OBR基因及用作溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关遗传标记的方法与流程

本发明属于家禽分子生物技术及育种领域，主要是测定溆浦鹅肥肝性状相关的遗传标记，具体地说是，是测定obr基因中的多态性，即与溆浦鹅肥肝性状相关的瘦蛋白受体基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，缩写为snp)的存在。

技术背景

溆浦鹅是我国肥肝性能最优，体型大，生长快，抗病性强，优势特别明显的国家级地方品种遗传资源，2014年进入国家级畜禽遗传资源保护名录。鹅肥肝是世界级高档美味健康食品中三大珍品之一，其所富含的不饱和脂肪酸、亚油酸、卵磷脂等对软化血管、降低血脂、预防心脑血管疾病的发生具有重要保健作用。由于溆浦鹅缺乏科学系统选育，导致填肥后肝脏大小个体差异大，严重制约了鹅产业化生产效率、产品品质和经济效益。常规选育较慢，随着生物分子技术的发展，使得我们能够从dna水平寻找与溆浦鹅肥肝性状相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，一提高选育进程，获得更大的经济效应。

瘦蛋白受体(leptinreceptor,obr)是一种跨膜蛋白，属于i类细胞因子超家族受体，有5种异构体，即obra、obrb、obre、obrd和obrf。它们具有相同的胞外区，而胞内结构域则具有长度和序列上的差异。obr主要生理功能是与瘦素结合，使瘦素发挥调节体内能量平衡、脂肪贮存等生理作用。有关家禽obr基因的研究很少，guy等首次克隆了鸡obrcdna序列，与哺乳动物的同源性平均为60％。dunn等将鸡的obr基因定位在8号染色体上。顾志良等在obr基因外显子9上检测到了1个碱基突变，并推测等位基因a可能与沉积较多腹脂有关。王颖等在鸡obr基因内含子8上检测到了t—c、g—a2个基因突变，产生的不同基因型在腹脂重和腹脂率上差异显著，bb型个体腹脂重和腹脂率显著高于ab型个体，极显著高于aa型个体。初步推断obr基因可能是影响鸡脂肪性状的主效基因或与主效基因紧密连锁

目前，关于obr基因多态性与肥肝性能的关联分析相对较少。溆浦鹅dna遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关的遗传标记尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，提供一种obr基因及其作为溆浦鹅肥肝性状遗传标记的用途；同时筛选与溆浦鹅肥肝性状相关的snp，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在溆浦鹅标记辅助选择中的应用。

本发明实施例是这样实现的，一种obr基因，所述基因为与表示溆浦鹅肥肝性状相关的基因，它的核苷酸序列如序列表seqidno:1所述。序列表seqidno:1的573bp处有1个g/a的碱基突变，导致多态性存在。所用引物如下：

正向引物：5’—tttgccgttagtaccagg—3’

反向引物：5’—gcacagacaaacaggagc—3’

本发明实施例的另一目的在于提供一种用obr基因作为溆浦鹅溆浦鹅肥肝性状相关遗传标记的方法，包括如下步骤：

(1)根据genbank中鹅obr基因的序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列；

(2)以溆浦鹅基因组dna为模板，pcr扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表seqidno.1所示的核苷酸序列；

(3)在扩增的591bp序列中(如序列表seqidno:1所示)，第573bp处存在1个突变位点。并证实该位点是在obr基因第16内含子碱基位置258bp处。

进一步，所述方法选择溆浦鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选溆浦鹅肥肝性状相关基因，其步骤如下：

(1)选择相同批次80日龄健康溆浦鹅60只进行饲养试验；

(2)根据obr基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；

(3)筛选与肥肝性状相关的snp。

关于溆浦鹅肝脏脂肪沉积相关基因snp筛选方法。

选择相同日龄的健康溆浦鹅50～80只进行填饲试验。一般在28天后进行屠宰，分别称取所有溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本中(大肝和小肝)分别提取其基因组dna。

根据genbank中鹅obr基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列，引物序列为：5’-tttgccgttagtaccagg-3’(正向)，5’-gcacagacaaacaggagc-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为1246bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是obr基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。图1是突变位点和测序峰图。

上述实验结果表明，从溆浦鹅肝脏中提取相关基因为obr基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的snp，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。

关于与溆浦鹅肝脏脂肪沉积有关的snp在生产实践中的验证试验。

选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅10～20只进行试验。一般在28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，分别称量肝脏重量。

用提取的溆浦鹅肝脏组织样基因组dna，并利用引物扩增，并检测其snp。

1、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

2、obr基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、obr基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析

分析不同snp基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同snp基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中gg基因型溆浦鹅肝重高ga型个体110.8％，差异达到显著水平(p<0.05)。

表3不同基因型溆浦鹅肝重比较

注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(p＜0.05)。

本发明采用pcr与dna测序结合的方法首先筛选出obr基因为溆浦鹅肥肝性状的相关基因，继而从溆浦鹅obr基因上筛选到与性状相关的snp，并且通过生产实践验证确定obr基因为肥肝脂肪沉积相关基因，筛选的snp为与之相关的snp。本发明筛选的溆浦鹅obr基因的snp可作为溆浦鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出肝脏脂肪沉积沉积更多，肝脏更大的溆浦鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。

附图说明：图1是突变位点和测序峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1溆浦鹅肝脏脂肪沉积相关基因snp筛选

选择相同日龄的健康溆浦鹅60只进行填饲试验。28天后进行屠宰，称量溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本中(大肝和小肝)分别提取其基因组dna。

根据genbank中鹅obr基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列，引物序列为：5’-tttgccgttagtaccagg-3’(正向)，5’-gcacagacaaacaggagc-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为1246bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是obr基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。图1是突变位点和测序峰图。

上述实验结果表明，从溆浦鹅肝脏中提取相关基因为obr基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的snp，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。

实施例2与溆浦鹅肝脏脂肪沉积有关的snp在生产实践中的验证

选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅14只进行试验。28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，称量肝脏重量。

用提取的14只溆浦鹅肝脏组织样基因组dna，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其snp。

1、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

2、obr基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、obr基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析

分析不同snp基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同snp基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中gg基因型溆浦鹅肝重高ga型个体110.8％，差异达到显著水平(p<0.05)。

表3不同基因型溆浦鹅肝重比较

注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(p＜0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>obr基因及用作溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关遗传标记的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>591

<212>dna

<213>鹅(goose)

<220>

<221>mutation

<222>(573)

<223>r=g或a

<400>1

agttgccaacaagatcagctatgataaaggttcagaaactctgtgttgagtatgttgttc60

aggtccgctgcagagcactggatggtttaggttactggagcaactggagcagatcagctt120

atgcagttgtgagagatatcaaaggtacgtgtgctttcagagcgtgctctgatgctcggt180

ccggtttcagactcagatgtgacactgttctttcaaaactgtaatcttgcagctccctta240

caaggccctgagttttggagagttgttgttgaagatccagccaggaggcagaaaaatgtt300

accctcctgtggaaggtgagaacacttagattttggtctttcactttgaaagatgcatga360

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