一种人工合成多肽H-473及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人工合成多肽h-473及其应用，具体在制备抗癌，抗老年痴呆，抗哮喘，镇痛，抗银屑病和抗年龄相关性黄斑变性(amd)病等药物方面的应用。

背景技术：

蛋白质为行使其生物学功能，通常与其它蛋白质发生相互作用来体现其功能效应，即：蛋白质相互作用是生命活动在分子水平上的基本事件。单克隆抗体和某些特定结构的小分子药物，包括小分子多肽可以抑制这些相互作用。在生物医学领域也被称之为靶向治疗。单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效，在其他疾病的治疗中也取得了一些疗效，例如奥马珠单抗(omalizumab)通过与游离ige结合而显著降低游离ige的水平，阻断ige与肥大细胞、嗜碱粒细胞结合，防止炎症介质的释放。可显著改善哮喘病人的症状、肺功能及生活质量，减少哮喘恶化的发作次数，减少糖皮质激素的用量，使用安全，具有很好的耐受性.利妥昔单抗对类风湿和系统性红斑狼疮也有很好的治疗作用。英夫利昔单抗对类风湿性关节炎患者疼痛、晨僵、关节肿胀等临床症状减轻程度就可达60％。另有研究显示，输注英夫利昔单抗可快速、显著缓解顽固性银屑病、关节炎病人的关节和皮损症状.英利昔单抗对克罗恩病、溃疡性结肠炎、酒精性肝病等消化系统疾病都有较好疗效，且在推荐的治疗范围内安全性良好。雷珠单抗是用于治疗湿性(新生血管性)年龄相关性黄斑变性(amd)。这些例子说明某些药物具有多靶点治疗性。

根据蛋白分子受到其他分子作用后，将改变原蛋白分子的空间结构和功能特征的原理，本发明在分析癌分子通路中的相关受体(fzds,itg,fgfr,erbb2,pdgfr,igfr,kit,fgfr,hgfr和trk等)；支气管哮喘和慢性炎症分子通路中的相关受体(tlr4，tlr1，tlr5，tlr6等)；阿片受体(opioidreceptor)，老年痴呆相关的乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)，银屑病相关因子和年龄相关性黄斑变性(amd)相关因子等蛋白的分子结构及其功能位点进行分析的基础上，设计了小分子多肽作为多靶点治疗药物，目的在于干扰这些受体，细胞因子和酶分子的功能，达到治疗相关疾病的目的。发明人合成了多肽h-473，迄今为止，并提供了多肽h-473在抗癌，抗哮喘，抗老年痴呆，镇痛，治疗银屑病和治疗银屑病和年龄相关性黄斑变性(amd)病的生物医学功效及其应用。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种人工合成多肽h-473及其应用，并揭示其在抗癌，抗哮喘，抗老年痴呆，镇痛治疗银屑病活性效应的应用前景。

为实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种人工合成多肽h-473，所述的多肽h-473的氨基酸序列:rglrglr,，分子量为827da；pi为12.30。该肽段为单链，不具有化学键的修饰。

本发明所述的多肽h-473对人正常肝细胞changliver的生长抑制几乎无影响(仅有微弱的生长抑制作用或微弱的生长促进作用)，而对人胃癌细胞mgc-803和人胰腺癌细胞cfpac-1细胞生长具有显著的抑制作用。

通过构建小鼠乙酰胆碱酶动物模型结合构建的乙酰胆碱酯酶的标准曲线，对各实验组的脑组织的乙酰胆碱酯酶进行测定和计算各实验组脑细胞乙酰胆碱酯酶表达量，本发明所述的多肽h-473对脑组织的乙酰胆碱酯酶表达抑制率为55.6％。多肽h-473干扰脑组织的乙酰胆碱酯酶表达率为43.8％。

本发明所述的多肽h-473药物有显著抗哮喘活性。

通过构建小鼠扭体反应次数的镇痛模型，观察h-473对小鼠镇痛作用的影响。本发明多肽h-473可明显减少醋酸所致的小鼠扭体反应次数，各剂量组对醋酸所致疼痛有显著的镇痛作用。

同时本发明多肽h-473药物在分子、细胞和动物水平上对银屑病发生发展的相关因子如：carma，vegf，il6，il8,il1-r，tnf-r1，il17ra，il12，il12r等蛋白的表达显著下调，可望成为抗银屑病的强效药物。

本发明多肽h-473使细胞的vegf表达显著下调，能够有效抑制vegf的生物活性，有效地干扰vegf的相关受体，如vegfr，pdgfr等。最终实现抑制血管增生，达到抗年龄相关性黄斑变性(amd)病的目的。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗抗癌药物中的应用，所述的抗癌药物包括抗人类胃癌药物和抗人胰腺癌药物。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗抗老年痴呆药物中的应用。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗镇痛药物中的应用，所述应用包括预防和/或治疗烧烫伤、外力损伤、冻伤、炎症性疼痛、神经病理性损伤以及其他原因导致的疼痛。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗银屑病药物中的应用。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的多肽h-473在预防和/或治疗黄斑变性(amd)药物中的应用。

上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、稳定剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂等。

本发明所述的药物，可以根据小分子多肽的理化性质制成注射剂、冻干制剂、埋植剂、缓释剂等多种形式的药物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的有益效果为：

本发明提供的多肽h-473属于小分子多肽，容易制备，其制备工艺和成本较低，易于制得。h-473在抗癌、抗哮喘、抗老年痴呆、镇痛和抗银屑病中都具有非常高的应用价值，研究表明，对人胃癌细胞mgc-803细胞生长抑制率达到51.9％。对人胰腺癌细胞cfpac-1细胞细胞生长抑制率达到48.8％。多肽h-473对人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤的抑瘤率高达64.1％，多肽h-473对人胰腺癌细胞cfpac-1裸鼠异种移植瘤的抑瘤率高达68.04％，多肽h-473对脑组织的乙酰胆碱酯酶表达抑制率为55.6％，肽h-473干扰脑组织的乙酰胆碱酯酶表达率为43.8％，h-473多肽药物对醋酸所致小鼠疼痛扭体抑制率在0.5mg/kg和1mg/kg剂量时分别为81.95％和95.11％。本发明为研究新型的抗癌、抗哮喘、抗老年痴呆、镇痛、抗银屑病和抗年龄相关性黄斑变性(amd)病提供了有价值的资源和方向。

附图说明

图1是本发明h-473的细胞学活性效应数据图；

图2是本发明实施例2中多肽h-473对人胃癌裸鼠异种移植瘤生长的影响效果数据图；

图3是本发明实施例3中多肽h-473对人胰腺癌裸鼠异种移植瘤生长影响效果数据图；

图4是乙酰胆碱酯酶的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1细胞模型的构建与抗癌效果的验证

1.细胞模型

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.1.1细胞株：人正常肝细胞changliver(张氏肝细胞)，人胃癌细胞mgc-803，人胰腺癌细胞cfpac-1，上述细胞株均为已经商品化的生物材料。

1.1.2试剂：rpmi1640粉末(购于gibco公司，美国)，胎牛血清(购于四季青生物制品公司，中国)，双抗(青霉素，链霉素，购于gibco公司)。

1.1.1.3h-473的氨基酸序列为：rglrglr,分子量为827da；pi为12.30。纯度为98.12％。

1.1.2方法

1.1.2.1细胞培养

将人正常肝细胞changliver，人胃癌细胞mgc-803，人胰腺癌细胞cfpac-1细胞株分别用含有10％的灭活的胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、ph7.4的rpmi-1640完全培养液于37℃、5％co2培养箱中进行培养。

1.1.2.2mtt法检测细胞活性

取对数生长期的人正常肝细胞changliver，人胃癌细胞mgc-803，人胰腺癌细胞cfpac-1细胞用胰蛋白酶消化后将细胞数调整到l×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔细胞液量为200μl，放入co2培养箱内，于37℃、5％co2及饱和湿度的条件下孵育至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，然后加h-473，使其终浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.5，3.0和6.0μg/ml；设6个重复孔，空白组为不含细胞的rpmi1640培养液，放入co2培养箱内培养24、36和48h后取出96孔板，加入mtt(5mg/ml)溶液10μl，继续培养4h后，然后加入150μl的二甲基亚砜(dmso)振荡10min，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶标仪在在490nm的波长下测定各孔的吸光度(od)值，计算不同浓度下h-473(本实施例采用直接加入培养生长良好的癌细胞中观察结果，临床中，蛋白质或者多肽类的生物药物多采用注射剂的剂型，肌注或者静脉滴注)作用各类型细胞的抑制率(％)。细胞生长抑制率公式为：

细胞生长抑制率＝(1—a实验组/a对照组)×100％。

在以上实验的基础上选择了h-473生长抑制效果最好的人胃癌细胞mgc-803，人胰腺癌细胞cfpac-1细胞和人正常肝细胞changliver进行对比实验，培养时间为36h，获取统计数据，具体方法与步骤同上。

1.2结果

本实施例采用mtt法检测结果显示：不同浓度多肽药物h-473在36h下对人正常肝细胞changliver的生长抑制几乎无影响(仅有微弱的生长抑制作用或微弱的生长促进作用)，而对人胃癌细胞mgc-803和人胰腺癌细胞cfpac-1细胞生长具有显著的抑制作用。从图1可以看出，多肽药物h-473对人胃癌细胞mgc-803和人胰腺癌细胞cfpac-1细胞的生长抑制率具有剂量的依赖性。发现在3.0μg/ml浓度下对人胃癌细胞mgc-803细胞生长抑制率达到51.9％。发现在6.0μg/ml浓度下对人胰腺癌细胞cfpac-1细胞细胞生长抑制率达到48.8％。

实施例2对人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤的药效实验

2.1实验目的：

根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》和《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》的要求，测试多肽药物多肽药物h-473对人胃癌细胞mgc-803异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。

2.2受试样品：

多肽药物h-473。

配制方法：多肽药物1mg溶于1ml的生理盐水中，然后倍比稀释，得到所需浓度的多肽溶液。

2.3对照药物：

白介素-2

厂家：北京双鹭药业股份有限公司

批号：20120824

配制方法：给药前用生理盐水配成浓度为2万iu/ml的溶液。

2.4组别及给药方案：

模型对照组：生理盐水，0.1ml/10g，每天1次，持续10次；

白介素-2：尾静脉注射2万iu/ml白介素-2溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次；

多肽h-473-1ug/kg组：尾静脉注射0.1ug/ml的多肽h-473溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。

2.5受试动物：

来源、种系、品系：balb/c裸小鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

实验动物生产许可证：scxk(军)2012-004

合格证编号：0039642

实验动物使用许可证：syxk(苏)2011-0036

日龄：4-5w

体重：18-22g

性别：雄性

动物数：每组8只，共24只。

2.6实验方法：

2.6.1模型的制备

收集培养的人胃癌细胞mgc-803细胞悬液，浓度为1×10⁷个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。

2.6.2分组与给药

裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，接种8天后，肿瘤生长至100-150mm³时将动物随机分组，每组8只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。给药10天后继续观察4天，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。

2.6.3观测指标

肿瘤体积(tumorvolume,tv)的计算公式为：tv＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)，计算公式为：rtv＝vt/v0，其中v0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，vt为每一次测量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率t/c(％)，计算公式如下：

其中，trtv：治疗组rtv；crtv：模型组rtv。

抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：

2.6.4统计处理

均值用x±sd表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用spss(staffsticalpackageforthesocialscience)17.0对结果进行统计分析。

2.7实施例结果与结论：

本实施例建立了人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤模型，利用该模型评价了多肽h-473在1ug/kg浓度时的抗肿瘤活性。实验结果为：多肽h-473的抑瘤率为64.1％。而相同条件下，阳性对照il2组(20万u/kg)的抑瘤率为60.9％。结论为：多肽药物h-473在1ug/kg的浓度下有显著的抗肿瘤活性，抑瘤率>40％，且和模型组比有显著性差异。本实施例的实验结果如表1所示；本实施例中多肽h-473对人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤生长的影响效果如图2所示。

表1多肽h-473对人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用(x±sd，n＝8)

实施例3对人胰腺癌细胞cfpac-1裸鼠异种移植瘤的药效实验

3.1实验目的：

根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》和《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》的要求，测试多肽药物h-473对人胰腺癌细胞cfpac-1异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。

3.2受试样品：

多肽药物h-473

配制方法：多肽药物1mg溶于1ml的生理盐水中，然后倍比稀释，得到所需浓度的多肽溶液。

3.3对照药物：

白介素-2

厂家：北京双鹭药业股份有限公司

批号：20131037

配制方法：给药前用生理盐水配成浓度为2万iu/ml的溶液。

3.4组别及给药方案：

模型对照组：生理盐水，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。

白介素-2：尾静脉注射2万iu/ml白介素-2溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。

多肽h-473-1ug/kg组：尾静脉注射0.1ug/ml的多肽h-473溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。

3.5受试动物：

来源、种系、品系：balb/c裸小鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

实验动物生产许可证：scxk(军)2012-004

合格证编号：0018558

实验动物使用许可证：syxk(苏)2011-0036

日龄：4-5w

体重：18-22g

性别：雄性

动物数：每组8只，共24只。

3.6实验方法：

3.6.1模型的制备

收集培养的cfpac-1细胞悬液，浓度为1×10⁷个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。

3.6.2分组与给药

裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，接种17天后，肿瘤生长至100-150mm³时将动物随机分组，每组8只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。给药10天后继续观察3天，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。

3.6.3观测指标

肿瘤体积(tumorvolume,tv)的计算公式为：tv＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，rtv)，计算公式为：rtv＝vt/v0，其中v0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，vt为每一次测量时的肿瘤体积。

抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率t/c(％)，计算公式如下：

其中，trtv：治疗组rtv；crtv：模型组rtv。

抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：

3.6.4统计处理

均值用x±sd表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用spss(staffsticalpackageforthesocialscience)17.0对结果进行统计分析。

3.7实施例结果与结论：

本实施例建立了人胰腺癌细胞cfpac-1裸鼠异种移植瘤模型，利用该模型评价了多肽h-473在1ug/kg浓度时的抗肿瘤活性。实验结果为：多肽h-473的抑瘤率为56.1％。而相同条件下，阳性对照il2组(20万u/kg)的抑瘤率为68.04％。结论为：多肽药物h-473在1ug/kg的浓度下有显著的抗肿瘤活性，抑瘤率>40％，且和模型组比有显著性差异。本实施例的实验结果如表2所示；本实施例中多肽h-473对人胃癌细胞mgc-803裸鼠异种移植瘤生长的影响效果如图3所示。

表2多肽h-473对人胰腺癌细胞cfpac-1裸鼠异种移植瘤生长的影响效果(x±sd，n＝8)

实施例4小鼠乙酰胆碱酶动物模型实验

4.1实验目的：

评价多肽药物h-473对脑细胞乙酰胆碱酯酶表达的抑制效应和干扰效果。

4.2试剂：d-半乳糖、亚硝酸钠、动物脑组织蛋白提取试剂盒。

4.3模型构造：

32只小鼠随机分成4组，每组8只。

对照组：不做任何处理，每天正常喂食。

表达抑制组：每只小鼠每天肌肉注射200μg/kg药物处理30天。

模型组：每只小鼠每天腹腔注射150mg/kgd-半乳糖和120mg/kg亚硝酸钠，处理30天。

干扰组：在模型组的基础上，同时每只小鼠每天肌肉注射200μg/kg多肽药物h-473，处理30天。

4.4样本收集：

收集每组的脑组织，将每组中各只取相同重量的脑组织混在一起。

将收集的脑组织立即用液氮处理，处理后平均分为3份，-80°超低温保存。

用动物脑组织蛋白提取试剂盒提取脑组织蛋白。

用elisa试剂盒测定每个实验组的脑细胞乙酰胆碱酯酶表达量。

4.5数据统计

表达抑制率的计算公式：

表达抑制率％＝(控制组的表达量－抑制组表达量)/控制组的表达量×100％。

药物干扰表达率的计算公式：

药物干扰表达率％＝(模型组的表达量－干扰组表达量)/模型组的表达量×100％。

4.6实验结果。

按照elisa试剂盒说明书的方法，构建乙酰胆碱酯酶的标准曲线(图4)，对各组的脑组织的乙酰胆碱酯酶进行测定，然后利用标准曲线计算各实验组脑细胞乙酰胆碱酯酶表达量(表3)。表达抑制率为：55.6％(与控制组比较)。药物干扰表达率为：43.8％(与模型组比较)。结果显示：多肽药物h-473有显著抑制脑细胞乙酰胆碱酯酶的表达。

表3各实验组脑组织乙酰胆碱酯酶表达的测定结果(nmol/l)

实施例5多肽药物h-473对小鼠哮喘药效作用

5.1受试样品：

多肽药物h-473。

阳性药物，地塞米松，浙江仙崌制药股份有限公司，批号：150921。

5.2主要试剂：

卵白蛋白，sigma公司，lotslbk7542v。

佐剂液态铝，thermo公司，lotrb231380b。

5.3主要仪器：

压缩空气式雾化器，黄山市雅适医疗器械有限公司，ys-01。

血液分析仪，山东恒拓科技发展有限公司，btx-1800。

5.4受试动物：

来源、种系、品系：babl/c小鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

实验动物生产许可证：scxk(沪)2013-0016

实验动物使用许可证：syxk(苏)2012-0047

体重：18-22g。

性别：雌性。

动物数：40只。

5.3药物分组、给药方式及周期

药物分组、给药方式及周期见表4。实验35天时，在ova雾化前一小时给予药物。

表4药物分组、给药方式及周期

实验35天时，在ova雾化前一小时给予药物。

5.6实验方法：

5.6.1哮喘模型：小鼠腹腔注射0.2ml致敏液(卵蛋白ova80ug+佐剂液态铝0.1ml)，于0、14天注射2次。从第一次致敏后第24天开始，雾化吸入2.5％的ova45min，每天一次，持续18d。

5.6.2给药：自实验第35天起，在ova溶液雾化攻击前1h给予相应药物。h-473多肽药物15ug/kg组和h-473多肽药物30ug/kg组分别肌肉注射。阳性对照组肌肉注射地塞米松1mg/kg。正常对照组、模型对照组肌肉注射生理盐水。

5.6.3指标检测及取材：

一般整体观察：呼吸频率，有无呼吸困难、发绀、躁动及抽搐。

支气管肺泡灌洗液(balf)细胞计数、分类(eos比率是否升高)。

小鼠血清：末次激发后24h小鼠眼球采血，离心，收集血清。

肺组织一半固定，一半冷冻。

5.7实验结果

5.7.1一般观察：

各组小鼠第一次致敏后32天，即雾化后11天出现躁动、点头样呼吸，抓鼻等反应。雾化后18天模型组出现呼吸困难、躁动等反应，阳性组未出现异常反应，其他给药组和雾化8天时出现症状一样，没有加重趋势。

5.7.2balf细胞计数、分类(表5)

表5balf细胞计数、分类(m±sd，n＝6，10^{^9}/l)

结论：h-473多肽药物有显著抗哮喘活性。

实施例6h-473镇痛药物药效的评价

6.1实验目的：

观察h-473对小鼠镇痛作用的影响。

6.2受试样品：

药物名称：h-473。

配制方法：药物，-20℃保存，取适量药品，加生理盐水溶解至所需浓度。

6.3组别及给药方案：

模型组：肌肉注射生理盐水，5ml/kg。

h-473-l组：肌肉注射药物，0.5mg/kg，给药一次。

h-473-h组：肌肉注射药物，1mg/kg，给药一次。

6.4受试动物：

来源、种系、品系：icr小鼠，上海灵畅生物科技有限公司提供。

实验动物生产许可证：scxk(沪)2013-0018，合格证编号：2013001834301。

实验动物使用许可证：syxk(苏)2017-0015。

日龄：5-6w。

体重：180-220g。

性别：雌性。

动物数：24只。

6.5实验方法：

6.5.1模型的制备

根据药理实验方法学将小鼠适应性饲养3天后，按照组别随机分为3组，每组8只动物。按照给药方案，各组小鼠肌肉注射药物，给药1h后，小鼠腹腔注射0.2ml2％冰醋酸，观察15min内小鼠出现扭体反应(腹部收缩呈“s”形，身体扭曲，后肢伸展及蠕行等)的次数，并计算扭体抑制率。扭体抑制率％＝(对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数×100％。

6.5.2统计处理

均值用x±sd表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用spss(staffsticalpackageforthesocialscience)17.0对结果进行统计分析。

6.6实验结果：

如表6所示，h-473可明显减少醋酸所致的小鼠扭体反应次数，各剂量组对醋酸所致疼痛有显著的镇痛作用，与空白对照组比较有显著差异(p<0.01)。

表6h-473对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(x±sd，n＝8)

实施例7抗银屑病药物实验

7.1银屑病(俗称牛皮癣)最新研究成果：2018年7月3日，清华大学林欣实验室在细胞杂志子刊《immunity》上在线发表了题为“gainoffunctionmutationofcard14leadstospontaneouspsoriasis-likeskininflammationthroughenhancedkeratinocyteresponsetointerleukin-17a”的文章。文章报道了card14e138a/+自发性银屑病小鼠的组织病理学表型和炎症反应类型，并阐明了card14基因的缺失或突变影响角质细胞中il-17a信号激活的分子机制，以及角质细胞在银屑病起始过程中的重要作用。

目前，对于银屑病的起因尚不清楚。近期的gwas研究发现，银屑病患者中尚存在多种nf-κb信号相关基因突变，如皮肤中高表达的card14基因等。这一发现表明card14基因可能在诱发银屑病的过程中起到重要作用。card14基因编码细胞内一个信号转导相关的蛋白carma2，林欣实验室多年来研究card家族编码蛋白在免疫与炎症反应中的功能，因此在这项研究中通过构建card14突变小鼠模型来探讨carma2的激活能否诱发银屑病，以及如何诱发银屑病的发生。

研究发现carma2是角质细胞中il-17a信号通路的重要调控蛋白，其在角质细胞中的持续激活，即可诱导银屑病的发生。这为银屑病的治疗提供新的方向。更重要的是，card14e138a/+小鼠可作为银屑病研究，特别是起始阶段机制研究的恰当模型，以及治疗药物筛选和验证的模型。

7.2创新性抗银屑病药物的设计

我们根据现有药物的作用机制，结合最新研究进展，从分子水平设计出创新性抗银屑病的多肽小分子药物。

设计思路如下：设计的多肽小分子药物能有效地干扰tcr，bcr，il1-r，tnf-r1等受体与致病因子结合，通过相关信号联级通路下调carma的表达水平，进一步抑制vegf的表达，达到抑制血管增生的目的。控制银屑病的发生与发展。

设计的多肽小分子药物同时能有效地抑制il17ra，notch1-3，cd4，il4r，cd58和cd2等受体和与相关细胞因子有效结合，通过细胞相关信号通路一方面下调vegf的表达水平；另一方面下调il12,il12r,il1,il1r,il6，il8等炎性因子的表达，控制银屑病的发生与发展。

7.3摸底实验结果如下：

7.3.1分子水平研究结果

h-473多肽小分子药物在分子水平上能与tcr，bcr，il1-r，tnf-r1，il17ra，notch1-3，cd4，il12，il12r,cd58和cd2等分子高效结合。

7.3.2细胞水平研究结果

h-473多肽小分子药物分别作用于培养的t和b细胞，利用elisa实验检测细胞相关蛋白的表达量，发现carma，vegf，il6，il8,il1-r，tnf-r1，il17ra，il12，il12r等蛋白的表达显著下调。

7.3.3动物水平研究结果

将h-473多肽小分子药物通过肌肉给药和鼻粘膜给药实验小鼠12天后，分别收集模型组和实验组动物的相应组织构建基因池，然后进行基因转录谱分析。结果显示carma，vegf,il6，il8il1-r，tnf-r1，il17ra，il12，il12r等基因转录量显著下调。

实验结果表明h-473多肽小分子药物达到了预期的设计目的，可望成为抗银屑病的强效药物。

实施例8抗年龄相关性黄斑变性(amd)病小分子多肽药物实验

8.1抗年龄相关性黄斑变性(amd)病小分子多肽药物的设计

根据已有的抗年龄相关性黄斑变性(amd)病的几个抗体的药理学原理，同时又要克服现有vegf抑制剂的主要副作用，如因注射产生的，其中包括结膜出血、急性眼内压上升、创伤性白内障、葡萄膜炎、视网膜脱离等副作用；以及vegf抑制剂注射可能导致感染和眼内炎，在没有适当无菌技术的贝伐单抗体使一些患者罹患眼内炎和失明等副作用。

设计思路是：所设计的小分子多肽药物能够：1.使细胞的vegf表达显著下调。2.能够有效抑制vegf的生物活性。3.有效地干扰vegf的相关受体，如vegfr，pdgfr等。最终实现抑制血管增生，达到抗年龄相关性黄斑变性(amd)病的目的。

8.2.摸底实验结果如下：

8.2.1分子水平研究结果

h-473多肽小分子药物在体外能与vegf分子充分结合，也能与vegfr，pdgfr，以及gf的相关受体分子充分结合。从理论上讲，既使vegf分子失去活性，又使vegf分子失去与相关受体结合的机会。

8.2.2细胞水平研究结果

h-473多肽小分子药物分别作用于培养的肺癌细胞a549和胃癌细胞mgc-803，利用elisa实验检测细胞相关蛋白的表达量，发现vegf蛋白的表达显著下调。

8.2.3动物水平研究结果

将h-473多肽小分子药物通过鼻粘膜给药实验小鼠15天后，分别收集模型组和实验组动物的相应组织构建基因池，然后进行基因转录谱分析。结果显示vegf，il6，il8，il1-r，tnf-r1，il17ra，il12，il12r等基因转录量显著下调。

实验结果表明：h-473多肽小分子药物达到了预期的设计目的，可望成为抗年龄相关性黄斑变性(amd)病的强效药物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。