调查在花生的开花期（2018年6月26日）、结实期进行（2018年7月26日），调查了单株结瘤数、生物量、spad值，植株含氮量、单株产量（结果见图6）。

从图6可见，接种根瘤菌yzlh133能够促使花生结瘤。接种处理与不接种处理的根瘤个数存在着显著性差异。接种处理的单株生物量与不接种处理的单株生物量呈现显著性差异，接种根瘤菌有利于促进花生生长（如图7）。接种处理的花生地上部干重明显比不接种处理的高，增加的幅度为38%。接种根瘤菌yzlh133对于花生结荚数有显著的影响，增加幅度为72.4%。接种花生根瘤菌yzlh133对于花生产量有显著的影响，增加幅度为54.6%。

本试验研究表明，在不施用氮肥的情况下，单纯使用根瘤菌yzlh133有明显的增产效果，可见由本研究室研制出来的根瘤菌yzlh133可以用于大面积的推广施用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种根瘤菌yzlh133及其应用

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