检测TERT基因启动子突变的引物组合物、试剂盒、方法及应用与流程

本发明涉及辅助诊断引物领域，具体而言，涉及一种检测tert基因启动子突变的引物组合物、试剂盒、方法及应用。
背景技术：
：端粒是染色体末端有重复dna序列和相关蛋白组成的特殊结构，具有稳定染色体结构和完整性的功能。端粒酶是核蛋白逆转录酶，由端粒酶逆转录酶(tert)、端粒酶rna组分(tr)以及端粒酶相关蛋白(tep1等)组成。端粒酶以自身rna为模板，合成端粒dna，将端粒dna加至染色体末端，为细胞维持分裂提供遗传基础。端粒酶在正常体细胞中的无活性或低活性，而在生殖细胞，干细胞及癌细胞中活跃。端粒酶逆转录(tert)是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂，调控端粒酶活性。在人类肿瘤研究中发现tert活跃，使得tert成为与异常的细胞增值相关的疾病(例如癌症)的预防，治疗的靶点。tert基因启动子突变最早发现于黑色素瘤，随后研发发现，tert启动子区突变广泛存在于黑色素瘤、膀胱癌、甲状腺癌、乳腺癌、肝癌，恶性胶质瘤等多种病变组织中。胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中发病率最高、治疗最困难、预后最差的原发性肿瘤。tert启动子区突变和胶质瘤病理类型及不良预后密切相关，是一个重要的分子标志物，可以用于胶质瘤辅助分型和预后判断，同时也是一个潜在的肿瘤分子治疗靶点。tertc228t/c250t突变与年龄，性别，肿瘤大小，侵袭及转移复发及死亡均有一定的相关性。因此tert基因启动子突变被认为是致癌突变。tert基因启动子c228t与c250t突变位于atg翻译起始位点上游-124c>t和-146c>t。c228t与c250t二者表现互斥，单一突变即可实现对tert的调节。具体分析发现这2个突变可以形成11个碱基的核苷酸伸展5’-ccccttccggg-3’，其中包含与ets转录因子结合位点ggaa，ets因子靶向作用于mapk信号转导通路。c228t/c250t这2个突变提高了tert启动子转录活性；促进癌症细胞的永生，导致病情恶性程度增加，治疗难度加大及预后不良。目前，检测tert基因启动子突变的方法有sanger测序，qpcr法等。sanger测序对突变的检测限不够，不适合低频突变的检测。而包括ddpcr在内的qpcr法，检测时需要设阴性对照和阳性对照，对样本dna量需求也较大。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种检测tert基因启动子突变的引物组合物、试剂盒、方法及应用，以解决现有技术中检测复杂的问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测tert基因启动子突变的引物组合物，该引物组合物包括：tert-1f(seqidno:1)：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgggctcccagtggattcg；tert-2f(seqidno:2)：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacagacgcccaggaccg；tert-3f(seqidno:3)：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacccgtcctgccccttca；tert-1r(seqidno:4)：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctncgcggaaaggaaggggag；tert-2r(seqidno:5)：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggctgggagggcccgga；tert-3r(seqidno:6)：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggcttcccacgtgcgcagcagga；其中，n代表的是barcode序列，barcode序列的碱基数为4-12nt，tert-1r、tert-2r和tert-3r上的barcode序列各不相同。进一步地，引物组合物还包括：通用引物(seqidno:7)：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct；index1引物(seqidno:8)：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；index2引物(seqidno:9)：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；ndex3引物(seqidno:10)：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；其中，h代表的是index序列，index序列的碱基数为4-12nt，index1引物、index2引物及index3引物上的index序列各不相同。根据本申请的第二个方面，提供了一种检测tert基因启动子突变的试剂盒，试剂盒包括针对tert基因启动子的引物，引物为上述任一种引物组合物。根据本申请的第三个方面，提供了一种检测tert基因启动子突变的方法，该方法包括：利用上述任一种引物组合物构建包含tert基因启动子的测序文库；采用高通量测序的方法对测序文库进行检测。进一步地，利用上述任一种的引物组合物构建包含tert基因启动子的测序文库包括：步骤s1，利用上述引物组合物对不同样本的tert基因启动子区域进行扩增，得到第一扩增产物；步骤s2，利用上述的通用引物和index引物对第一扩增产物进行再次扩增，得到包含tert基因启动子的测序文库。进一步地，在步骤s1和步骤s2之间，方法还包括纯化的步骤。进一步地，纯化采用磁珠纯化。根据本申请的第四个方面，提供了上述任一引物组合物在制备检测tert基因启动子突变相关的癌症的试剂盒中的应用。进一步地，tert基因启动子突变相关的癌症包括黑色素瘤、膀胱癌、甲状腺癌、乳腺癌、肝癌及恶性胶质瘤。应用本发明的技术方案，通过设计涵盖tert基因启动子c228t、c250t突变位点的正、反向引物序列，其扩增产物不仅可以包含突变位点c228t、c250t，而且还可以包括所有其他的潜在突变位点。进一步地，对上述引物的扩增产物进行第二轮pcr扩增，补全接头序列，纯化后直接通过高通量测序方法对上述突变进行检测，具有操作简单、灵敏度高和成本低等优点。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了根据本发明实施例1中第一轮pcr的扩增产物的电泳检测图；图2示出了根据本发明的实施例1的方法所构建的文库的插入片段大小的检测图；以及图3示出了根据本发明的实施例3中第一轮pcr的扩增产物的电泳检测图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。术语解释：barcode和index：都是一组信息的标识，在高通量测序中通常由a、t、c和g四种碱基按照特定顺序排序组合形成的一段特异性的序列来形成。本申请中，将与所构建的文库的目的片段连在一起的序列称为barcode，用于标识不同的样本；将设置在所构建文库的接头上的序列称为index，用于标识不同的文库。如
背景技术：
所提到的，现有的方法在检测tert基因启动子突变时，存在不适合对这类低频突变进行检测的缺陷，为了实现对tert基因启动子突变的检测，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种检测tert基因启动子突变的引物组合物，该引物组合物包括：tert-1f：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgggctcccagtggattcg；tert-2f：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacagacgcccaggaccg；tert-3f：acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacccgtcctgccccttca；tert-1r：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctncgcggaaaggaaggggag；tert-2r：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggctgggagggcccgga；tert-3r：gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggcttcccacgtgcgcagcagga；其中，n代表的是barcode序列，barcode序列的碱基数为4-12nt，tert-1r、tert-2r和tert-3r上的barcode序列各不相同。上述序列中，下划线标准的为接头的部分序列，黑体加粗部分的序列为tert基因特异序列，barcode序列用于区分样本。利用本申请的上述引物组合物，对tert基因启动子的扩增效率高，且其引物中含有高通量测序文库中常用的接头序列，便于利用高通量测序的方式来实现对该低频突变位点的检测。上述引物组合物中，三对引物能够扩增tert基因启动子区域，并且包含了已知突变位点c228t和c250t以及可能的未知突变位点的扩增片段，对这样的扩增片段进行检测能够一次性地检测已知及可能的未知的低频突变。操作简单，且检测效率高。为了进一步提高检测的效率，在一种优选的实施例中，上述引物组合物还包括：通用引物：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct；index1引物：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；index2引物：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；index3引物：caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga；其中，h代表的是index序列，index序列的碱基数为4-12nt，index1引物、index2引物及index3引物上的index序列各不相同。上述引物与前述引物有部分接头序列重叠，其中的index序列用于区分不同的文库。通过结合高通量测序平台的通用引物及带有文库标签的引物对各样本的文库进行扩增，提高了高通量测序的便利性。在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种检测tert基因启动子突变的试剂盒，该试剂盒包括针对tert基因启动子的引物，引物为上述任一种引物组合物。将上述引物组合物整合到一个试剂盒中，有利于提高针对tert基因启动子的高通量测序文库的构建效率，进而提高检测效率。在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种检测tert基因启动子突变的方法，该方法包括：利用上述任一种引物组合物构建包含tert基因启动子的测序文库；采用高通量测序的方法对测序文库进行检测。该方法不仅能够实现对低dna起始量(起始量低至3.3ng)的tert基因启动子突变的低频检测，而且该方法具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。在一种优选的实施例中，利用上述任一种引物组合物构建包含tert基因启动子的测序文库包括：步骤s1，利用上述引物组合物对不同样本的tert基因启动子区域进行扩增，得到第一扩增产物；步骤s2，利用上述引物组合物中的通用引物和index引物对第一扩增产物进行再次扩增，得到包含tert基因启动子的测序文库。上述方法通过两步pcr的方法即可完成文库的构建。在一种优选的实施例中，在步骤s1和步骤s2之间，方法还包括纯化的步骤。在一种优选的实施例中，纯化采用磁珠纯化。磁珠纯化的产物的纯度高。在一种具体的实施例中，利用上述引物组合物进行tert基因启动子突变检测的方法，包括如下步骤：(1)dna提取；(2)第一轮pcr：(3)第一轮pcr产物纯化；(4)第二轮pcr；(5)第二轮pcr产物纯化：(6)文库定量上机；(7)数据分析。在本申请第三种典型的实施方式中，提供了上述任一种引物组合物在制备检测tert基因启动子突变相关的癌症的试剂盒中的应用。由于tert基因启动子突变与多种癌症具有相关性，因而，对该基因的启动子的检测具有一定的指导意义。具有相关的癌症包括现有已经报道的，也包括将来发现的相关的，都可以通过对该基因启动子的检测来提供一定的指导作用。在一种优选的实施例中，tert基因启动子突变相关的癌症包括黑色素瘤、膀胱癌，恶性胶质瘤、甲状腺癌以及皮肤癌。下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。实施例1对两例甲状腺穿刺样本检测tert基因启动子突变1.dna提取取穿刺样本2针，用qiagenffpedna试剂盒进行提取。2.第一轮pcr：冰上配制如表1所示的pcr反应体系。表1：反应条件：98℃5min；95℃30s，68℃30s，72℃1min，30个循环；72℃，5min；12℃hold。两个样本分别用两个不同barcode的引物进行第一轮pcr，并对第一轮pcr产物进行电泳检测，检测结果见图1。3.pcr产物纯化补体积到50ul，加入0.5xamp磁珠(提前孵育至室温)(25ul)，混匀，静止5min，放到磁力架上2min，取上清到新管，加入0.5x磁珠(仍是25ul)，混匀，静止5min，放到磁力架上5min，去上清，磁珠经80％乙醇洗两次，干燥5-10min,加入21ul无rna酶水溶解dna。4.第二轮pcr将两个pcr纯化产物，等质量混合，到50ng，作为第二轮pcr模板按照表2所示的体现进行第二轮pcr。表2：成分体积5xbuffer10ul2.5mmdntp4ulfastpfu1ul10umuniversalprimer1ul10umindexprimer1ul上一步dna产物xwater34-xtotal50ul反应条件：98℃3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，8个循环；72℃，5min；12℃hold。5.第二轮pcr产物纯化pcr产物，加入0.8x磁珠(40ul)，混匀，静止5min，放到磁力架上5min，去上清，磁珠经80％乙醇洗两次，干燥5-10min，加入20ul无rna酶水溶解dna。6.文库定量及上机：使用qubit对文库测定文库浓度。采用labchip检测文库片段大小及纯度峰图，检测结果见图2。7.数据分析：每个样本测序数据量0.15g，>50000x测序深度。测序的结果经过数据处理及生物信息学分析之后得到检测基因的突变情况。两例穿刺样本，检测结果如下表3.表3：样本c228t(突变频率)cc242-243ttc250t样本1阴性阴性阴性样本2阳性(26％)阴性阴性样本2样本随后用ddpcr方法检测到c228t突变频率为29％。两种方法的结果接近，说明本方法的可行性。实施例2：灵敏度分析取c228t检测阳性的样本dna(突变频率42％)，用c228t阴性的人类基因组dna稀释，使其突变频率分别为5％，2.5％，1％，0.5％。按实施例1中的检测方法进行检测。检测结果见表4。表4:混样样本5％2.5％1％0.5％ngs测试c228t突变频率4.2％2.1％0.8％0.4％表4的结果表明，本发明的引物组合物采用高通量测序的方法的灵敏度可以检测到c228t.5％的突变样本。实施例3：不同类型dna检测tert启动子突变选择穿刺样本和ffpe样本提取质量较差的dna(提取浓度低，降解严重)，按实施例1中方法进行检测，其中dna起始量调整为3～15ng范围。第一轮pcr产物进行电泳检测，检测结果见表5和图3，从图3中可以看出3～13ngdna也可以实现目的片段的扩增，所有样本均可正常建库测序。表5:以上实施例仅选用穿刺样本和ffpe样本进行研究，但对于应用本发明技术方案检测新鲜手术组织，血液以及突变含量低的体液的tert基因启动子突变检测研究亦属于本发明范畴。从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明设计的涵盖tert基因启动子c228t、c250t突变位点的正、反向引物序列，其扩增产物不仅可以包含突变位点c228t、c250t，而且还可以包括所有其他的潜在突变位点，例如cc243-244tt双突变。对pcr扩增产物进行第二轮pcr扩增，补全接头序列，纯化后和直接测序，从而检测tert基因启动子包括c228t、c250t在内的各种突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。本发明的引物组合物包括但不限于上述序列，引物碱基的删减以及引物相对基因组位置的上下移动都属于本发明保护范围。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京优迅医学检验实验室有限公司<120>检测tert基因启动子突变的引物组合物、试剂盒、方法及应用<130>pn100735yxyx<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>52<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1acactctttccctacacgacgctcttccgatctcgggctcccagtggattcg52<210>2<211>51<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacagacgcccaggaccg51<210>3<211>52<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>3acactctttccctacacgacgctcttccgatctcacccgtcctgccccttca52<210>4<211>51<212>dna<213>智人(homosapiens)<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>n代表的是barcode序列，barcode序列的碱基数为4-12nt<400>4gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctncgcggaaaggaaggggag51<210>5<211>50<212>dna<213>智人(homosapiens)<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>n代表的是barcode序列，barcode序列的碱基数为4-12nt<400>5gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggctgggagggcccgga50<210>6<211>56<212>dna<213>智人(homosapiens)<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>n代表的是barcode序列，barcode序列的碱基数为4-12nt<400>6gactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnggcttcccacgtgcgcagcagga56<210>7<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(58)<223>通用引物<400>7aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>8<211>41<212>dna<213>人工序列(artificalsequence)<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>h代表的是index序列，index序列的碱基数为4-12nt<220><221>misc_feature<222>(1)..(41)<223>index1引物<400>8caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga41<210>9<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>h代表的是index序列，index序列的碱基数为4-12nt，<220><221>misc_feature<222>(1)..(41)<223>index2引物<400>9caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga41<210>10<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>h代表的是index序列，index序列的碱基数为4-12nt<220><221>misc_feature<222>(1)..(41)<223>index3引物<400>10caagcagaagacggcatacgagathgtgactggagttcaga41当前第1页12