一种与肝癌相关的长链非编码RNA及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用，所述长链非编码rna为linc01311或linc00189。

背景技术：

肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位列癌症相关肿瘤死亡率第三位。hcc具有起病隐匿、恶性程度高、进展迅速、易转移、病死率高、总体预后不佳等特点，严重危害人类健康。因此，探索肝癌发生以及其早期转移的具体机制对于肝癌早期诊断及提高患者预后具有重要价值。既往针对于肝癌发生发展的机制研究多集中于传统的蛋白编码基因，主要涉及遗传学，表观遗传学以及相关信号通路的调控。随着高通量测序技术发展，研究者已经揭示在人类基因组中非编码rna(non-codingrna，ncrna)比例占据了95％以上，蛋白编码rna以及功能性非编码rna间复杂相互作用在癌症的发生发展中具有重要的作用。长链非编码rna(longnon-codingrna,1ncrna)作为ncrna的重要组成成分之一，也越来越受到重视。

lncrnas是一类分子量大于200个核苷酸，保守性很差的ncrnas，其数量远大于mirna，lncrna能在转录水平和转录后水平调节基因表达，正式和反式调控是其两种主要的转录调控方式，以此lncrna可以分别靶向当前和远处的基因。而转录后水平的机制则主要包括对mrnas的剪接，编辑，转运，翻译和降解。此外基因组印记和染色质重塑也是其调控基因的方式。lncrna分为五类，正义(sense)或反义(antisense)，双向(bidirectional)，内含和基因间。

lncrna参与了生物生长，发育，衰老和死亡等过程，同时也参与了多类疾病的发生发展，但最引人关注的还是其与各种癌症的紧密关系。近年来越来越多的相关实验证明特定的lncrna与特定的癌症存在十分明确的关系，这些1ncrna的不同表达水平也许可以作为肿瘤转移和预后的标志。而作为高发肿瘤的hcc自然也被发现存在大量的1ncrna与之相关。大量的实验发现异常表达的1ncrna被发现与肝癌的发生存在关联，其在肝癌的转移与预后上也扮演着关键的角色(cn201710522694.9、cn201710522693.4)。因此，积极开展肝癌发生发展相关机制的研究，寻找新的分子标志物及治疗靶点并进行早期干预和个体化治疗，提高患者生存率具有重要的临床价值和社会意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与肝细胞癌发生发展相关的分子标志物，通过检测分子标志物的表达水平以及改变其相关水平，实现肝癌的早期诊断与靶向治疗；同时分子标志物也可用于筛选治疗肝癌的候选药物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测基因表达水平的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用，所述基因选自linc01311或linc00189的一种或两种。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别linc01311或linc00189的探针；或

特异性扩增linc01311或linc00189的引物。

进一步，特异性扩增linc01311的引物序列如seqidno.1～2所示，特异性扩增linc00189的引物序列如seqidno.3～4所示。

本发明提供了一种诊断早期肝细胞癌的产品，所述产品包括检测linc01311或linc00189表达水平的试剂，所述产品包括(但不限于)芯片、核酸膜条、试剂盒。

进一步，所述试剂包括特异性识别linc01311或linc00189的探针；或特异性扩增linc01311或linc00189的引物。

进一步，特异性扩增linc01311的引物序列如seqidno.1～2所示，特异性扩增linc00189的引物序列如seqidno.3～4所示。

本发明提供了基因在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用，所述基因为linc01311或linc00189。

进一步，筛选治疗肝细胞癌的候选药物的步骤如下：

用待筛选物质处理表达或含有linc01311或linc00189的培养体系；和

检测所述体系中linc01311或linc00189基因的表达水平；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制linc01311或linc00189基因的水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。

进一步，所述的步骤还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制肝癌的效果，若测试化合物对肝癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为治疗肝癌的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

本发明提供了基因在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用，所述基因选自linc01311或linc00189的一种或两种。

进一步，所述药物组合物包括linc01311或linc00189的抑制剂。

其中，所述linc01311或linc00189的抑制剂选自：以linc01311或linc00189或其转录本为靶序列、且能够抑制linc01311或linc00189基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。

优选的，所述抑制剂为sirna。

更为优选的所述sirna的序列如seqidno.9～20所示。

本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括linc01311或linc00189的抑制剂。

优选的，所述抑制剂为sirna。

更为优选的，所述sirna具有如seqidno.9～20所示的序列。

进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

药学上可接受的载体和/或辅料包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

附图说明

图1是利用qpcr检测linc01311或linc00189在肝细胞癌患者中的表达情况图；其中，图a是linc01311，图b是linc00189。

图2是检测转染sirna对肝细胞癌细胞中linc01311或linc00189的表达影响图；其中，图a是linc01311，图b是linc00189。

图3是利用cck8检测linc01311或linc00189对肝癌细胞增殖的影响图；其中，图a是linc01311，图b是linc00189。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncrna的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncrna片段，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中linc01311或linc00189显著性上调，并且大样本进一步证明了上述结果；同时，细胞实验证明，改变linc01311或linc00189的表达水平可以影响肝细胞癌细胞的增殖能力；提示linc01311或linc00189可以作为靶标应用于肝细胞癌的早期诊断和精准医疗。

linc01311或linc00189基因

linc01311或linc00189基因分别位于22号染色体长臂2区1带上和21号染色体长臂2区1带上，在国际公共核酸数据库genebank中的id号分别为100652736和193629。本发明中的linc01311或linc00189包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的人linc01311或linc00189基因的核苷酸序列分别如目前国际公共核酸数据库genebank中linc01311(nr_103767.1)或linc00189(nr_027072.2)所示。本发明的linc01311或linc00189核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

lncrna水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)、核糖核酸酶保护试验和基于pcr的方法。当生物标志物是lncrna分子时，lncrna序列或其片段可以用于制备至少有部分互补的探针。然后采用例如基于pcr的方法、rna印迹法(northernblotting)或试纸条检测(dipstickassay)等任何合适的测定法，可以用探针检测样品中的lncrna序列。

所述测定方法可以根据所需lncrna信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于rna印迹(northernblots)和基于pcr的方法(例如，qrt-pcr)。qrt-pcr等方法也可以对样品中lncrna的量进行准确定量。

任何合适的测定平台均可用于确定样品中lncrna的存在。例如，测定可以呈试纸条(dipstick)、膜(membrane)、芯片(chip)、盘(disk)、测试条(teststrip)、滤器(filter)、微球(microsphere)、载片(slide)、多孔板(multiwellplate)或光纤(opticalfiber)的形式。测定系统可以具有其上附着有与lncrna对应的核酸的固相支持物。所述固相支持物可包含例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物(precipitate)、凝胶、聚合物、薄片(sheet)、球、多糖、毛细管、胶片(film)、板或载片。所述测定组件可以制备后包装在一起作为用于检测lncrna的试剂盒。

核酸如果需要可以被标记以制作被标记的lncrna群体。一般而言，样品可以采用本领域众所周知的方法进行标记。在某些实施方案中，所述样品被荧光标记物标记。示例性的荧光染料包括但不限于呫吨(xanthene)染料、荧光素染料、罗丹明染料、异硫氰酸荧光素(fitc)、6-羧基荧光素(fam)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(hex)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(joe或j)、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra或t)、6-羧基-x-罗丹明(rox或r)、5-羧基罗丹明6g(r6g5或g5)、6-羧基罗丹明6g(r6g6或g6)和罗丹明110；花菁染料，例如cy3、cy5和cy7染料；alexa染料，例如alexa-fluor-555；香豆素、二乙氨基香豆素、伞形酮；苯甲亚胺染料，例如hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红(texasred)；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料、bodipy染料、喹啉染料、芘(pyrene)、荧光素氯三嗪基(fluoresceinchlorotriazinyl)、r110、eosin、joe、r6g、四甲基罗丹明、lissamine、rox和萘并荧光素。

核酸可存在于固相支持物上的特定可寻址位置中；每一个位置对应于生物标志物的lncrna序列的至少一部分。

在某些实施方案中，lncrna测定包括以下步骤：1)获得一种或多种生物标志物的表面-结合的探针；2)使lncrna群体与表面-结合的探针在足以提供特异性结合的条件下杂交；3)去除杂交步骤中未结合的核酸；和4)检测杂交的lncrna。

杂交可以在合适的杂交条件下进行，该条件的严格性可视需要而变化。典型的条件是在固体表面上在互补的结合成员之间，即在表面-结合的探针和样品中的互补lncrna之间足以产生探针/靶复合物。

在某些实施方案中，使用严格的杂交条件。包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间和洗涤条件的严格性在内的适当条件的选择，取决于实验设计，包括样品来源、捕获剂的种类、预期互补性的程度等等，并且可以作为常规实验手段由本领域普通技术人员来确定。

在lncrna杂交程序之后，将表面结合的多核苷酸洗涤以去除未结合的核酸。可以采用任何方便的洗涤方案进行洗涤。在某些实施方案中，洗涤条件是严格的。然后可以采用标准技术检测靶lncrna与探针的杂交。

试剂盒、芯片、核酸膜条

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测linc01311或linc00189的表达。

作为优选的实施方案，所述试剂盒包含与生物标志物的lncrna特异性结合的一种或多种探针或引物。

作为更为优选的实施方案，所述试剂盒还包含洗涤溶液。

作为更为优选的实施方案，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、lncrna分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。

作为进一步优选的实施方案，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。

所述试剂盒包括用于扩增linc01311或linc00189的特异性引物对；标准dna模板；pcr反应液。

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于linc01311或linc00189所示的部分或全部序列。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的linc01311或linc00189芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncrna芯片。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括linc01311或linc00189基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

在本发明中，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于肝癌的风险或与有助于评估肝癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有肝癌风险的个体、具有肝癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估肝癌中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种linc01311或linc00189的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制linc01311或linc00189基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以linc01311或linc00189基因为靶序列、且能够抑制linc01311或linc00189基因的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调linc01311或linc00189有用的物质，可用于治疗肝细胞癌。

作为本发明的一种优选方式，所述linc01311或linc00189的抑制剂是一种linc01311或linc00189特异性的小干扰rna分子。如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。

在筛选有效的sirna序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的sirna，在本发明的具体实施例中，该sirna的序列如seqidno.9～20所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该sirna在能有效的抑制细胞中linc01311或linc00189基因的表达水平，以及肝癌细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

作为可选择的实施方案中，药物组合物包括linc01311或linc00189基因的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、ph控制剂及表面活性剂等添加剂。其中，稳定剂包括人类血清蛋白、l-氨基酸、糖及纤维素衍生物。l-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集35例肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取5例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、rna样品的质量分析

将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rrna

使用ribo-zero试剂盒除去总rna中的核糖体rna。

5、构建cdna文库

利用illuminatruseqtmrnasampleprepkit进行cdna文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用illuminax-ten测序平台对cdna文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的lncrna，使用r-3.3.3工具包中的deseq2进行生物信息学分析，根据参考基因组hg38，将ensemblgeneid转为genesymbol，进行差异表达lncrna的筛选，差异表达lncrna的筛选标准：fdr<0.05，abs(log2fc)>1。

8、结果

rna-seq结果显示，linc01311或linc00189基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于对照组(癌旁组织)，提示linc01311或linc00189可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的诊断。

实施例2qpcr测序验证linc01311或linc00189基因的差异表达

1、对收集的35例患者癌组织样本和癌旁组织样本对linc01311或linc00189基因差异表达进行大样本qpcr验证。

2、rna提取

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、逆转录：

1)将1μg的总rna模板与2μl10×缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h；

2)向反应管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物，70℃孵育5min，立即置冰上孵育至少2min；

3)将反应混合物与4μl5×缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。

4、qpcr扩增检验

1)引物设计

根据genebank中linc01311或linc00189基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

linc01311的引物序列：

正向引物为5’-tggtcaatggagaattaag-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-gcccttattacactgttg-3’(seqidno.2)。

linc00189的引物序列：

正向引物为5’-tctttgattgactgattcttt-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-ttgaggaacacatctgaa-3’(seqidno.4)。

gapdh的引物序列：

正向引物为5’-ataggtctcgtattgtaat-3’(seqidno.5)；

反向引物为5’-ttaatccactggttatca-3’(seqidno.6)。

2)反应体系

配制25μl反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，ddh2o8.5μl。各项操作均于冰上进行。

每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

3)反应条件

95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，以gapdh作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，linc01311或linc00189基因在肝细胞癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(p<0.05)提示linc01311或linc00189可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。

实施例3linc01311或linc00189基因的沉默

1、细胞培养

人肝细胞癌细胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、sirna设计

针对linc01311或linc00189基因的序列设计sirna，设计阴性对照sirna-nc、linc01311和linc00189的sirna，sirna-nc的序列如seqidno.7～8所示，干扰linc01311的sirna的序列如seqidno.9～14所示，干扰linc00189的sirna的序列如seqidno.15～20所示。具体序列信息如下表所示：

表1linc01311或linc00189的sirna序列

3、转染

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％fbs的dmem培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(hepg2)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(20nm)(sirna1～6)，其中阴性对照组sirna-nc与linc01311和linc00189基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，同时分别进行转染。

4、qpcr检测linc01311或linc00189基因的表达水平

1)细胞总rna的提取

使用qiagen的细胞rna提取试剂盒提取细胞总rna，具体操作参照说明书。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)qpcr扩增步骤同实施例2。

5、结果

结果如图2显示，与对照组hepg2、转染空载sirna-nc组相比，实验组(sirna1～6)能够降低linc01311或linc00189的表达水平，其中sirna1和sirna4干扰linc01311或linc00189的效果最为显著，因此选择sirna1和sirna4分别作为linc01311和linc00189的抑制剂进行后续的实验。

实施例4cck8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、cck8检测细胞增殖

将对数增殖期的hepg2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞，将细胞分为三组，分别是空白对照组、转染sirna-nc组、转染sirna1和转染sirna4组，每组设6个复孔；分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后加入10μl/孔cck8试剂，放入培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测a450的吸光值。

3、统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

4、结果

图3所示的结果显示：空白对照组同转染空载组无明显差异(p>0.05)，而转染sirna1和sirna4组的增殖细胞明显低于对照组的增殖细胞，差异具有统计学意义(p<0.05)，上述结果表明linc01311或linc00189与肝癌细胞的增殖有关，提示抑制linc01311或linc00189可能会抑制肝癌的发展。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>河北医科大学第二医院

<120>一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggtcaatggagaattaag19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcccttattacactgttg18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tctttgattgactgattcttt21

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttgaggaacacatctgaa18

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ataggtctcgtattgtaat19

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ttaatccactggttatca18

<210>7

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

uucuccgaacgugucacgu19

<210>8

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

uucuccgaacgugucacgu19

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

uuauuuccucuguguuuucac21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gaaaacacagaggaaauaaaa21

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

acuuaauucuccauugaccag21

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ggucaauggagaauuaagugg21

<210>13

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

uuuuuuuacuauuuuccucac21

<210>14

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gaggaaaauaguaaaaaaaaa21

<210>15

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

agacuaaggcaaguuucagca21

<210>16

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

cugaaacuugccuuagucuuu21

<210>17

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

uguaaucucagcacuuuggga21

<210>18

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

ccaaagugcugagauuacaga21

<210>19

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

aaacauguuccuuuccuugca21

<210>20

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

caaggaaaggaacauguuuga21