一种亮丙瑞林的液相合成方法与流程

本发明涉及一种医药化合物的制备方法，特别是一种亮丙瑞林的液相合成方法，在制备过程中采用了新型催化剂。

背景技术：

亮丙瑞林是一种促性腺素释放激素（gnrh）类似物，其结构序列为：pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhet。其结构式如下所示：

目前合成亮丙瑞林的方法有固相法、液相法还有固液结合法。固相合成方法主要是国内的专利报道，涉及到不同的全保护肽的策略选择，然后通过不同的保护剂脱除法进行脱保护获得产品。中国公开专利文献cn102464702b采用酸稳定的树脂，和boc保护氨基酸策略进行全保护肽的合成，用胺解法将全保护肽从树枝上胺解成乙基胺，通过保护基脱除，获得亮丙瑞林。该方法采用大量的hcl的异丙醇溶液，采用大量的溶剂，对环境污染极大，成本相对较高，不适合产业化。中国公开专利文献cn101538315b采用高位阻的hmpb树脂，拟通过位阻效应避免二酮哌嗪的产生，达到大生产的目的，但是在碱性条件下，大规模生产的时候，二酮哌嗪随着抽滤的时间延长而大量产生，导致产率下降，杂质变多，不适合产业化生产。中国公开专利文献cn1865280b采用常规的wang树脂或者ctc树脂进行固相合成，用三氟醋酸脱保护基，在全裸的肽序下进行乙胺化，生产亮丙瑞林产品。该方法存在两个问题，一个在大生产过程中根本无法避免二酮哌嗪的产生，产率会大幅度下降；同时采用无保护的多肽进行乙胺化，会产生一些杂质，不易纯化。因此该方法不适合产业化生产。中国公开专利文献cn106146622采用了酸碱不同保护基策略，在同一树脂上同时采用酸稳定和碱稳定保护基进行全合成，有效避免了二酮哌嗪的生成，但是操作极其复杂，在前期的合成过程中，对环境极不友好，不适合产业化生产。《有机化学》杂志2010年第30卷第6期837-842页报道了片段法合成亮丙瑞林的方法，该方法采用2+7片段法，虽然成功的合成了亮丙瑞林，但是采用固相和液相相结合的方法，导致产品成本偏高，液相合成中用到了氯甲酸异丁酯等有毒物质，对环境不友好。的为了解决二酮哌嗪杂质导致产率降低的问题，为了获得环境友好且符合产业化生产需要，特开发本方法进行产业化生产。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针现现有技术的上述缺陷，提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好的亮丙瑞林的液相合成方法，采用了5+4的片段合成法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种亮丙瑞林的液相合成方法，其特点是：所述的亮丙瑞林pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhet是在液相条件下由五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引与产品进行分离，然后五肽与四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet在缩合剂作用下缩合、脱保护而成。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其特征在于所述的羧基与氨基的缩合反应，通过催化剂完成反应，或者通过硫酯转移完成反应，或者通过酰氯反应完成，或者通过混合酸酐完成缩合反应，或者通过活化酯反应完成缩合反应。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-or8，再与α氮端保护的r1-ser(r4)反应，生成r1-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱氨基保护后备用。羧基r8保护的nh2-trp(r3)-or8反应，与α氮端保护的r1-his(r2)反应，生成r1-his(r2)-trp(r3)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-oh，与nh2-ser(r4)-tyr(r5)-or8进行缩合反应后，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-or8，再与α氮端保护的r1-ser(r4)反应，生成r1-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-trp(r3)反应，生成r1-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-his(r2)反应，生成r1-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh由以下步骤合成：首先合成r1-pyr的活化酯，再与羧基端保护his(r2)–r8反应，生成r1-pyr-his(r2)；合成r1-pyr-his(r2)的活化酯，与羧基端保护trp(r3)-r8反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)的活化酯，与羧基端保护ser(r4)–r8反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)的活化酯，与nh2-tyr(r5)-r8反应，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

本发明所述的亮丙瑞林的液相合成方法中：

r1为boc、z、fmoc或h；

r2为boc、z、bzl、trt、tos、bom、dnp或h；

r3为boc、for、h或z；

r4为bzl、h、tbu、z、boc或tos；

r5为bzl、h、tbu、2，6-di-cl-bzl、me、z或2-cl-z；

r8为ome、oet、otbu、苄酯、硫酯或者有机盐、无机盐。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r1-pro-nhet，脱保护，备用；取羧基r8保护、侧链r7保护的nh2-arg(r7)-or8反应，与α氮端保护的r1-leu-oh反应，生成α氮端保护的r1-leu-arg(r7)-or8；脱r1保护，与r6-d-leu-oh反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到r6-d-leu-leu-arg(r7)-oh，与pro-nhet进行缩合反应后，得到r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r1-pro-nhet，脱保护，再与α氮端保护、侧链r7保护的r1-arg(r7)-oh反应，生成α氮端保护的r1-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与α氮端保护的r1-leu-oh反应，生成α氮端保护的r1-leu-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与r6-d-leu-oh反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-leu的活化酯，然后与羧基端保护leu-r8反应，生成r6-d-leu-leu-or8；合成r6-d-leu-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)–r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8；合成r6-d-leu-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-nhet反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-leu的活化酯，然后与羧基端保护leu-r8反应，生成r6-d-leu-leu-or8；合成r6-d-leu-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)–r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8；合成r6-d-leu-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-oh；生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-oh与nh2et，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet。

本发明所述亮丙瑞林的液相合成方法中：

r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts；r8为ome、oet、otbu、苄酯、硫酯或者有机盐、无机盐。

本发明中的名词说明如下：

其中：r1-pyr为氨基r1保护的焦谷氨酸；

his(r2)为侧链r2保护的组氨酸；

trp(r3)为侧链r3保护的色氨酸；

ser(r4)为侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)为侧链r5保护的酪氨酸；

leu为亮氨酸；

arg(r7)为侧链r7保护的精氨酸；

pro为脯氨酸；

r1-his(r2)为α氮端r1保护、侧链r2保护的组氨酸；

r1-trp(r3)为α氮端r1保护、侧链r3保护的色氨酸；

r1-ser(r4)为α氮端r1保护、侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)-r8为侧链r8保护的酪氨酸；

nh2-his(r2)-r8为羧基端r8保护、侧链r2保护的组氨酸；

nh2-trp(r3)-r8为羧基端r8保护、侧链r3保护的色氨酸；

nh2-ser(r4)-r8为羧基端r8保护、侧链r4保护的丝氨酸；

tyr(r5)-r8为羧基端r8保护、侧链r5保护的酪氨酸；

nh2et为乙基氨；

r1-pro为α氮端r1保护的脯氨酸；

r1-arg(r7)为α氮端r1保护、侧链r7保护的精氨酸；

r1-leu为α氮端r1保护的亮氨酸；

r6-d-leu为α氮端r6保护、d型-亮氨酸。

与现有技术相比，本发明方法采用5+4的片段合成法，由于r8基团的脱除采用新型固定化的酶催化剂，使得常规的皂化反应再酸化得到羟基的方法显得累赘，收率低，操作复杂。本发明方法可以磁性载体固定化酶催化剂脱除羧基保护基，仅一步反应，简洁方便、污水少、收率高。避免了皂化合成周期长、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、易于纯化、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例制得的亮丙瑞林的质谱图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种亮丙瑞林的液相合成方法，所述的亮丙瑞林pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhet是在液相条件下由五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，新型磁性催化剂采用电磁铁吸引与产品进行分离，然后五肽与四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet在缩合剂作用下缩合反应、脱保护而成；

其中：r1为boc、z、fmoc或h；

r2为boc、z、bzl、trt、tos、bom、dnp或h；

r3为boc、for、h或z；

r4为bzl、h、tbu、z、boc或tos；

r5为bzl、h、tbu、2，6-di-cl-bzl、me、z或2-cl-z；

r8为ome、oet、otbu、苄酯、硫酯或者有机盐、无机盐。

所述的羧基与氨基的缩合反应，通过催化剂完成反应，或者通过硫酯转移完成反应，或者通过酰氯反应完成，或者通过混合酸酐完成缩合反应，或者通过活化酯反应完成缩合反应。

实施例2，实施例1所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-or8，再与α氮端保护的r1-ser(r4)反应，生成r1-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱氨基保护后备用；羧基r8保护的nh2-trp(r3)-or8反应，与α氮端保护的r1-his(r2)反应，生成r1-his(r2)-trp(r3)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-oh，与-ser(r4)-tyr(r5)-or8进行缩合反应后，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

实施例3，实施例1所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8由以下步骤合成：首先合成tyr(r5)-or8，再与α氮端保护的r1-ser(r4)反应，生成r1-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-trp(r3)反应，生成r1-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-his(r2)反应，生成r1-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，脱保护，与α氮端保护的r1-pyr反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

实施例4，实施例1所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh由以下步骤合成：首先合成r1-pyr的活化酯，再与羧基端保护his(r2)–r8反应，生成r1-pyr-his(r2)；合成r1-pyr-his(r2)的活化酯，与羧基端保护trp(r3)-r8反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)的活化酯，与羧基端保护ser(r4)–r8反应，生成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)；合成r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)的活化酯，与nh2-tyr(r5)-r8反应，得到r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到高纯五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh。

实施例5，实施例1－4中任意一项所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r1-pro-nhet，脱保护，备用；取羧基r8保护、侧链r7保护的nh2-arg(r7)-or8反应，与α氮端保护的r1-leu-oh反应，生成α氮端保护的r1-leu-arg(r7)-or8；脱r1保护，与r6-d-leu-oh反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8，在新型磁性催化剂fe3o4@silica-α-糜蛋白酶作用下脱除羧基保护基r8，磁性催化剂采用电磁铁吸引方式与产品进行分离，得到r6-d-leu-leu-arg(r7)-oh，与pro-nhet进行缩合反应后，得到r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；

其中：r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

实施例6，实施例1－4中任意一项所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r1-pro-nhet，脱保护，再与α氮端保护、侧链r7保护的r1-arg(r7)-oh反应，生成α氮端保护的r1-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与α氮端保护的r1-leu-oh反应，生成α氮端保护的r1-leu-arg(r7)-pro-nhet；脱保护，与r6-d-leu-oh反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；

其中：r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

实施例7，实施例1－4中任意一项所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-leu的活化酯，然后与羧基端保护leu-r8反应，生成r6-d-leu-leu-or8；合成r6-d-leu-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)–r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8；合成r6-d-leu-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-nhet反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；

其中：r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

实施例8，实施例1－4中任意一项所述亮丙瑞林的液相合成方法中：所述的四肽片段r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet由以下步骤合成：首先合成r6-d-leu的活化酯，然后与羧基端保护leu-r8反应，生成r6-d-leu-leu-or8；合成r6-d-leu-leu的活化酯，与羧基端保护arg(r7)–r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-or8；合成r6-d-leu-leu-arg(r7)的活化酯，与pro-r8反应，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-oh；生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-oh与nh2et，生成r6-d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；最后脱去r6保护得到四肽片段d-leu-leu-arg(r7)-pro-nhet；

其中：r6为boc、z或fmoc；

r7为boc、(boc)2、pbf、tos、no2、h、pmc、hcl、adoc或mts。

实施例9，亮丙瑞林的液相合成方法实验：

一、合成五肽片段r1-pyr-his(r2)-trp(r3)-ser(r4)-tyr(r5)-oh

1、fmoc-his(trt)-trp(boc)-ome的合成：

在100毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-his(trt)-oh(20mmol)，nh2-trp(boc)-ome(20mmol)，hobt(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)和磁子后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3水溶液洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(fmoc-his(trt)-trp(boc)-ome)。

hplc纯度：大于92.2%，收率为91.6％。

2、pyr-his(trt)-trp(boc)-ome的合成：

称取fmoc-his(trt)-trp(boc)-ome(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液50毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量冰乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-his(trt)-trp(boc)-ome)。

在100毫升的圆底烧瓶中加入pyr-oh(20mmol)，nh2-his(trt)-trp(boc)-ome(20mmol)，hobt(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)和磁子后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3水溶液洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(pyr-his(trt)-trp(boc)-ome)。

hplc纯度：大于93.2%，收率为89.5%。

3、fmoc-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome的合成：

在100毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-ser(tbu)-oh(20mmol)，nh2-tyr(tbu)-ome(20mmol)，hobt(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)和磁子后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3水溶液洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(fmoc-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome)。

hplc纯度：大于94.1%，收率为93.6％。

4、pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome的合成：

称取fmoc-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液50毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量冰乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome)。

配制缓冲溶液：缓冲液位30%acn/nah2po4水溶液，ph调为8，备用。

称取pyr-his(trt)-trp(boc)-ome(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入fe3o4@silica-α-糜蛋白酶的缓冲溶液50毫升，在室温下反应3h，检测反应完全，在搅拌下，用电磁铁吸引，将固体都集中于反应瓶底部。缓慢倾倒并过滤固体，用少量缓冲液淋洗，干燥后回收套用。滤液用稀盐酸调节ph值为3-4，减压蒸馏过滤液，除去乙腈及大部分水，加入大量冰乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(pyr-his(trt)-trp(boc)-oh)。

在100毫升的圆底烧瓶中加入pyr-his(trt)-trp(boc)-oh(20mmol)，nh2-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome(20mmol)，hobt(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)和磁子后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3水溶液洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome)。

hplc纯度：大于97.2%，收率为96.8%。

二、合成四肽片段d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet

1、fmoc-pro-nhet的合成

称取fmoc-pro-oh(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升dmf溶解，之后加入hosu(22mmol)，冰水浴下加入dcc(22mmol)的dmf溶液20毫升，室温下反应4小时，滤除沉淀，将溶液浓缩至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完成，滤除沉淀，将溶液除去，用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3洗涤（100ml×3），食盐水洗涤（100ml×3），无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色固体(fmoc-pro-nhet)。

hplc纯度：大于92.5%，收率为94.3％。

2、fmoc-arg(pbf)-pro-nhet的合成

称取fmoc-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液50毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-arg(pbf)-oh(20mmol)，nh2-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(fmoc-arg(pbf)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于94.2%，收率为93.8％。

3、fmoc-leu-arg(pbf)-pro-nhet的合成

称取fmoc-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液50毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-arg(pbf)-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-leu-oh(20mmol)，nh2-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(fmoc-leu-arg(pbf)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于95.1%，收率为90.4％

4、fmoc-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet的合成

称取fmoc-leu-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-leu-arg(pbf)-pro-nhet)。

在50毫升的圆底烧瓶中加入fmoc-d-leu-oh(20mmol)，nh2-leu-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)，hosu(22mmol)，用无水dmf40毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(fmoc-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于93.5%，收率为89.3％

5、d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet的合成

称取fmoc-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/dmf为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(nh2-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet)。

hplc纯度：大于95.5%，收率为97.1％。

三、pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet的合成

配制缓冲溶液：缓冲液位30%acn/nah2po4水溶液，ph调为8，备用。

称取pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-ome(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入fe3o4@silica-α-糜蛋白酶的缓冲溶液50毫升，在室温下反应3h，检测反应完全，在搅拌下，用电磁铁吸引，将固体都集中于反应瓶底部。缓慢倾倒并过滤固体，用少量缓冲液淋洗，干燥后回收套用。滤液用稀盐酸调节ph值为3-4，减压蒸馏过滤液，除去乙腈及大部分水，加入大量冰乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh)。

hplc纯度：大于99.1%，收率为97.9%。

在100毫升的圆底烧瓶中加入pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh(20mmol)，nh2-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)，hobt(22mmol)，用无水dmf50毫升溶解，在冰水浴下加入dcc(22mmol)和磁子后，在室温下搅拌3小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去dmf，之后用大量乙酸乙酯溶解，用饱和nahco3水溶液洗涤（100ml×3），用稀盐酸洗涤（100ml×3），饱和食盐水洗涤（100ml×3），用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet)。

在500毫升的圆底烧瓶中加入pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-leu-leu-arg(pbf)-pro-nhet(20mmol)，在室温下加入脱保护试剂（tfa：苯甲硫醚：水：edt=92:4:2:2）200ml，室温下裂解1.5小时，将裂解液倒入预先冷却好的（0℃）无水乙醚中，搅拌沉降3小时，离心，用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到白色固体。白色产品为pyr-his-trp-ser-tyr-d-leu-leu-arg-pro-nhet。采用制备柱对产品进行纯化制备。hplc纯度：大于99.5%，收率为75.8%；ms＝1268.6703；其质谱图参照图1。