一种连续化提纯抗体的系统及方法与流程

本发明涉及抗体领域，尤其是涉及一种连续化提纯抗体的系统及方法。

背景技术：

生物制药行业迅速发展，连续生产工艺以其高效、快速和更稳定的特性越来越被关注。连续生产技术在生物制药行业中的应用开始于21世纪初，其越来越多地被应用以取代传统的批次生产方法，来提高一致性、降低生产成本和缩短交货期。在生物制药上游工艺中，连续生产始于灌流培养的方式，一些不稳定的生物制品已经在上游实现了的商业化的连续生产，如凝血因子vii和凝血因子viii。

在商业化的单克隆纯化工艺中，传统的工艺通常为：细胞培养液经澄清处理后，经过蛋白a亲和层析捕获抗体、病毒灭活、中间深层过以及精纯步骤以进一步去除宿主细胞蛋白(hcp)、多聚体、dna、病毒、脱落蛋白a等杂质而提高纯度。传统精纯工艺是利用多种层析模式的组合进行，如阴离子交换层析(流穿模式)、阳离子交换层析(结合-洗脱模式)、疏水层析(流穿模式或结合-洗脱模式)。而且所有这些步骤，通常均以独立操作单元进行，每步层析都已结合了特殊基团的填料通过离子作用或疏水作用能够特异性结合带电荷或疏水性分子。首先将填料填装于层析柱内，之后通过结合-洗脱模式(抗体与填料介质结合)或流穿模式(抗体不与填料结合)对抗体进一步精纯。该过程需要消耗时间与人力进行柱子的装填与柱效测定，并且操作过程、流速控制等要求较高，尤其是结合-洗脱模式层析，需要大量的层析填料，消耗大量的缓冲液，很长的操作时间，以及很高的设备要求及成本投入。

为了解决上述问题，常规的做法是用多柱连续层析的方式，把相同的层析填料填充在多根层析柱中，在上样阶段优化条件使得层析填料达到满载，提高效率，节省填料和缓冲液的用量。但是，这种连续层析技术也带来了新的挑战，更多层析柱之间的连接带来系统设计的复杂性，需要相应的阀路设计满足来工艺的需求。为了满足多柱位连续层析，需要特殊设计的层析系统，常见的有：ge公司的3柱位或4柱位的运行pcc连续流层析设备，pall公司的使用一次性管路及多柱位的cadencebiosmb工业系统，以及chromacon公司的2柱位contichromcube连续流层析设备。以上设备型号有限、设备复杂等问题限制了抗体的规模化应用，同时高昂的成本也限制了抗体的研发。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种连续化提纯抗体的系统，该系统解决了现有提纯系统设备复杂、成本昂贵的问题，该系统利用多种膜层析串联组合实现连续精提纯抗体的目的。

本发明的第二目的在于提供一种连续化提纯抗体的方法，该方法相比现有提纯方法更经济、可靠、稳健，易于操作，能极大推动抗体的研发进程。

为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种连续化提纯抗体的系统，包括多个串联的层析膜，相邻的两个所述层析膜之间依次通过中间储罐、泵连接；

所述多个层析膜为不同类型的层析膜，选自阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜和疏水层析膜中的至少两种，优选阴离子交换层析膜和阳离子交换层析膜，优选阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜和疏水层析膜，优选阴离子交换层析膜和疏水层析膜；优选阳离子交换层析膜和疏水层析膜。

如上文所述，本发明将不同(至少两个)层析原理的膜串联在一起，并在中间设置中间储罐和泵，这样可以实现上样液或流穿液在多种层析膜之间的连续性流动(抗体始终保留在流穿液中)，使其得到不同类型的流穿处理。由于不同类型层析膜所捕捉的杂质(包括宿主细胞蛋白、多聚体、dna、病毒等杂质)不同，因此，本发明通过多种层析膜组合的方式提高了杂质的被捕捉量，即流穿液中的抗体纯度不断得到提高。

同时由于层析膜为占地面积小、成本低、普及性高等优点，因此本发明的提纯系统具有经济、可靠、稳健、易操作等优势。

另外，本发明所用的层析膜可以作为一次性产品使用随同管路丢弃处理，减少多种验证成本，与此同时并不会比现有提纯成本高，成本仍然降低很大幅度。

综上，本发明的系统具有连续化提纯、提纯纯度高、经济、可靠、稳健、易操作、无需再生柱等特点。

本发明的系统中，层析膜的组合方式是任意的，但通常由不同类型的层析膜组合，可以是三种或两种，例如：

阴离子交换层析膜和阳离子交换层析膜，

或者，阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜和疏水层析膜，

或者，阴离子交换层析膜和疏水层析膜，

或者，阳离子交换层析膜和疏水层析膜。

层析膜的组合方式主要根据抗体的类型、细胞的类型、提纯前抗体的纯度以及杂质类型、含量等因素而定。

在此基础上，还可以对系统进一步改进，具体如下。

优选地，所述泵为蠕动泵或隔膜泵。

蠕动泵具有流体不易被污染、可快速更换泵管、流体可逆行、可以干运转、维修费用低等优势。

优选地，相邻的两个所述层析膜之间依次通过中间储罐、泵和压力表连接。

增加压力表检测层析膜的压力，使其能够在安全范围内稳定运行。

优选地，每个所述中间储罐还连接有用于输送调节ph和电导率的调节液的管道。

不同层析膜为了实现抗体流穿，所适宜的ph和电导率不同，且膜载量也不同，因此，通常设置管道向中间储罐输送调节液，来调节上样液的ph和电导率。ph和电导率的调节可以分两个独立的管道加入调节液，或者共用一个管道加入调节液。

优选地，所述多个串联的层析膜中的第一个层析膜的上样端还连接有深层过滤器。

在层析之前进行深层过滤，一方面提高抗体纯度，另一方面减轻后续层析的负担。

优选地，所述深层过滤器的上样端还连接有蛋白a亲和层析柱。

本发明主要是针对抗体的精提纯部分提出的改进，在精提纯之前通常先采用蛋白a亲和层析柱捕获抗体。

同时，本发明还提供了一种连续化提纯抗体的方法，包括下列步骤：

步骤a：使经捕获并病毒灭活的抗体以抗体流穿模式连续性地进行第一次膜层析，得到的流穿液连续地进入第一中间储罐；

步骤b：将所述第一中间储罐中的溶液以抗体流穿模式连续性地进行第二次膜层析，得到的流穿液连续地进入第二中间储罐；

步骤c：将该溶液重复所述步骤a的操作，以使待提纯的溶液经过共n次膜层析，收集最终的流穿液；所述重复的次数为n-2；所述n为≥0的正整数；

其中，每次膜层析所用的层析膜选自阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜和疏水层析膜中的一种，并且每次膜层析所用的层析膜类型不同；

优选地，所述第一次膜层析至第n次膜层析依次为：阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜；

优选地，所述第一次膜层析至第n次膜层析依次为：阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜和疏水层析膜；

优选地，所述第一次膜层析至第n次膜层析依次为：阴离子交换层析膜、疏水层析膜；

优选地，所述第一次膜层析至第n次膜层析依次为：阳离子交换层析膜、疏水层析膜。

本发明的提纯方法与上述提纯系统的化学原理相同，都是：抗体溶液(或者细胞培养液)均以流穿模式通过多个不同类型的层析膜，即目标抗体不能与膜结合随流穿液流出，而宿主细胞蛋白、多聚体、dna、病毒等杂质能与膜介质结合，以达到连续化分离纯化抗体的目的。

同理，本发明的提纯方法也具有连续化提纯、抗体纯度高、经济、可靠、稳健、易操作、无需再生柱等特点。

本发明的方法用于不同类型抗体或不同细胞培养的抗体提纯时，提纯条件(包括膜类型、流速、平衡液、上样液的酸碱度及电导率等)有区别。

本发明并不限定层析膜的类型，可以是市场上已有的或者待开发的同分离原理(主要涉及阳离子交换、阴离子交换和疏水三种)的层析膜。

例如阳离子交换膜层析产品包括但不限于s(pall)，s(sartorius)。

阴离子交换膜层析产品包括但不限于q(pall)，q(sartorius)，q(millipore)。

疏水膜层析产品包括但不限于phenyl(sartorius)。

在以上提纯方法基础上，可以增加其他工序或者改良层析条件，以提高抗体收率或纯度，如下文所述。

优选地，在所述步骤a之前，使所述抗体的细胞培养液经过蛋白a亲和层析和病毒灭活。

优选地，所述病毒灭活之后和进行第一次膜层析之前：将样品溶液的ph调节至5.0～8.0。

优选地，所述n次膜层析中有一次阳离子交换膜层析，并且在所述阳离子交换膜层析时先将待上样液的电导率调节至12～20ms/cm或3～8ms/cm。

在以上两个区间内均能调节获得阳离子交换层析膜上适宜抗体流穿的条件。

优选地，所述阳离子交换膜层析时，将待上样液的电导率调节至12～20ms/cm，并且使该次膜层析的载量≥300g/l；

优选地，所述阳离子交换膜层析时，将待上样液的电导率调节至3～8ms/cm，并且使该次膜层析的载量≥500g/l。

优选地，所述抗体为cho细胞表达的单抗。

优选地，所述第一次膜层析为阴离子交换层析膜，所述第二次为阳离子交换层析膜，所述n＝2。

优选地，在所述第一次膜层析之前，用50mmtris-hac、ph7.0的缓冲液稀释待上样液，并将ph调节至7.0～7.5。

优选地，将所述第一中间储罐中的溶液的ph调节至5.3-5.7，电导率调节至4.2～5.0ms/cm，优选4.6～5.0ms/cm。

优选地，所述第一次膜层析为mustangqxt膜，所述第二次膜层析为mustangsxt膜；

优选地，每次层析时的流速为8～12倍膜体积/每分钟，优选10倍膜体积每分钟。

优选地，在层析过程中，监测每个层析膜的压力，保证其在安全范围内稳定运行。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)在满足连续化提纯的基础上，能够降低精提纯成本，利用普及性较高的层析膜实现与多柱位连续层析相同的提纯效果，甚至优于后者，表现在抗体收率提高，纯度更高等方面；

(2)并且优化了提纯cho细胞表达的单抗时的层析系统和层析方法，使抗体得率达到91％以上，样品纯度达到99.0％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的连续化提纯抗体的系统结构示意图；

图2为本发明实施例2提供的连续化提纯抗体的系统结构示意图；

附图标记：

1-深层过滤器，2-阴离子层析膜，3-阳离子层析膜，

4-最终样品储罐，5-蠕动泵，6-调节液输送管，

7-压力表，8-疏水层析膜。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

如图1所示的抗体精提纯系统，包括依次串联的深层过滤器1、阴离子交换层析膜2、阳离子交换层析膜3和最终样品储罐4。

阴离子交换层析膜2和阳离子交换层析膜3之间设有中间储罐，并且通过蠕动泵、压力表与下游的阳离子交换层析膜3连接。

中间储罐另外增设有调节液输送管6，用来调节流穿液的ph值和电导率。

同时，中间储罐还设有ph和电导率检测仪，以检测是否达标。

该系统用于cho细胞表达的单抗提纯时，具体过程如下，该应用例限定了阴离子交换层析膜2和阳离子交换层析膜3的具体型号。

样品来源为cho细胞表达的单抗(mab1)经蛋白a亲和层析捕获，低ph病毒灭活并调节ph至7.0得到初始样品a(即图中经灭活的样品)，总体积1l，蛋白浓度11.2mg/ml，纯度96.7％，多聚体含量为3.0％，宿主细胞蛋白(hcp)含量为1450ppm。以流速45ml/min经深层滤器a1hc(millipore)，膜面积0.027m²，上完样品后，以同样流速用1l平衡缓冲液(50mmtris-hac，ph7.0)推出残留滤器内的样品溶液。

过滤后，进入中间储罐作为样品b(即经过滤的样品)，以流速8.6ml/min，通过阴离子交换层析膜mustangqxtacrodisunits(pall)，膜体积0.86ml，流出液进入中间储罐。中间储罐在线ph7.0，电导率值为4.6ms/cm，以0.1ml/min滴入1mhac，调节中间储罐中的中间样品ph5.3-5.7。以流速8.6ml/min，通过阳离子交换层析膜mustangsxtacrodisunits(pall)，膜体积0.86ml，流出液进入最终样品储罐。连续操作最终收得2l样品溶液，抗体浓度5.1g/l，得率91％，样品纯度为99.0％，多聚体含量为0.9％，宿主细胞蛋白(hcp)含量为25ppm。

实施例2

如图2所示的抗体精提纯系统，包括依次串联的深层过滤器1、阴离子层析膜2、阳离子层析膜3、疏水层析膜8和最终样品储罐4。

阴离子层析膜2、阳离子层析膜3和疏水层析膜8中，每两个层析膜之间都设有中间储罐，并且通过蠕动泵5、压力表7与下游的层析膜连接。

中间储罐另外增设有调节液输送管6，用来调节流穿液的ph值和电导率。

同时，中间储罐还设有ph和电导率检测仪，以检测是否达标。

该实施例采用了三种类型的层析膜，原则上提纯效果优于实施例1，但在实际应用中还需考虑能耗、效率等因素，以确定增加层析膜数量是否更经济或性价比更高。

该实施例的结构可以增加其他结构或替换某些结构，以演变出其他实施方式，但均在本发明的保护范围内。

例如，可以调换层析膜的串联顺序，由前至后可以为：

阴离子交换层析膜、疏水层析膜、阳离子交换层析膜，

或者疏水层析膜、阴离子交换层析膜、阳离子交换层析膜，

或者阳离子交换层析膜、阴离子交换层析膜、疏水层析膜。

或者在层析膜之间增设其他更先进的监控设备，以控制系统更安全、稳定地连续运行。

综上，本发明所有实施例的系统均具有以下共性：

连续化提纯、抗体纯度高、经济、可靠、稳健、易操作、无需再生柱工序等。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。