本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别是涉及一种vps39基因k87r突变检测的试剂盒。
背景技术：
帕金森病(parkinson’sdisease，pd)，又称为震颤麻痹(paralysisagitans)，是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群pd的患病率大约是1.7％。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,da)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体da含量显著性减少而致病。临床上将pd分为特发性/散发性pd、家族性/遗传性pd、继发性pd和帕金森综合征。到目前为止，帕金森病确切病因尚不十分清楚，且无有效的治疗和治愈手段，因此对于疾病的预防显得尤为重要，而帕金森病多数与遗传相关，对有帕金森病家族史患者进行遗传性筛查显得尤为重要。
目前遗传研究发现，lrrk2、snca、vps35、gch1、atxn2、dnajc13、tmem230、gigyf2、htra2、ric3、eif4g1、uchl1、chchd2以及gba基因突变能够导致常染色体显性帕金森病的发生；prkn、pink1、dj1、atp13a2、pla2g6、fbxo7、dnajc6、synj1、spg11、vps13c、podxl以及ptrhd1基因突变能够导致隐性常染色体帕金森病的产生；以及rab39b基因能够导致伴随x染色体帕金森病的发生，然而许多帕金森病患者遗传风险因素未知，同时目前尚无有研究表明vps39基因突变能够导致帕金森病的发生。
肽核酸(peptidenucleicacids，pna)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的dna类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的dna类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了dna中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与dna相同，pna可以通过watson-crick碱基配对的形式识别并结合dna或rna序列，形成稳定的双螺旋结构。由于pna不带负电荷，与dna和rna之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于dna与dna或rna间的杂交，pna与dna或rna的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与dna或rna分子的杂交能力远优于dna/dna或dna/rna，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
本发明采用特异序列的pna寡聚物作为探针。由于pna是一种人工合成的核酸的类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优势，大大提高了检测灵敏度。
技术实现要素：
我们在患有帕金森病的家系中通过遗传学手段筛查首次发现vps39基因k87r突变能够导致帕金森病的产生，因此vps39基因可用于帕金森病病因的诊断。
本发明的目的在于提供vps39基因在制备帕金森病病因诊断试剂或诊断试剂盒中的应用，通过检测vps39基因k87r突变进行帕金森病病因的诊断。即所述的帕金森病病因诊断试剂或诊断试剂盒为vps39基因k87r突变检测的试剂或试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种vps39基因k87r突变检测的试剂，包括：
用于特异性扩增vps39基因k87r突变的正向引物vps39-f：5'-agtgccgatcctagaaaagct-3'；
与vps39基因k87r突变型互补的反向pna荧光探针引物vps39(pna)-p-r：5'-荧光报告基团-gaccagaatcctaaactggga-淬灭基团-3'；其中，荧光报告基团包括fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3、cy5等，淬灭基团包括tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl等。
进一步地，所述的vps39基因k87r突变检测的试剂，包括pcr反应试剂，如具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、pcrbuffer、含mg离子的溶液等。
进一步地，所述的vps39基因k87r突变检测的试剂，包括阳性参考品和阴性参考品。所述的阳性参考品为携带有序列如seqidno.3所示片段的质粒dna，浓度优选为3ng/μl；seqidno.3所示序列为250bp长度的vps39基因第5外显子k87r突变的序列。所述的阴性参考品为携带有序列如seqidno.4所示片段的质粒dna，浓度优选为3ng/μl；seqidno.4所示序列为250bp长度的vps39基因第5外显子野生型序列。
一种vps39基因k87r突变检测的试剂盒，包括上述试剂。
上述试剂或试剂盒检测vps39基因k87r突变是联合pcr方法使用的肽核酸(pna)荧光探针方法，其原理为：通过构建与vps39基因突变型互补的一段pna荧光探针作为反向引物，当pna序列与vps39基因互补结合时，任一突变均可导致pna/dna产生错配，从而使得溶解温度发生改变。进而根据vps39基因突变型设计特异性的pna荧光探针以及正向引物对vps39突变型基因进行荧光定量pcr扩增，经过pcr扩增后，即可将vps39基因突变型与野生型进行区分开来。
使用上述试剂或试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样本的dna；所述的待检样本包括病人的血液，甲醛固定石蜡包埋的样本和新鲜组织样本。
(2)配制pcr反应液进行实时荧光定量pcr，所述的pcr反应液包含：dna模板、正向引物vps39-f、反向pna荧光探针引物vps39(pna)-p-r、水、具有5'→3'外切活性的dna聚合酶、dntps、10×pcrbuffer和含mg离子的溶液。其中dna模板为提取的待检样本的dna、阳性参考品或阴性参考品。
(3)根据阳性参考品、阴性参考品、待检样本dna实时荧光定量pcr的ct值以及对应的△rn值(标准指示信号值减去基线信号值)，对结果进行判断：当ctm≤cta＜ctw以及△rn(w)＜△rn(a)≤△rn(m)时，表明该样本存在突变；当ctw＝cta以及△rn(a)≤△rn(w)时，表明该样本为野生型；其中，cta表示待检样本ct值，ctw表示阴性参考品ct值，ctm表示阳性参考品ct值，△rn(a)表示待检样本△rn值，△rn(w)表示阴性参考品△rn值，△rn(m)表示阳性参考品△rn值，即a表示待检样本、w表示阴性参考品、m表示阳性参考品。
进一步地，步骤(2)中所述的pcr反应液中，dna聚合酶的终浓度为0.01～0.05u/μl，dntps的终浓度为0.2～0.6mm，10×pcrbuffer的终浓度为1×，mgcl2的终浓度为1.5～5.0mm，正向引物vps39-f的终浓度为0.05～0.9μm，反向pna荧光探针引物vps39(pna)-p-r的终浓度为0.05～0.9μm。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：首次发现vps39基因k87r突变能够导致帕金森病的产生，本发明提供了直接检测帕金森病患者dna中vps39基因突变的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时荧光定量pcr法在dna水平快速检测出vps39基因的突变，而与普通实时荧光定量pcr不同的是，本发明使用的肽核酸pna荧光探针更加灵敏，本发明为新靶向药物探讨、基础科学研究以及为临床医生指导病人用药提供了非常有力的工具。操作简单，一次加样，从pcr反应开始到结束，一直在封闭的反应体系中进行，不但降低了污染几率，而且降低了结果出现偏差的几率。结果判读明确直观。
总之，本发明涉及的vps39基因突变检测的试剂盒实验操作简单，费用低廉，结果重复性，敏感性好，是诊断帕金森病遗传学病因及进行基础科学研究的一种重要手段。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
我们在患有帕金森病的家系中通过遗传学手段筛查首次发现vps39基因k87r突变能够导致帕金森病的产生，因此vps39基因可用于帕金森病患者病因的诊断。
一种vps39基因k87r突变检测的试剂盒，主要包含：
(1)用以检测vps39基因k87r突变的引物及探针，其序列为：
vps39-f：5'-agtgccgatcctagaaaagct-3'；
vps39(pna)-p-r：5'-fam-gaccagaatcctaaactggga-bhq1-3'；
以上：f表示正向引物，r表示反向引物；p：表示荧光探针，该荧光探针为taqman荧光探针。
在本发明实施例中，修饰荧光探针5'端的荧光报告基团可以为：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5；修饰荧光探针3'端的淬灭基团可以为：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量pcr的扩增，只需根据探针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。
实施例2
(1)血液中淋巴细胞的提取
1)采取病人1ml新鲜的抗凝血，与生理盐水1:1混匀后。
2)小心加入2ml淋巴细胞分层液(ficoll，低温避光保存)，400g(约1500转/分，半径1cm水平转子)离心20分钟。
3)离心管中由上至下细胞分四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
4)收集第二层细胞放入含5ml生理盐水的试管中，充分混匀后，以400g(约1500转/分)离心20分钟。沉淀经生理盐水洗涤2次后即得所需淋巴细胞。
提取淋巴细胞的dna作为模板用于后续实时荧光定量pcr。
(2)实时荧光定量pcr在反应管中配制pcr反应体系：dna模板，浓度为5u/μl的taqdna聚合酶0.3μl，浓度为10mmol/l的dntps2μl，10×pcrbuffer5μl，浓度为25mmol/l的mgcl2溶液5μl，浓度为10μm的vps39-f2.5μl、浓度为10μm的vps39(pna)-p-r2.5μl，加无菌水至50μl。其中，dna模板分别为提取的总dna5μg、3ng/μl的阳性参考品1μl、3ng/μl的阴性参考品1μl。
将各反应管放入荧光定量pcr仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的taqman荧光探针(本产品荧光报告基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1)，定义样品孔，并按下表1提供的扩增程序进行pcr扩增：
表1为pcr扩增反应扩增程序
在扩增程序的第三步的终了读取荧光值。
六、数据分析判断：
选定所检样本与该样本检测位点对应的阳性参考品(突变型)和阴性参考品(野生型)孔，对比三孔pcr扩增曲线：
当ctm≤cta＜ctw以及△rn(w)＜△rn(a)≤△rn(m)时，表明该样本存在突变；
当ctw＝cta以及△rn(a)≤△rn(w)时，表明该样本为野生型：
其中，cta表示待检样本ct值，ctw表示阴性参考品ct值，ctm表示阳性参考品ct值；△rn(a)表示待检样本△rn值，△rn(w)表示阴性参考品△rn值，△rn(m)表示阳性参考品△rn值。
实施例3
按照实施例2中的方法，对200例帕金森病患者进行检测，结果显示198例ct值为36，△rn值≤2×104，不携带vps39基因k87r突变；有2例ct值24、22，对应的△rn值为14×104、16×104，携带vps39基因k87r突变。其中，阳性参考品ct值为21，对应的△rn值为17×104；阴性参考品ct值为36，对应的△rn值为2×104。
即200例帕金森病患者中发现2例患者的vps39基因存在k87r突变。
以上实施例仅用来说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110>湖北工业大学
<120>一种vps39基因k87r突变检测的试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agtgccgatcctagaaaagct21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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