一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法与流程

本发明涉及外泌体的制备和分离技术，具体涉及一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法。

背景技术：

外泌体(exosomes)是一种具有脂质双分子层，直径约30-150nm的细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)。外泌体内可包含蛋白质、脂质、核酸类等多种生物活性物质，人体大部分细胞如免疫细胞(t细胞、b细胞、kupffer细胞和nk细胞)、内皮细胞、血小板等均能分泌外泌体。目前，外泌体在临床治疗上的研究可以大致归纳为：(1)调节外泌体的释放及分布。(2)基于外泌体的药物传递。(3)外泌体介导的肿瘤靶向治疗。(4)外泌体与免疫治疗。目前，外泌体在结核病的免疫治疗，在骨肿瘤、肝癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌症的诊断、抑制或调控肿瘤细胞转移、预后监测和治疗中均表现出巨大的应用前景。另外，细胞外泌体作为细胞与细胞间相互交流的一种载体，同时也是干细胞旁分泌活动的重要方式，在组织再生中发挥着重要作用，近年来的研究表明，mscs外泌体具有类似mscs的功能，包括修复与再生组织、抑制炎症反应及调节机体免疫。

car-t细胞疗法(car-ttherapy)是利用经过基因改造的t细胞杀死癌细胞，该方法已经被证实是当其他治疗方法都失败时的一种有前途的选择。而在一项新的研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校和明尼苏达大学的研究人员报道利用人诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,ips细胞)培养出的并且以与car-t细胞相似的方式加以修饰的自然杀伤细胞(naturalkillercell,nk细胞)在小鼠模型中高效地抵抗卵巢癌。而有报道称nk细胞外泌体具有nk细胞部分的功能，且更小，特异性更好，有望在细胞治疗方面发挥独特作用。

近年来，有研究表明nk细胞可以分泌具有nk细胞标记物和杀伤蛋白的外泌体，对肿瘤细胞造成杀伤作用，此外，由于外泌体具备向定向靶器官转移的特性，可将其设计成为精准给药的药物载体，将特定药物运输到靶器官发挥作用。因此，nk细胞的外泌体在肿瘤治疗及药物靶向载体的应用研究中具有很大潜力。目前对于外泌体的提取和纯化主要依据外泌体的理化特性进行，常见采用差速离心联合蔗糖密度梯度离心法、超滤法、免疫磁珠提取法和exoquickprecipitation提取法等方法。

目前，生物反应器是细胞大规模悬浮培养的核心设备，能够有效的增加细胞单位体积的培养密度。动物细胞培养生物反应器根据其内部是否有搅拌桨，分为搅拌式细胞培养生物反应器和非搅拌式细胞培养生物反应器。搅拌式细胞培养反应器通过搅拌桨旋转产生涡流，完成对培养液的曝气供氧，但这种方式产生的机械剪切力较大，极易损伤细胞。目前，只能通过控制搅拌转速来减轻对细胞的影响，但问题依然存在。而非搅拌式细胞培养反应器产生的剪切力小，主要采用震动、摇动、滚动或摆动等方式使培养液运动，保持细胞的悬浮状态及培养液的气体交换。其缺点是难以保证氧气的吸收效率。近年来也有采用空气或氧气喷射解决培养液中氧气供给的方法，但这种方法易产生大量泡沫，泡沫破裂过程中也会对细胞造成物理损伤，过量的氧气喷射也会使细胞受毒害。对气体喷射的精密控制也使反应器设备复杂化，增加了细胞培养的成本。因此，如何提供均匀的搅拌，使培养液和细胞充分混合以保持足够的供氧，同时减少对细胞的机械剪切损伤是一个急需解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法，采用脉冲搅拌式生物反应器培养细胞，包括以下步骤：

(1)加注培养基：打开生物反应器开关，开启培养液加注口阀门，加注培养基，灌满细胞培养腔；

(2)接种:控制接种口阀门开启，接种细胞；

(3)刺激细胞：打开磁力搅拌及脉冲装置，模拟体内血液结构的细胞生长环境，刺激细胞分泌外泌体；

(4)监测并调节培养条件：监测芯片实时监测细胞培养环境，并通过主机调节培养条件；

(5)分离收集外泌体：细胞在培养装置中生长2天后，开启过滤泵，使培养液通过分离收集装置，收集终产物外泌体。

进一步地，步骤(2)中，接种密度为2×10⁵/ml的nk92mi细胞。

进一步地，步骤(3)中，设置磁力搅拌器转速为50rmp，脉冲频率调为72次/min，来模拟体内血液结构的细胞生长环境，刺激细胞分泌外泌体。

进一步地，步骤(4)中，培养条件设置为液体溶氧95％，二氧化碳浓度为5％，ph为7.3。

进一步地，所述生物反应器包括细胞培养装置、外泌体分离收集装置；

所述细胞培养装置用于培养细胞并刺激细胞分泌外泌体；所述外泌体分离收集装置连接细胞培养装置，并能够将外泌体从细胞培养装置内的培养液中分离出来进行收集，分离后，细胞留于细胞培养装置内；

所述细胞培养装置包括搅拌装置，被配置为用于向细胞培养装置中的培养液施加搅拌动力；

所述细胞培养装置包括脉冲装置，用于向细胞培养装置以脉冲方式加入培养液，从而对细胞培养装置内被培养的细胞进行刺激。

所述细胞培养装置还包括细胞培养腔，细胞培养腔用于进行细胞培养和外泌体分泌。

进一步地，所述细胞培养腔上设有接种口、培养液加注口和加样口。

进一步地，所述搅拌装置位于细胞培养腔的下方，所述搅拌装置采用磁力搅拌装置，所述磁力搅拌装置包括磁力搅拌棒以及磁力驱动装置，磁力搅拌棒能够在磁力驱动装置的驱动下进行搅拌；所述磁力搅拌棒的转速可以通过磁场强度进行调整。

进一步地，所述脉冲装置包括脉冲泵，脉冲泵通过液体管道与细胞培养腔连通。

进一步地，所述分离收集装置包括位于细胞培养腔底部的初步分离装置，初步分离装置包括初步分离腔，初步分离腔与细胞培养腔连通；

所述分离收集装置包括多层过滤装置，所述多层过滤装置通过过滤管道连接至初步分离腔，所述多层过滤装置的出口连接产物收集罐。

进一步地，所述生物反应器还包括条件监控装置及调节装置，所述条件监控装置包括ph值监测探头、co2含量监测探头、o2含量监测探头以及条件加样装置，ph值监测探头、co2含量监测探头、o2含量监测探头置于细胞培养腔内；条件加样装置位于细胞培养腔外，条件加样装置与细胞培养腔连通，条件加样装置能够根据探头所探测到的信息对细胞培养腔进行加样。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过在初步分离腔中通入氧气及二氧化碳，在磁力搅拌装置的作用下，使氧气及二氧化碳先溶于培养基中，再通过连通初步分离腔与细胞培养腔的第一滤膜进入细胞培养腔中，可以使培养液和细胞充分混合以保持足够的供氧，而且搅拌装置不直接接触细胞，减小了细胞所受剪切力，可以有效解决背景技术中的问题，同时，双向脉冲泵的加入能够有效模拟脉搏的跳动，充分模拟了体内nk细胞生长环境，能够刺激nk细胞或其他悬浮细胞及可以悬浮培养的贴壁细胞大量分泌细胞产物，例如：外泌体，血小板，各种细胞因子等。本发明的方案不仅可以用于nk细胞，还可以用于接种其他类型的细胞，例如巨噬细胞，t淋巴细胞，b淋巴细胞。

(2)采用本发明的生物反应器及方法能较为便捷地大量生产外泌体，设计巧妙，操作简单，能够满足实验室或工厂对外泌体生产的要求。越来越多研究证实，外泌体在多个方面发挥着重要作用，特别是细胞治疗和组织再生方面。另外，该生物反应器也可用于培养其他悬浮细胞或个别贴壁细胞的悬浮培养，或产生其他细胞产物，具有广阔的应用前景。

(3)本发明提供了一种简单，快速大量产生nk细胞外泌体或其他细胞外产物的方法，且该方法适用范围广泛，大到工厂，小到实验室，皆可使用，应用前景广泛。

附图说明

图1为本发明脉冲搅拌式生物反应器的结构示意图。

图2为细胞培养装置的结构示意图。

图3为细胞培养装置的爆炸图。

图4为多层过滤装置的爆炸图。

图5为培养nk92mi细胞48小时后，分别收集30ml静置培养和使用本发明生物反应器和方法培养的反应液，获得的外泌体产物的定量分析结果(其中，***代表p＜0.001有非常显著差异)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，应当指出的是，具体实施方式只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限定。

在本发明中，接种的细胞为nk细胞，但不局限于nk细胞，还可以为巨噬细胞，淋巴t细胞，血细胞等悬浮细胞或能够悬浮生长的贴壁细胞。

在本发明中，搅拌装置可为磁力搅拌装置，但不局限于磁力搅拌装置，还可以为机械搅拌装置或其他搅拌方式。

在本发明中，位于初步分离腔与细胞培养腔之间，使细胞留于细胞培养腔的截留装置为滤膜，但不局限于滤膜，还可为其他多孔材料。

在本发明中，双向脉冲流由脉冲泵产生，该脉冲流的产生还可以由其他具有类似功能的装置产生。

在本发明中，外泌体分离过滤系统由膜过滤系统组成，外泌体的分离工作还可用其他方式完成，如：密度梯度离心，超速离心等。

本发明中，收集的细胞产物为外泌体，但不局限于外泌体，还可以为各类细胞分泌物：如血小板，胶原蛋白等。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

具体实施例：

本发明的一种用于外泌体的分泌、分离和收集的脉冲搅拌式生物反应器，包括细胞培养装置、外泌体分离收集装置；

所述细胞培养装置用于培养细胞并刺激细胞分泌外泌体；所述外泌体分离收集装置连接细胞培养装置，并能够将外泌体从细胞培养装置内的培养液中分离出来进行收集，分离后，细胞留于细胞培养装置内；

所述细胞培养装置包括搅拌装置，被配置为用于向细胞培养装置中的培养液施加搅拌动力；

所述细胞培养装置包括脉冲装置，用于向细胞培养装置以脉冲方式加入培养液，从而对细胞培养装置内被培养的细胞进行刺激，通过搅拌和脉冲作用形成动态模拟体内血液结构的细胞生长环境。

在一些优选的方式中，所述细胞培养装置还包括细胞培养腔1-8，细胞培养腔1-8用于进行细胞培养和外泌体分泌。

在一些优选的方式中，所述细胞培养腔1-8上设有接种口1-9、培养液加注口1-10和加样口1-11。

本实施例中，如图1所示，细胞培养腔1-8上表面设有接种口1-9、培养液加注口1-10、加样口1-11；其中，接种口1-9可以用于接种细胞，培养液加注口1-10可以用于向细胞培养腔1-8中加注液体培养基；加样口1-11可以用于加入调节液体，来调节细胞培养腔1-8中的ph值。

在一些优选的方式中，脉冲装置连接细胞培养腔1-8，可以向细胞培养腔1-8中以脉冲方式加入培养液，对细胞培养腔1-8内被培养的细胞进行刺激。

本实施例中，如图1所示，脉冲装置包括脉冲泵1-12，脉冲泵1-12通过液体管道1-13与细胞培养腔1-8连通。脉冲时间及强度可通过控制脉冲泵1-12的停止，运行和强度进行调节。

在一些优选的方式中，搅拌装置位于细胞培养腔1-8的下方。

在一些优选的方式中，所述搅拌装置采用磁力搅拌装置，所述磁力搅拌装置包括磁力搅拌棒1-6以及位于底座1-1上的磁力驱动装置，磁力搅拌棒1-6能够在磁力驱动装置的驱动下进行搅拌。

本实施例中，如图1所示，磁力驱动装置为磁力搅拌器1-2，磁力搅拌器1-2与磁力搅拌棒1-6均位于细胞培养腔1-8的下方，磁力搅拌棒1-6位于磁力搅拌器1-2的上方。

在一些优选的方式中，磁力搅拌棒1-6的转速可以通过磁场强度进行调整，所述磁场强度的调整范围是30-150rpm。

在一些优选的方式中，如图2-3所示，所述分离收集装置包括位于细胞培养腔1-8底部的初步分离装置，初步分离装置包括初步分离腔1-5，初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8连通，初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8之间设有第一滤膜及支撑装置1-7，由于滤膜的作用，细胞被留在细胞培养腔1-8中。

在一些优选的方式中，如图1所示，所述分离收集装置还包括多层过滤装置与收集装置，所述多层过滤装置2-4通过过滤管道2-1连接至初步分离腔1-5，所述多层过滤装置2-4的出口连接至产物收集罐2-2。

在一些优选的方式中，如图4所示，多层过滤装置2-4包括第一过滤腔2-4-1，第二过滤腔2-4-3，第三过滤腔2-4-5，第四过滤腔2-4-7，第二滤膜及支撑装置2-4-2，第三滤膜及支撑装置2-4-4，第四滤膜及支撑装置2-4-6。第二滤膜及支撑装置2-4-2，第三滤膜及支撑装置2-4-4，第四滤膜及支撑装置2-4-6的滤膜孔径依次变小。

机控的过滤泵间歇性工作产生的对细胞培养腔1-8的压力为主要的驱动液体通过滤膜的动力。

在一些优选的方式中，本发明的生物反应器还包括条件监控装置；条件监控装置能够实时监测细胞培养腔1-8内细胞生长环境状态。

在一些优选的方式中，所述条件监控装置包括ph值监测探头3-1-3、co2含量监测探头3-1-1、o2含量监测探头3-1-2以及条件加样装置，ph值监测探头3-1-3、co2含量监测探头3-1-1、o2含量监测探头3-1-2置于细胞培养腔1-8内；条件加样装置位于细胞培养腔1-8外，条件加样装置与细胞培养腔1-8连通，条件加样装置能够根据探头所探测到的信息对细胞培养腔1-8进行加样。

条件监控装置通过ph值监测探头3-1-3、co2含量监测探头3-1-1、o2含量监测探头3-1-2对细胞培养腔1-8中的环境进行及时的监控。

本实施例中，条件加样装置包括调节液体容器1-111，o2罐1-14、co2罐1-15；调节液体容器1-111连通至细胞培养腔1-8内，o2罐1-14、co2罐1-15分别通过o2输送管1-4、co2输送管1-3与初步分离腔1-5连通，初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8连通；

通过在初步分离腔1-5中通入氧气及二氧化碳，在磁力搅拌装置的作用下(因为磁力搅拌棒1-6处于初步分离腔1-5中，如图3所示，磁力搅拌器1-2通过磁场使磁力搅拌棒1-6转动)，使氧气及二氧化碳先溶于培养基中，再通过连通初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8的第一滤膜进入细胞培养腔1-8中，可以使培养液和细胞充分混合以保持足够的供氧，而且搅拌装置不直接接触细胞，减小了细胞所受剪切力。

在一些优选的方式中，本发明的生物反应器还包括调节装置，调节装置可以调节与控制细胞培养腔内的培养条件。

本实施例中，调节装置包括液体释放开关(数控)3-2、主机3-3、o2罐、co2罐气体阀门(数控)3-4、脉冲泵调节器(数控)3-5。

主机3-3控制自动调控系统可以自动调节细胞培养腔1-8内的培养条件。

本发明还提供了一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法，采用以上所述的生物反应器，包括以下步骤：

(1)加注培养基：打开生物反应器开关，控制培养液加注口1-10阀门开启，加注培养基，灌满细胞培养腔1-8；培养基可以选用培养nk92mi细胞时所常用的现有的培养基即可。

(2)接种：控制接种口1-9阀门开启，接种密度为2×10⁵/ml的nk92mi细胞；

(3)刺激细胞：打开磁力搅拌及脉冲装置，设置磁力搅拌器转速为50rmp，脉冲频率调为72次/min，模拟体内细胞生长环境，形成湍流刺激nk细胞分泌外泌体；

(4)监测并自动调节培养条件：监测芯片3-1实时监测细胞培养环境，并通过主机3-3控制的自动调控系统自动调节培养条件，培养条件设置为液体溶氧95％，二氧化碳浓度为5％，ph为7.3，本实施例中，可以通过控制o2、co2和调节液体容器1-111中的调节液体的加样量与加样速度来实现培养条件的控制与调节；

(5)外泌体分离收集：细胞在细胞培养腔1-8中生长2天后，开启过滤泵2-3，使培养液通过分离收集装置，最终收集到终产物外泌体；本实施例中，培养液先通过第一滤膜及支撑装置1-7进入初步分离腔1-5，然后，培养液进入过滤管道2-1，通过多层过滤装置2-4，进行层层过滤，最终，终产物外泌体进入产物收集罐2-2；

(6)清理消毒生物反应器，以备下一次使用。

本发明的设备的特点在于：通过机械搅拌及脉冲作用，形成动态的模拟体内血液结构的细胞生长环境，并通过条件监控装置与调节装置实时监测并调整培养腔内细胞生长环境状态，最后通过膜过滤系统分离，并收集终产物。所述机械搅拌及脉冲作用是指，通过将磁力搅拌棒1-6置于初步分离腔1-5，通过磁场使磁力搅拌棒1-6转动，位于初步分离腔1-5中的液体随之转动并影响到细胞培养腔1-8的环境，使之产生连续的波动，同时，配合脉冲泵1-12间歇性的泵入营养液，使培养腔内产生脉冲式的波动。磁力搅拌棒1-6转速可以通过磁场强度进行调整，可调范围为30-150rpm，脉冲时间及强度可通过控制脉冲泵1-12的停止，运行和强度进行调节。

所述分离收集装置包括初步分离装置、多层过滤装置与收集装置；初步分离装置包括初步分离腔1-5，初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8连通，初步分离腔1-5与细胞培养腔1-8之间设有第一滤膜及支撑装置1-7，由于滤膜的作用，细胞被留在细胞培养腔1-8中；多层过滤装置2-4的膜过滤分离系统包括若干不同的，孔径逐渐变小的滤膜及多个过滤腔，可以将滤液进行多次过滤，最终收集到产物。

采用以上所述的生物反应器和方法，培养nk92mi细胞，同时，采用传统生物反应器(即采用t25培养瓶培养)，静置培养的方法进行培养，作为对比例，对比例的其他培养条件与本实施例相同。

图5为培养nk92mi细胞48小时后，分别收集30ml传统细胞培养方式(即静置培养，用t25培养瓶培养，其他条件与本实施例相同)和30ml使用本发明生物反应器和方法培养的反应液，获得的外泌体产物的定量分析结果(其中，***代表p＜0.001有非常显著差异)。由图5可知，使用本发明生物反应器和方法进行培养，能够获得较多的外泌体，本发明生物反应器和方法有利于nk92mi细胞的生长，能够刺激nk92mi细胞大量分泌外泌体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。