一种复合微生物除臭菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种复合微生物除臭菌剂及其制备方法与应用，属于畜禽粪便无害化处理或生物除臭
技术领域：
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背景技术：
：随着我国畜禽业的不断发展，集约化程度越来越高，畜禽养殖数量猛增，粪便的排放量也在增加，对空气、水和土壤造成了一定污染。其中，恶臭污染被认为是仅次于噪音污染的六大公害之一，不仅严重污染了环境，甚至危害着人们的健康，具有大气污染和有害气体污染的双重性。大量畜禽粪便在堆放过程中发酵产生各种恶臭物质，包括nh3、h2s、吲哚、甲基硫醇等，长期接触，会对人畜的健康产生危害，有慢性中毒的潜在可能。据报道，一个规模为3万只的蛋鸡场，每天能排出超过1.8kg的nh3到空气中，因长期接触到nh3，会引发家禽眼结膜炎，影响其正常采食和饮水；其次，这些恶臭还会滋生蚊蝇、传播疾病，也是形成温室效应和酸雨的污染源之一。因此，减少氨气和硫化氢等恶臭气体的排放，是解决目前堆肥除臭关键性问题的研究热点之一。目前，国内外畜禽粪便除臭治理主要采用物理、化学和生物除臭技术，使恶臭气体的物象和结构改变而达到脱臭的效果。化学方法主要是利用强氧化剂高锰酸钾、过氧化氢等，使部分臭气成分氧化成少臭、无臭物质。物理方法包括机械通风降低臭气浓度，或者通过吸收剂吸收臭气。这两种技术在快速除臭的同时，容易增加成本，无法重复利用，造成环境的二次污染。生物除臭法是上世纪50年代发展起来的一种治理恶臭污染的方法，该方法是利用微生物的生理代谢活动来降解恶臭物质使之转化为无臭物质，具有处理效率高、无二次污染、便于操作、费用低廉等特点，已成为国内外恶臭防治研究与应用中的主要方法。中国专利文献cn102851210a(申请号201210190607.1)公开了一种畜禽粪污微生物除臭菌剂、其制备方法及其应用，该菌剂含有保藏号为cgmccno：5982的酵母菌种杰丁毕赤酵母pichiajadinii和保藏号为cgmccno：5984的酵母菌种酿酒酵母saccharomycescerevisiae，将该菌剂添加到猪粪中，氨气的降低率为44～51％，硫化氢的降低率为33～38％。微生物除臭过程中主要是微生物的氧化硫化物、异养硝化和好氧反硝化及还原等功能方面的作用，因此除臭关键在于高效微生物的筛选，并研究其生物特性与除臭效果，为新型微生物除臭菌剂的制备奠定基础。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种复合微生物除臭菌剂及其制备方法与应用。本发明技术方案如下：一种复合微生物除臭菌剂，所述菌剂包括蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2、曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6和玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，所述复合微生物除臭菌剂的总菌数大于等于1×109个/ml；所述蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16527；所述曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16529；所述玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16528。根据本发明优选的，所述复合微生物除臭菌剂中蜡样芽胞杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例为1：(0.5～2)：(0.5～2)。进一步优选的，所述复合微生物除臭菌剂中蜡样芽胞杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比为1∶1∶1。上述复合微生物除臭菌剂的制备方法，步骤如下：(1)菌种活化将蜡样芽胞杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6、玉米乳杆菌2-20分别接种在相应的液体培养基上，培养至生长对数期，得蜡样芽胞杆菌2-2种子液、曼氏毕赤酵母2-6种子液、玉米乳杆菌2-20种子液；(2)菌种扩大培养将步骤(1)得到的蜡样芽胞杆菌2-2种子液、曼氏毕赤酵母2-6种子液、玉米乳杆菌2-20种子液按照体积比10％的接种量分别接种于相应的扩大培养基中，扩大培养得蜡样芽胞杆菌2-2菌液、曼氏毕赤酵母2-6菌液、玉米乳杆菌2-20菌液；(3)菌种复配检测步骤(2)得到的蜡样芽孢杆菌2-2菌液、曼氏毕赤酵母2-6菌液和玉米乳杆菌2-20菌液的菌数，按照蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例1：(0.5～2)：(0.5～2)进行混合，混合后ph为5.0～6.5，即得复合微生物除臭菌剂；其中，复合微生物除臭菌剂的总菌数为1-4×109个/ml。根据本发明优选的，步骤(1)中所述液体培养基的组分如下：蜡样芽胞杆菌2-2液体培养基为营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用；曼氏毕赤酵母2-6、玉米乳杆菌2-20液体培养基为ypd培养基：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌30min，备用。根据本发明优选的，步骤(1)中所述培养的条件为：蜡样芽胞杆菌2-2于30-37℃，160rpm摇床培养至生长对数期；曼氏毕赤酵母2-6于28-35℃，160rpm摇床培养培养至生长对数期；玉米乳杆菌2-20于30-37℃，160rpm摇床培养培养至生长对数期。根据本发明优选的，步骤(2)中所述扩大培养基的组分如下，均为质量百分比：蜡样芽胞杆菌2-2扩大培养基：葡萄糖1％，玉米淀粉1％，酵母膏0.2％，大豆粉1.5％；曼氏毕赤酵母2-6扩大培养基：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，kh2po40.15％，mgso40.02％；玉米乳杆菌2-20扩大培养基：红糖5％，玉米淀粉1％，蛋白胨1％，kh2po40.15％，mgso40.02％。根据本发明优选的，步骤(2)中所述扩大培养的条件为：蜡样芽胞杆菌2-2于30-37℃，160rpm摇床培养培养16-24h；曼氏毕赤酵母2-6于28-35℃，160rpm摇床培养培养24-36h；玉米乳杆菌2-20于30-37℃，160rpm摇床培养培养20-36h。根据本发明优选的，步骤(3)中所述复合微生物除臭菌剂中蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例为1:1:1。上述复合微生物除臭菌剂在畜禽粪便的无害化生物处理中的应用。一株蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16527。上述蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2从猪场粪堆中筛选得到，在营养肉汤固体培养基上生长菌落呈乳白色，不透明，圆形或近似圆形，凸起，菌体单个，杆状，有芽孢。一株曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16529。上述曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6从猪场粪堆中筛选得到，在pda固体培养基上生长菌落呈白色，不透明，圆形，凸起，表面光滑，细胞椭圆形，适宜生长温度25-35℃，兼性厌氧。一株玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16528。上述玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20从猪场粪堆中筛选得到，在mrs固体培养基生长菌落呈乳白色，圆形，菌落中等大小，微凸起，湿润，边缘整齐，细胞形状为杆状，适宜生长温度25-35℃，兼性厌氧。有益效果：1、本发明筛选获得了一株蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2，该菌株较现有已知蜡样芽胞杆菌去除nh3和h2s的效果显著提升；2、本发明筛选获得了一株曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6，该菌株具有优异的去除nh3和h2s的效果，该功能在曼氏毕赤酵母中首次发现；3、本发明筛选获得了一株玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，该菌株具有优异的去除nh3和h2s的效果，该功能在玉米乳杆菌中首次发现；4、本发明通过对蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2、曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6和玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20三株进行混合发现，三株菌不仅之间不会产生拮抗反应，而且可以显著提升去除nh3和h2s的效果，经实际检测，三株菌复合后的微生物除臭菌剂的氨气去除率达到73.04％，硫化氢的去除率达到71.19％。附图说明图1为菌株16srdna的pcr扩增电泳结果照片；图中：泳道1、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2；泳道2、曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6；泳道m、marker。图2为菌株26srdna的pcr扩增电泳结果照片；泳道3、玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)的26srdnapcr扩增片段；m：marker。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源：蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16527；曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16529；玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16528。实施例1：除臭菌株的分离取某养猪场外粪堆10g，放入到含有灭菌玻璃珠和50ml生理盐水的三角瓶中，于30℃，160r/min震荡2h，静置20min，取上清液1ml，用灭菌生理水稀释成浓度10-1悬液，连续作10倍梯度稀释，吸取不同稀释度悬液200μl，分别涂布在mrs琼脂培养基、营养肉汤琼脂培养基、ypd琼脂培养基上，28℃培养28-72h，观察菌株的生长情况，挑取单菌落进行培养。根据菌株形态及生长情况，挑取形态各异的菌株进行划线培养并低温保存。实验共分离40株菌，其中26株细菌，8株酵母菌，6株乳酸杆菌。上述实施例中的培养基及其配方如下：mrs培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000ml，ph6.2-6.6，115℃灭菌30min，备用。该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为mrs固体培养基。营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用。该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为营养琼脂培养基。ypd培养基：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌30min，备用。该培养基中添加琼脂18.0g，其他不变，即为ypd固体培养基。实施例2：菌株的筛选及鉴定1菌株的初筛将150g新鲜猪粪加入到500ml带塞的锥形瓶中，按照重量体积比5％的接种量接种分离到的菌株，于30℃恒温箱中培养10天，采用感官法评定臭味等级，结果见表1。从表1中可以看出，分离的微生物除臭能力各异，通过比较发现有三株细菌，一株乳酸菌，两株酵母菌具有较好的除臭能力。感官法测定恶臭等级，采用6级法划分气体臭度：0级：无臭味，用“-”表示；1级：勉强感觉到臭味，用“+”表示；2级：微弱臭味，用“++”表示；3级：臭味明显，用“+++”表示；4级：臭味强烈，用“+++”表示；5级：臭味难以忍受，用“++++”表示。表1：利用感官法初步筛选除臭菌株菌种编号臭味等级菌种编号臭味等级菌种编号臭味等级菌种编号臭味等级2-1++2-12++c2-1++c2-14++2-2++2-15++++c2-3++++c2-15+++2-4+++2-17++++c2-7++++c2-16++++2-6++2-19+++c2-9+++c2-17++++2-10+++2-20++c2-11++++c2-19++2菌株的复筛通过分别测定氨气和硫化氢气体的释放量进行菌株的复筛。2.1除氨菌的筛选按照10％比例将制备的菌液加入到含200g新鲜粪便的1000ml带盖的塑料烧杯中，充分混匀。每个大烧杯中放置1个装有30ml硼酸吸收液的50ml小烧杯，用以吸收氨气。封口密闭，28℃静置发酵3天，然后开始检测发酵粪便中氨气的释放量，添加相同体积的无菌水为阴性对照，每个处理重复3次。以甲基红-亚甲蓝为指示剂，采用硼酸吸收凯氏定氮法测定氨气释放量。与空白对照组菌株进行差异显著性分析，计算氨气的去除率，确定除臭菌株。2.2除硫化氢菌的筛选按照10％比例将制备的菌液加入到含200g新鲜粪便的1000ml带盖的塑料烧杯中，充分混匀。每个大烧杯中放入装有30ml碱性锌氨络盐溶液的50ml小烧杯，用于吸收硫化氢。封口密闭，28℃静置发酵3天，然后开始检测发酵粪便中硫化氢的释放量，添加相同体积的无菌水为阴性对照，每个处理重复3次。采用锌铵络盐比色法测定。与空白对照组菌株进行差异显著性分析，计算硫化氢的去除率，确定除臭菌株。表2复筛菌株的除臭效果处理2-22-62-20c2-1c2-13c2-19氨气去除率/％62.7955.2242.8652.0436.2625.64硫化氢去除率/％49.2252.4946.3935.6837.0422.01由表2可以看出，菌株2-2对nh3的除臭效果最好，达到了60％以上，菌株2-6对nh3和h2s的去除率均达到了50％以上，表现了最佳的除臭性能。另外，菌株2-20也表现了较好的除臭效果，对nh3和h2s的去除率分别是42.86％和46.39％，菌株c2-1对nh3去除率较好为52.04％，其他菌株包括c2-13和c2-19对nh3和h2s的去除率表现一般，因此选择菌株2-2、2-6和2-20作为复合生物除臭菌的功能菌株。2.3除臭微生物的菌种鉴定2.3.1生理生化检测将获得的各菌株接种于培养基上，28℃培养48h后，观察并记录菌落生长状况和菌落形态，显微镜下观察并记录菌体形态，并对各菌株进行生理生化测试。包括革兰氏染色、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚实验、vp实验、淀粉水解试验、硝酸盐及葡萄糖发酵检测。结果见表3菌株2-2在营养固体培养基上生长菌落呈乳白色，不透明，圆形或近似圆形，凸起，菌体单个，杆状，有芽孢。菌株2-6为酵母菌，在pda琼脂平板上生长菌落呈白色，不透明，圆形，凸起，表面光滑，细胞椭圆形，适宜生长温度25-35℃，兼性厌氧。菌株2-20在mrs培养基上培养，发现菌落呈乳白色，圆形，菌落中等大小，微凸起，湿润，边缘整齐，细胞形状为杆状，适宜生长温度25-35℃，有酸性气味，兼性厌氧。获得的3株除臭菌株的生理生化实验结果如表3所示。表3除臭菌株生理生化特征注：“+”为阳性，“-”为阴性。2.3.2分子验证将2-2、2-6、2-20分别接种在营养肉汤、ypd、mrs液体培养基中，28℃摇床培养36h，12000rpm离心收集菌体，利用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒和ezup柱式酵母基因组dna抽提试剂盒分别提取2-2,2-20和2-6。利用引物7f和1540r对菌株2-2和2-20进行pcr扩增，结果如图1所示；利用引物nl1和nl4对菌株2-6进行pcr扩增，结果如图2所示；所述引物核苷酸序列如下：7f：5’-cagagtttgatcctggct-3’1540r：5’-aggaggtgatccagccgca-3’nl1：5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’nl4：5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’pcr产物纯化后送至上海生物工程股份有限公司进行序列测定，测序结果与ncbi网站数据库中的序列进行同源性比对分析。最终这三株除臭菌株的生理生化特性结合分子验证，认为本专利中涉及到的三株菌2-2，2-6，2-20分别是蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)、曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)和玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)。将以上三株菌株分别进行保藏，保藏信息如下：蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)2-2，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16527；曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)2-6，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16529；玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)2-20，于2018年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.16528。本发明专利中的筛选到的菌株与其他除臭菌株对比效果本发明专利中筛选到的菌株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)cgmccno.16527与已公开的发明专利(公开号cn105617430a)进行除臭对比实验，按照专利cn105617430a中的第1组实施例除臭剂的制备方法进行制备蜡样芽孢杆菌cgmccno.16527的菌剂，其中所述蜡样芽孢杆菌不少于3.0×107cfu/ml，这与专利cn105617430a中的第1组实施例中蜡样芽孢杆菌的菌体浓度一致；将上述蜡样芽孢杆菌cgmccno.16527的菌剂按照专利cn105617430a中的应用实验例的方法，直接喷洒在粪便中，实验重复三次，经过24小时检测；结果显示以蜡样芽孢杆菌cgmccno.16527为主要成分制备的除臭菌剂，臭气浓度无量纲在55-60之间，除臭效果显著优于专利cn105617430a中的第1组实施例以短小芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的复合菌剂。本发明专利中筛选到的菌株曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)cgmccno.16529与已公开的发明专利(公开号cn105112311a)进行除臭对比实验，按照专利cn105112311a中的具体实施例中毕赤酵母的发酵方法进行曼氏毕赤酵母cgmccno.16529的发酵；按照专利cn105112311a中实验1方法检测曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)cgmccno.16529发酵液进行氨水和硫化氢的降解效果，结果发现该菌对氨气的去除率为93.5％，对硫化氢去除率为74.2％，其效果同该专利中的实验1的结果无显著差异，但目前未发现有关利用曼氏毕赤酵母(pichiamanshurica)为主要成分进行除臭实验的相关报道。利用玉米乳杆菌进行除臭方面的的专利较少，目前已公开的发明专利(公开号cn106434405a)公开的玉米乳杆菌l73主要作为嗜水气单胞菌拮抗菌，制成抑菌制剂在水产养殖中进行应用。另外已公开的发明专利(公开号cn108102990a)中，玉米乳杆菌主要作为微生态制剂中的成分之一，主要作用是利用该菌生成乳酸类物质，降低堆肥物料的ph值。本发明专利中筛选到的菌株玉米乳杆菌(lactobacilluszeae)cgmccno.16528与上述公开的专利cn108102990a中的玉米乳杆菌，同样具有降低粪便中ph值作用，但专利cn108102990a中的玉米乳杆菌并未有氨水和硫化氢的降解效果。实施例3：微生物除臭剂的复配(1)拮抗实验采用划线交叉法将获得的三株除臭菌株在营养固体培养基上进行两两之间十字划线，观察交叉点菌株的生长情况。两者交叉点如果生长则表示不拮抗，反之，则表示菌株之间具有拮抗性。结果发现，这三株菌之间不存在拮抗性。(2)除臭菌株的复配将得到的三株除臭菌株分别接种到营养肉汤、ypd、mrs液体培养基中摇床培养至对数生长期，按照以下比例(芽孢杆菌∶酵母∶乳酸菌)将3株菌的培养液进行复配：a：0∶1∶1；b：1∶0∶1；c：1∶1∶0；d：1∶1∶1；e：1∶2∶2；f：2∶1∶2；g：2∶2∶1，复配组合为7个，分别加入到含200g新鲜粪便的1000ml带盖的塑料烧杯中，充分混匀。每个大烧杯中分别放置1个装有30ml硼酸吸收液或者碱性锌氨络盐溶液的50ml小烧杯，用于检测氨气或者硫化氢。结果见表4。表4菌株复配对氨气和硫化氢去除作用注：不同组合对nh3和h2s去除率进行随机方差分析，不同大写字母表示差异显著，不同小写字母表示差异极显著(lsd法)。微生物菌株复配比例是提高除臭剂效果的关键所在，只有调整到最佳配置比例，形成稳定的具有协同效应的微生态菌群，才能达到最佳除臭效果。由表4可以看出，不同比例复配的微生物除臭剂对氨气和硫化氢均具有一定的除臭效果，当菌株2-2，2-6，2-20的比例为2∶2∶1，氨气和硫化氢的去除率均达到了65％以上，而这三株菌比例为1∶1∶1，氨气和硫化氢的去除效果最好，去除率分别是73.04％和71.79％。实施例4：复合微生物除臭菌剂的制备方法一种复合微生物除臭菌剂的制备方法，步骤如下：(1)菌种活化将蜡样芽胞杆菌2-2接种在营养肉汤培养基上，35℃，160rpm摇床培养培养至生长对数期，得蜡样芽胞杆菌2-2种子液；将曼氏毕赤酵母2-6接种在ypd培养基上，32℃，160rpm摇床培养培养至生长对数期，得曼氏毕赤酵母2-6种子液；将玉米乳杆菌2-20接种在mrs培养基上，35℃，160rpm摇床培养培养至生长对数期，得玉米乳杆菌2-20种子液；其中，营养肉汤培养基的组分为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph值7.2±0.2，121℃灭菌20min，备用；ypd培养基的组分为：酵母抽提物10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌30min，备用；mrs培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000ml，ph6.2-6.6，115℃灭菌30min，备用。(2)菌种扩大培养将步骤(1)得到的蜡样芽胞杆菌2-2种子液按照体积比10％的接种量接种于扩大培养基中，35℃，160rpm摇床培养培养16-24h，得蜡样芽胞杆菌2-2菌液，其中，扩大培养基的组分为，均为质量百分比：葡萄糖1％，玉米淀粉1％，酵母膏0.2％，大豆粉1.5％；将步骤(1)得到的曼氏毕赤酵母2-6种子液按照体积比10％的接种量接种于扩大培养基中，32℃，160rpm摇床培养24-36h，得曼氏毕赤酵母2-6菌液，其中，扩大培养基的组分为，均为质量百分比：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，kh2po40.15％，mgso40.02％；将步骤(1)得到的玉米乳杆菌2-20种子液按照体积比10％的接种量接种于扩大培养基中，35℃，160rpm摇床培养20-36h，得蜡样玉米乳杆菌2-20菌液，其中，扩大培养基的组分为，均为质量百分比：红糖5％，玉米淀粉1％，蛋白胨1％，kh2po40.15％，mgso40.02％；(3)菌种复配检测步骤(2)得到的蜡样芽孢杆菌2-2菌液、曼氏毕赤酵母2-6菌液和玉米乳杆菌2-20菌液的菌数，按照蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例1：1：1进行混合，混合后ph为5.0-6.5，即得复合微生物除臭菌剂；其中，复合微生物除臭菌剂的总菌数为2.5×109个/ml。实施例5：复合微生物除臭菌剂的应用将得到的复合微生物制剂及稀释10倍和100倍的稀释液，按照10％比例加入到含200g新鲜粪便的1000ml带盖的塑料烧杯中，充分混匀。大烧杯中分别放置1个装有30ml硼酸吸收液或者碱性锌氨络盐溶液的50ml小烧杯，用于检测氨气或者硫化氢。结果见表5。表5菌剂及其稀释液对氨气和硫化氢去除作用处理nh3去除率(％)h2s去除率(％)菌剂76.18±3.12aa73.80±0.73aa稀释10倍71.64±1.48aa65.93±3.66aa稀释100倍52.33±5.77bb47.76±2.61bb注：复合微生物菌剂对nh3和h2s去除率进行方差分析，不同大写字母表示差异显著，不同小写字母表示差异极显著(lsd法)。通过该实验可以看出，复合微生物菌剂及其10倍稀释液在处理猪粪3天后，氨气和硫化氢的去除率均达到了65％以上，且差异显著不明显。本实施例中只是处理猪粪3天的情况，如果更为长期的施用该菌剂，同时加大菌剂中的菌数，使其维持优势菌群，可能会产生更好更持久的效果，在恶臭养殖场有很好的应用前景。实施例6按照实施例4所述的制备方法制备复合微生物除臭菌剂，不同之处在于：步骤(3)中蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例为1:2:2，混合后ph为5.0-6.5，复合微生物除臭菌剂的总菌数为2×109个/ml。按实施例5所述方法进行检测，nh3去除率是69.95％，h2s去除率是67.16％。实施例7按照实施例4所述的制备方法制备复合微生物除臭菌剂，不同之处在于：步骤(3)中蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例为1:0.5:1，混合后ph为5.0-6.5，复合微生物除臭菌剂的总菌数为1×109个/ml。按实施例5所述方法进行检测，nh3去除率是70.84％，h2s去除率是65.46％。实施例8按照实施例4所述的制备方法制备复合微生物除臭菌剂，不同之处在于：步骤(3)中蜡样芽孢杆菌2-2、曼氏毕赤酵母2-6和玉米乳杆菌2-20的菌数比例为1:1:0.5，混合后ph为5.0-6.5，复合微生物除臭菌剂的总菌数为4×109个/ml。按实施例5所述方法进行检测，nh3去除率是72.94％，h2s去除率是69.15％。当前第1页12