用于犬基因分型的基因座及用途的制作方法

本发明涉及遗传学测定领域，具体涉及一种用于犬基因分型的组合物及用途，尤其涉及一种用于犬基因分型的基因座、用来扩增各str基因座的引物组、试剂盒、基因分型的方法、基因分型的系统、用于犬个体识别和亲缘鉴定的方法和设备。
背景技术：
：人类基因组str(短串联重复序列)是目前普遍应用的遗传标记，是以少数几个碱基为核心单位，串联重复形成的dna遗传标记。其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的dna序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，因此str分型是现今国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术。狗是人类最早驯化的家畜，同时也是饲养率最高的宠物。据统计，2017年宠物狗数量约达到4990万只，在养宠用户中养狗家庭比例最高，达到60％，是主要的宠物类别。狗，作为人类最亲密的伙伴之一，它具有许多特殊的本领，如嗅觉敏锐、辅助狩猎、善战等能力。随着宠物狗走失、警犬档案管理及遗传育种等问题的出现，为爱犬建立dna档案数据库及亲缘鉴定技术等显得尤为重要。而针对狗的分型的试剂盒在个体识别力及遗传多态性上还有诸多不足。针对狗的分型和个体鉴定还有待进一步改进。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种用于犬基因分型的一组基因座以及试剂盒，以及对犬进行基因分型的方法和系统。通过本发明所提供的一组基因座以及试剂盒可以实现犬的基因分型，从而可以用于犬的个体识别和亲缘鉴定。本发明是基于发明人的如下发现实现的：基因组str片段一直是生物特征个体识别的有效工具，具有片段较小、分型准确、扩增效率高等特点，已被广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域。而荧光标记复合扩增检测技术不仅可以同时检测多个str基因座，还可以根据等位基因片段所带的荧光颜色不同加以区别，即使在出现等位基因片段长度有重叠的基因座时，也可以通过采取不同的荧光染料标记，来区分不同基因座的等位基因。针对犬类分型的试剂盒主要的问题有str基因座数量较少，在个体识别力及遗传多态性上有一定的欠缺。鉴于此，开发一种位点数量多，遗传多态性好，个体识别力强及准确性高的犬类分型试剂盒是十分必要的。而针对犬类中的所有str基因座，是选择利用全部的位点，还是选择其中的某些个位点，或者仅选取某几个位点，才能够即快速方便，又能全面的用作犬的基因分型，需要经过创造性的分析。本发明的发明人通过研究，发现了将尽量少的str基因座组合，即可以获得全面的str分型结果，从而用于犬的个体识别和亲缘鉴定。这些位点适用于全球多个国家及地区的犬类群体，而且具有灵敏度强、稳定性好及准确性高等优点，可广泛应用于犬类个体识别、亲缘鉴定及遗传育种等。为此，本发明提供了如下技术方案：根据本发明的第一方面，本发明提供了一组基因座，包括以下常染色体str基因座：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055和ren54p11。任选，该组基因座可以进一步包括性染色体基因座damel。各位点详细信息见表1。其中damel作为性染色体基因座，用于犬的性别鉴定。利用该组基因座中各基因座，可以方便快速的用作犬的基因分型，以实现犬个体识别、亲缘鉴定以及dna档案数据库的建立等，在法医学和商业领域发挥重要的价值。表1各基因座信息根据本发明的第二方面，本发明提供了一种引物组，所述引物组适于特异性扩增含有下述基因座的核酸序列：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055和ren54p11。通过对组合物中各基因座所在的核酸序列进行特异性扩增，从而能够快速方便用作犬的基因分型，实现犬的个体识别。在本发明的一些实施例中，以上所述引物组可以进一步包括如下技术特征：在一些实施例中，所述基因座进一步包括damel。dmael作为性染色体上的基因座，可以用于犬的性别鉴定。在一些实施例中，所述引物组为seqidno:1～seqidno:12，以及seqidno:15～seqidno:40所示核苷酸序列或其衍生物。在一些实施例中，所述引物组还包括seqidno:13～seqidno:14所示核苷酸序列或其衍生物。在进行多重pcr反应的时候，引物序列的选择应该非常小心。因为引物的不恰当选择可能会产生不期望的结果，例如扩增缺乏、在预期的靶基因座之外的一个或多个位点扩增、形成引物二聚体、不同的基因座的引物间发生非期望的相互作用等等。本发明针对20个位点在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。每对引物的退火温度均在60摄氏度左右、而且不会产生引物二聚体或者非特异性扩增产物，最终扩增产物的长度在400bp以下。经过测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其他相互作用或者交叉反应。由此可以同时实现所有str基因座的共扩增，一次性方便快捷用作犬的基因分型和鉴定。在一些实施例中，所述衍生物为将核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与所述核苷酸序列具有相同功能的核酸分子。在一些实施例中，用于ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055和ren54p11基因座特异性扩增的引物序列在扩增反应体系中的终浓度为：(2.15±0.1)μm，(0.45±0.1)μm，(0.84±0.1)μm，(0.60±0.1)μm，(0.75±0.1)μm，(1.25±0.1)μm，(0.30±0.1)μm，(0.38±0.1)μm，(0.92±0.1)μm，(0.35±0.1)μm，(0.40±0.1)μm，(2.00±0.1)μm，(0.65±0.1)μm，(0.50±0.1)μm，(1.15±0.1)μm，(0.30μm)μm，(1.25±0.1)μm，(2.00±0.1)μm和(0.63±0.1)μm。在一些实施例中，用于damel基因座特异性扩增的引物序列在扩增反应体系中的终浓度为(0.65±0.1)μm。在一些实施例中，所述引物组的每对引物中至少一个引物上连接有可检测标记。在一些实施例中，所述引物组的每对引物中至少一个引物的5’端连接有可检测标记。在一些实施例中，所述引物组包含第一引物组、第二引物组，第三引物组和第四引物组，各引物组引物上连接有可区分的可检测标记；其中所述第一引物组包括用于ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23基因座特异性扩增的引物，所述第二引物组包括用于inra21、damel、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253基因座特异性扩增的引物，所述第三引物组包括用于aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054基因座特异性扩增的引物，所述第四引物组包括用于inu005、ren64e19、inu055、ren54p11基因座特异性扩增的引物。将引物组分为不同的组别，即第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组，每一引物组中的引物带有可检测标记，且不同引物组中引物所带有的可检测标记均不相同，以此实现分组。然后结合每组引物组中各引物扩增得到的产物的片段大小，确定具体是哪一个位点所得到的产物，从而实现基因的分型。在一些实施例中，所述可检测标记包括荧光标记。在一些实施例中，所述选自fam荧光标记、hex荧光标记、tamra荧光标记、rox荧光标记、cy5荧光标记中的至少一种。利用fam(6’-羧基荧光素)蓝色荧光标记、hex(六氯-6-甲基荧光素)绿色荧光标记、tamra(4-甲基-6-羧基-罗丹明)黄色荧光标记、rox(羧基-x-罗丹明)红色荧光标记和cy5(indodicarbocyanine)紫色荧光标记等可以实现不同引物所扩增得到的相同或相近大小的产物片段的区分。根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括引物组，所述引物组能够特异性扩增下列基因座：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11和damel。该试剂盒选取了稳定性好，扩增效率高，灵敏度强的位点进行检测。能够广泛应用于法医和商业中犬个体识别、亲缘鉴定及dna档案数据库的建立等。在本发明的一些实施例中，以上所述试剂盒可以进一步包括如下技术特征：在一些实施例中，所述试剂包括根据本发明第二方面所述的引物组。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括分子内标物，所述分子内标物为含有多条大小已知的dna片段的混合物。利用分子内标物可以标示所获得的扩增产物的大小。分子内标物可以标记有可检测标记，这些可检测标记不同于引物上所带有的可检测标记。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括下列中至少一种：pcr缓冲液、dna模板、taqdna聚合酶和dntp混合物。在一些实施例中，所述pcr缓冲液包括10mmdmso、50mmkcl、10mmtris-hcl(ph8.3)、20mmmgcl2和0.1mg/mlbsa。根据本发明的第四方面，本发明提供了试剂盒在犬的个体识别和/或亲缘鉴定中的用途，所述试剂盒为本发明第三方面所述的试剂盒。根据本发明的第五方面，本发明提供了一种基因分型的方法，包括：对待测样品的str基因座进行扩增，得到等位基因扩增产物，所述str基因座包括ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055和ren54p11；对所述等位基因扩增产物进行分析，以获得基因分型结果。根据本发明的实施例，以上基因分型的方法可以进一步包括如下技术特征：在一些实施例中，所述方法进一步包括对待测样品的性染色体基因座damel进行扩增。在一些实施例中，利用多重扩增反应进行所述扩增，得到等位基因扩增产物。多重扩增反应将引物以各种方式混合在同一反应中同时扩增多个基因，从而可以实现方便快速的对于所有str位点的扩增。在一些实施例中，所述待测样品来自于犬的dna。在一些实施中，所述待测样品来自于血液、血斑、精液、精斑、骨骼、阴道细胞、毛发、唾液、唾液斑、尿、汗液、羊水中的一种或多种。在一些实施例中，在进行所述分析之前，还包括对所述经扩增的等位基因进行分离。在一些实施例中，通过毛细管凝胶电泳对所述等位基因扩增产物进行分离。在一些实施例中，使用引物组特异性扩增含有所述str基因座的核酸序列，所述引物组为根据本发明第二方面所述的引物组。根据本发明的第六方面，本发明提供了一种基因分型系统，所述系统包括：扩增单元，所述扩增单元用于对待测样品内的下列基因座进行扩增，得到等位基因扩增产物：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055和ren54p11；等位基因确定单元，所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述等位基因扩增产物进行分析，以获得基因分型结果。根据本发明的实施例，以上所述基因分型系统可以进一步包括如下技术特征：在一些实施例中，所述基因座进一步包括damel。在一些实施例中，所述扩增单元利用多重扩增反应进行所述扩增，得到等位基因扩增产物。在一些实施例中，所述待测样品来自于犬的dna。在一些实施例中，所述待测样品来自于血液、血斑、精液、精斑、骨骼、阴道细胞、毛发、唾液、唾液斑、尿、汗液、羊水中的一种或多种。在一些实施例中，所述系统还包括分离单元，所述分离单元分别与所述扩增单元和所述等位基因确定单元相连，所述分离单元用来对所述等位基因扩增产物进行分离。在一些实施例中，所述分离单元通过毛细管凝胶电泳对所述等位基因扩增产物进行分离。在一些实施例中，所述扩增单元使用引物组特异性扩增含有所述str基因座的核酸序列，所述引物组为根据本发明第二方面所述的引物组。根据本发明的第七方面，本发明提供了一种用于犬个体识别的方法，包括：从待测犬中获取dna，得到含有犬dna的样品；基于含有犬dna的样品，获得所述dna的基因分型结果，所述基因分型结果根据本发明第五方面所述的方法获得；根据所述基因分型结果，对所述犬进行个体识别。在一些实施例中，该方法还包括根据所述基因分型结果，进一步对所述犬进行亲缘鉴定。根据本发明的第八方面，本发明提供了一种用于犬个体识别的设备，包括：dna获取系统，所述dna获取系统用于从待测犬中获取dna，得到含有犬dna的样品；基因分型系统，所述基因分型系统与所述dna获取系统相连，所述基因分型系统基于含有狗dna的样品，获得所述dna的基因分型结果，所述基因分型系统为根据本发明第六方面所述的基因分型系统；分析系统，所述分析系统与所述基因分型系统相连，所述分析系统根据所述基因分型结果，对所述犬进行个体识别。在一些实施例中，所述分析系统还可以根据基因分型结果，进一步对所述犬进行亲缘鉴定。本发明所取得的有益效果为：本发明能够同时分析犬类20个str基因座，其位点全部选自于国际动物遗传学会推荐的犬类基因分型基因座，可适用于全球各个国家及地区的犬类群体。其中一个基因座为性别鉴定基因座，可准确鉴定犬性别。而且利用本发明所提供的引物，能够在单管内一次性扩增多个str基因座和性别鉴定基因座amel，可在90分钟内完成pcr扩增、120分钟内得到基因分型图谱，极大地节省了物料和时间成本。且准确性高，具有重要的价值。附图说明图1是根据本发明的一个实施例提供的str位点排布示意图。图2是根据本发明的一个实施例提供的对随机犬1的基因分型图。图3是根据本发明的一个实施例提供的基因分型系统示意图。图4是根据本发明的一个实施例提供的基因分型系统示意图。图5是根据本发明的一个实施例提供的用于犬个体识别和亲缘鉴定的设备的示意图。图6是根据本发明的一个实施例提供的对随机犬2的基因分型图。图7是根据本发明的一个实施例提供的对随机犬1的基因分型图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下面对本发明中出现的某些术语进行解释和说明，以便能够更好的理解本发明。需要说明的是，这些解释和说明，仅用来帮助对于本发明的理解，而不应看做是对于本发明的限制。在本文中，正如本领域通常的理解，“dna”指的是以其各种形式存在的脱氧核糖核酸，诸如基因组dna、cdna、分离的核酸分子、载体dna以及染色体dna。“核酸”是指任何形式的dna或rna(核糖核酸)。本文中，犬是指哺乳纲食肉目犬科犬属动物，例如可以为家犬。在本文中，基因座或者位点指的是基因在染色体上所占的位置，在分子水平上，基因座是指有遗传效应的dna序列。一个基因座可以是一个基因，一个基因的一部分，或具有某种调控作用的dna序列。染色体中，编码在相同基因座上的dna被称为等位基因。在本文中，所用到的术语“str位点”或者“str基因座”或“多个str位点”中的str位点或者str基因座是指以2～6个碱基为核心单元，串联重复形成的dna遗传标记。这些表述均指同一概念。本发明所提供的一组str基因座，包括以下str位点：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11和damel。本发明所提供的一组str基因座，是指将这些str基因座组合应用，这些组合应用可以是任何形式来组合应用。例如利用不同的引物来同时扩增这些str基因座，实现犬的基因分型。再例如，包括这些str基因座的核酸序列，作为对照样品来使用等等。任何形式的同时利用这些str基因座的信息，均包含在本发明的保护范围内。根据上述str基因座，在至少一些实施例中，本发明提供了一种复合体系，所述复合体系能够扩增下列20个基因座：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11以及一个性别鉴定基因座damel。“复合体系”也可以表述为“复合系统”，指的是能够在同一个环境下，完成这20个基因座的同时扩增。应用本发明所提供的复合体系作为犬的个体识别，稳定性好，扩增效率高，灵敏度高，且基因座的选择是在全球多个国家和地区的犬群体研究结果的基础上，特异性选择了这20个基因座，能广泛适用于法医和商业领域犬类的个体识别、亲缘鉴定以及dna档案数据库的建立等。在至少一种实施方式中，所述复合体系可以进一步包括：第一复合体系、第二复合体系、第三复合体系和第四复合体系，所述第一复合体系用于区分ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23；所述第二复合体系用于区分inra21、damel、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253；所述第三复合体系用于区分aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054；所述第四复合体系用于区分inu005、ren64e19、inu055、ren54p11；而内标则选用橙色荧光标记，荧光标记物为atto633。所述第一复合体系、第二复合体系、第三复合体系、第四复合体系分别带有不同的荧光标记，以实现每种复合体系的区分。例如可以使用fam(6’-羧基荧光素)蓝色荧光标记、hex(六氯-6-甲基荧光素)绿色荧光标记、tamra(4-甲基-6-羧基-罗丹明)黄色荧光标记、rox(羧基-x-罗丹明)红色荧光标记和cy5(indodicarbocyanine)紫色荧光标记。在本发明的一种具体实施方式中，所述第一复合体系中标记有fam蓝色荧光标记；所述第二复合体系标记有hex绿色荧光标记；所述第三复合体系标记有tamra黄色荧光标记；所述第四复合体系标记有rox红色荧光标记。每一复合体系中各位点扩增产物根据长度差异分开，相邻两个str位点不能有重叠，从而在一个总的复合体系中实现所有位点的区分，用于基因分型。应用本发明的复合体系，能够在单管内一次性扩增所有str基因座，借助于荧光标记手段，可在90分钟内完成pcr扩增、120分钟内得到基因分型图谱，极大地节省了物料和时间成本。在至少一种实施方式中，所述复合体系进一步包括：引物序列seqidno:1～seqidno:40，各引物序列的具体核苷酸序列以及所对应的扩增位点如表2所示。利用这些引物扩增，各产物的长度在400bp以内。表2用于各str基因座扩增的引物信息而且将各引物混合，进行复合扩增试验验证，确定没有非特异性扩增现象和交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，可以使得组内各个片段峰值均衡性都达到40％以上。为此，根据本发明的实施例，所述引物根据编号seqidno:1～seqidno:40从小到大，每两个引物为一对，根据表2中所示，各对引物在扩增反应体系中的终浓度分别为：(2.15±0.1)μm，(0.45±0.1)μm，(0.84±0.1)μm，(0.60±0.1)μm，(0.75±0.1)μm，(1.25±0.1)μm，(0.30±0.1)μm，(0.38±0.1)μm，(0.92±0.1)μm，(0.35±0.1)μm，(0.40±0.1)μm，(2.00±0.1)μm，(0.65±0.1)μm，(0.50±0.1)μm，(1.15±0.1)μm，(0.30μm)μm，(1.25±0.1)μm，(2.00±0.1)μm和(0.63±0.1)μm。。由此可以实现所有位点的共扩增。根据本发明的实施例，利用上述复合体系可以制备试剂盒。所述试剂盒可以包括上述复合体系。除此之外，试剂盒中还可以包括pcr缓冲液、dna模板、1u至2u的taqdna聚合酶以及各0.2mm的dntp混合物。本发明的pcr扩增反应的缓冲液包括：10mmdmso，50mmkcl，10mmtris-hcl(ph8.3，25℃)，2.0mmmgcl2，0.1mg/mlbsa(牛血清白蛋白)。dntp混合物是四种脱氧核糖核苷酸(datp、dttp、dctp、dgtp)等摩尔混合物。另外，试剂盒还可以进一步包括：分子量内标，分子量内标选用与复合体系中各引物不同的荧光标记进行标记。例如可以用荧光标记物atto633标记为橙色。分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的dna片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种基因分型的方法，包括：对待测样品内的基因座进行扩增，得到经扩增的等位基因，所述str基因座包括ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11和damel；对所述经扩增的等位基因进行分析，以获得基因分型结果。根据本发明的实施例，所述待测样品为含有犬dna的样品。在至少一种实施例中，从犬类血液(血斑)、组织、唾液及毛发等中提取获得dna，提取方法是chelex-100法。dna的含量根据需要，可以在0.2到5ng范围之内。根据本发明的实施例，利用各种反应热循环仪(如abi9700、abiveriti、bio-radmycycler等)进行所述扩增。在至少一种实施例中，利用如下条件进行扩增：95℃预变性5分钟；95℃变性10秒钟，58℃退火1分钟，70℃延伸20秒钟，该步骤重复28个循环；60℃继续延伸30分钟；4℃～12℃保存。复合扩增后产物的检测方法采用单道或多道毛细管电泳遗传分析仪(3500、3130)上进行检测。根据本发明的实施例，将扩增产物与甲酰胺、分子量内标按30:1的比例进行混合变性后，再使用毛细管电泳法分离。在毛细管电泳技术中，这些荧光标记产物由于片段大小不同而被分离，在激光激发下发出可识别的光信号，能够被遗传分析仪(abi3130、3100、3500等)成功接收，精准地读取其片段大小。分子量内标为荧光标记的多条已知片段大小的dna片段混合物，以其为参照可计算复合扩增产物的片段大小并与等位基因阶梯进行比对，从而分析判断被检样本各位点的基因型。电泳后的数据可以在idx、genemarker等数据分析软件上，转化、分析得到准确的str基因分型信息和直观图谱。本发明还提供了一种基因分型系统，如图3所示，包括：扩增单元和等位基因确定单元，所述扩增单元用于对待测样品内的下列基因座进行扩增，得到等位基因扩增产物，所述基因包括：ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11和damel；所述等位基因确定单元与所述扩增单元相连，所述等位基因确定单元用于对所述等位基因扩增产物进行分析，以获得基因分型结果。根据本发明的实施例，基因分型系统还可以包括分离单元，如图4所示，分离单元与所述扩增单元相连，等位基因确定单元与分离单元相连，分离单元用来对所述等位基因扩增产物进行分离。例如可以通过毛细管凝胶电泳对所述等位基因扩增产物进行分离。另外，本发明还提供了一种用于犬个体识别的设备，如图5所示，所述设备包括dna获取系统、基因分型系统和分析系统，基因分型系统与dna获取系统相连，分析系统与基因分型系统相连。dna获取系统用于从待测犬中获取dna，得到含有犬dna的样品；基因分型系统利用含有犬dna的样品，获得所述dna的基因分型结果；分析系统根据基因分型结果，对所述犬进行个体识别。所述分析系统还可以根据所述基因分型结果，对所述犬进行亲缘鉴定。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1str位点确定根据国际动物遗传学会推荐的犬类基因分型位点确定了本发明19个str位点(ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23、inra21、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、inu055、ren54p11)和一个性别鉴定位点damel，可同时获得20个位点信息。在选择用于犬的基因分型的str位点时，可供选择的位点众多，一味地对尽可能多的位点组合来应用，一方面会增加分型时的工作量，另一方面位点越多时，也会造成在检测时，结果会出现相互干扰，影响分型的准确性。而所选取的位点不足或者不恰当的时候，会出现针对两个不同样本，所获得的分型结果极其相似，从而不能准确区分。本发明的发明人通过比较分析各位点的位置，重复单元的情况，以及组合应用不同位点时，对于基因组的覆盖和交叉影响的结果，最终确定了上述位点。并通过对不少于20只随机犬的样本分型来进行了验证，获得了准确的分型结果。通过本发明所选择的20个位点，可以应用于犬的基因分型中，快速全面地实现对于犬个体的识别和亲缘鉴定。实施例2对随机犬1的基因分型结果实施例2提供了以随机犬1的样品为例，利用实施例1提供的str位点进行基因分型的结果。随机挑选犬1的体毛样品，提取其中的dna，设计引物对dna进行扩增，以便获得含有实施例1的20个位点的核酸序列，并进行电泳检测及分析，获得犬的基因分型图。其中dna采用chelex-100法提取(具体方法参考《forensicdnaprotocol》，humanapress，1998)，然后对提取得到的dna样本进行扩增，扩增反应在(如abi9700、abiveriti、bio-radmycycler等)热循环仪上进行，电泳及检测在abi3500遗传分析仪上进行，数据分析采用idx软件。本发明所用的试剂和材料诸如甲酰胺、内标等均为本领域技术人员常用的常规材料。1、犬样本dna浓度稀释chelex-100法提取dna，所获得的dna浓度为10.15ng/μl，将其稀释到1ng/μl用于实验。2、荧光标记引物混合配制针对实施例1中的20个位点，分别设计引物，各引物序列如表2所示。然后将各引物上连接不同的荧光基团。其中用于扩增ahtk211、cxx279、inu030、ren169d01、ren247m23的引物，用蓝色荧光fam标记；用于扩增inra21、damel、ren169o18、ren105l03、fh2848、ahtk253的引物，用绿色荧光hex标记；用于扩增aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054的引物，用黄色荧光tamra标记；用于扩增inu005、ren64e19、inu055、ren54p11的引物，用红色荧光rox标记。利用各引物进行扩增，所扩增出来的dna片段大小示意图如图1所示，图1中100～350即为dna片段的大小，单位为bp。将所有引物按照表3中给出的浓度混合，配制成引物混合物。其中表3中示出的引物终浓度代表各位点所对应的正向引物和反向引物之和，正向引物和反向引物含量相同，为1：1。表3.本发明复合扩增体系各str位点引物信息位点名称引物序列编号扩增体系中引物终浓度(μm)ahtk211seqidno:1和seqidno:22.15cxx279seqidno:3和seqidno:40.45inu030seqidno:5和seqidno:60.84ren169d01seqidno:7和seqidno:80.60ren247m23seqidno:9和seqidno:100.75inra21seqidno:11和seqidno:121.25damelseqidno:13和seqidno:140.30ren169o18seqidno:15和seqidno:160.38ren105l03seqidno:17和seqidno:180.92fh2848seqidno:19和seqidno:200.35ahtk253seqidno:21和seqidno:220.40aht121seqidno:23和seqidno:242.00aht137seqidno:25和seqidno:260.65ren162c04seqidno:27和seqidno:280.50ahth171seqidno:29和seqidno:301.15fh2054seqidno:31和seqidno:320.30inu005seqidno:33和seqidno:341.25ren64e19seqidno:35和seqidno:362.00inu055seqidno:37和seqidno:380.63ren54p11seqidno:39和seqidno:400.653、聚合酶链式反应(pcr)扩增1)取缓冲液、引物混合物(引物终浓度见表3)、taq酶，按照表4配成混合液，振荡混匀后分装至pcr反应管中，每管25μl，加入模板dna。表4复合扩增反应体系组分体积(μl)引物混合物(5×primersets)5缓冲液(2.5×pcrmastermix)10热启动taq酶0.4(2u)dna0.2ng-5ng无核酸酶水补充至25μl2)按照表5的反应条件设置热循环仪(g1000)，将pcr反应管放入仪器中进行pcr扩增。表5复合扩增热循环条件3)扩增反应结束后，取出反应管，用abi3500遗传分析仪进行电泳和检测。电泳结果用idx软件进行分析，对随机犬样本的分型结果详见图2。图2结果显示，pcr复合扩增和dna分型检测，结果稳定、图谱清晰完整，19个str基因座和1个damel性别基因的扩增产物峰高保持平衡，证明应用本发明提供的str位点以及分型方法能够用于犬基因分型，结果准确可信。实施例3对随机犬2的基因分型结果实施例3提供了以随机犬2的样品为例，利用实施例1提供的str位点进行基因分型的结果。随机挑选犬2的体毛样品，提取其中的dna，设计引物对dna进行扩增，以便获得含有实施例1的20个位点的核酸序列，并进行电泳检测及分析，获得犬的基因分型图。具体实施步骤同实施例2。图6结果显示，pcr复合扩增和dna分型检测，结果稳定、图谱清晰完整，19个str基因座和1个damel性别基因的扩增产物峰高保持平衡，证明本发明所提供的str位点以及分型方法能够用于犬基因分型，结果准确可信。实施例4使用与本发明不同的基因座对随机犬1进行基因分型选取21个str位点：ahtk211、inu055、inu030、ren105l03、ren169d01、ahth260、ren247m23、inra21、ahth130、ren169o18、fh2848、ahtk253、aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054、inu005、ren64e19、cxx279和ren54p11，以及1个性别鉴定位点damel。其中，与实施例1中不同的str位点为ahth260、ahth130。并且即便是相同位点，与实施例2中使用不同引物序列的位点为ren169d01、damel、ren105l03、fh2848、inu005、inu055、ren54p11。具体地，这些位点所用的引物序列分别如下：用于扩增ren169d01位点的引物分别为：agtgggttgcaagtggaac(seqidno:41)aatagcacatcttccccacg(seqidno:42)用于扩增damel位点的引物分别为：gtgccagctcagcagcccgtggt(seqidno:43)tcggaggcagaggtggctgtggc(seqidno:44)用于扩增ren105l03位点的引物分别为：ggacaatgctaaggctcacctacc(seqidno:45)cttctggtgcctgacaagatggaat(seqidno:46)用于扩增fh2848位点的引物分别为：caaaaccaacccattcactc(seqidno:47)gtcacaaggacttttctcctg(seqidno:48)用于扩增inu005位点的引物分别为：ctttctaccagcaaggttac(seqidno:49)ttcccatttaattgcctct(seqidno:50)用于扩增inu055位点的引物分别为：ccaggcgtccctatccatct(seqidno:51)gcaccactttgggctccttc(seqidno:52)用于扩增ren54p11位点的引物分别为：gggggaattaacaaagcctgag(seqidno:53)tgcaaattctgagccccactg(seqidno:54)用于扩增ahth260位点的引物分别为：cgctatacccacaccaggac(seqidno:55)ccacagaggaagggatgc(seqidno:56)用于扩增ahth130位点的引物分别为：gtttctctcccttcgggttc(seqidno:57)gacgtgtgttcacgccag(seqidno:58)用于其他str位点的引物序列同实施例2。其中，用于扩增ahtk211、inu005、inu030、ren105l03、ren169d01、ahth260、ren247m23的引物，用蓝色荧光fam标记；用于扩增inra21、ahth130、ren169o18、damel、fh2848、ahtk253的引物，用绿色荧光hex标记；用于扩增aht121、aht137、ren162c04、ahth171、fh2054的引物，用黄色ltam标记；用于扩增cxx279、ren64e19、inu055、ren54p11的引物，用红色荧光rox标记。其中各引物终浓度为：表6各引物浓度位点名称扩增体系中引物终浓度(μm)ahtk2111.96inu0050.98inu0301.00ren105l030.65ren169d010.65ahth2600.20ren247m230.50inra210.60ahth1300.50ren169o180.50damel0.52fh28480.40ahtk2531.88aht1210.50aht1370.50ren162c040.30ahth1710.30fh20540.50cxx2790.50ren64e190.25inu0550.50ren54p110.50参照实施例2的方法步骤，对以上位点进行复合扩增。扩增反应结束后，使用abi3500遗传分析仪对扩增产物进行电泳和检测。电泳结果用idx软件进行分析，分型结果如图7所示。结果显示，采用该实施例的snp位点进行基因分析，分型效果并不好。主要表现在：ren169d01、damel、ren105l03、fh2848、inu005、inu055、ren54p11、ahth260、ahth130位点上出现复合扩增效率低、分型效果不好、有杂峰以及不同位点的等位基因位置交叉重叠等现象。而在上述结果基础上，发明人重新设计了扩增以上位点的引物，并且经过多次实验后，发现ahth260与ahth130的分型效果仍然不好。实验结果表明，采用本发明实施例1所提供的snp位点用作犬的基因分型，结果准确可靠。应用这些snp位点，设计引物，可以用于犬个体识别、亲缘鉴定以及dna档案数据库的建立等，在法医学和商业领域发挥重要的价值。在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>深圳华大法医科技有限公司<120>用于犬基因分型的基因座及用途<130>pidc3185391<160>58<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>1ttagcagccgagaaatacgc20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>2attcgcccgactttggca18<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>3tgctcaatgaaataagccagg21<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>4ggcgaccttcattctctgac20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>5ggctccatgctcaagtctgt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>6cattgaaagggaatgctggt20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>7tctgcccacccacactctgaaa22<210>8<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>8ccagggtctaatcttcccatacactct27<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>9tggtaacaccaaggctttcc20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>10tgtcttttccatggtggtga20<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>11atgtagttgagatttctcctacgg24<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>12taatggctgatttatttggtgg22<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>13gttaacaatgccctgggctctg22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>14gcartgcaggcttgaggcaac21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>15cacccaacctgtctgttcct20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>16actgtgtgagccaatccctt20<210>17<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>17ggctcacctaccttgtttcttgattct27<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>18tggtgcctgacaagatggaataagtg26<210>19<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>19gcatacagtaccttatcaactctttccc28<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>20gccagaatggactaagccataccc24<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>21acatttgtgggcattggggctg22<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>22tgcacatggaggacaagcacgc22<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>23tattgcgaatgtcactgctt20<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>24atagatacactctctctccg20<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>25tacagagctcttaactgggtcc22<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>26ccttgcaaagtgtcattgct20<210>27<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>27ttccctttgctttagtaggttttg24<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>28tggctgtattctttggcaca20<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>29aggtgcagagcactcactca20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>30cccatccacagttcagcttt20<210>31<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>31gctctcttcatgttcccgcagtg23<210>32<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>32tgccaataagtggtagatgctgagt25<210>33<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>33tcagacaacccatgtccagtaaatac26<210>34<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>34actctctttctaccagcaaggttact26<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>35tgtattttaatgtggcagttt21<210>36<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>36gacaaggacaggcaatacagt21<210>37<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>37cactttgggctccttcctgaacag24<210>38<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>38aggcgtccctatccatctgcatt23<210>39<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>39cctatctttgtcatacctgtgtggagtc28<210>40<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>40ggcatcagcatcacctgggaac22<210>41<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>41agtgggttgcaagtggaac19<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>42aatagcacatcttccccacg20<210>43<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>43gtgccagctcagcagcccgtggt23<210>44<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>44tcggaggcagaggtggctgtggc23<210>45<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>45ggacaatgctaaggctcacctacc24<210>46<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>46cttctggtgcctgacaagatggaat25<210>47<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>47caaaaccaacccattcactc20<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>48gtcacaaggacttttctcctg21<210>49<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>49ctttctaccagcaaggttac20<210>50<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>50ttcccatttaattgcctct19<210>51<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>51ccaggcgtccctatccatct20<210>52<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>52gcaccactttgggctccttc20<210>53<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>53gggggaattaacaaagcctgag22<210>54<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>54tgcaaattctgagccccactg21<210>55<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>55cgctatacccacaccaggac20<210>56<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>56ccacagaggaagggatgc18<210>57<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>57gtttctctcccttcgggttc20<210>58<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列<400>58gacgtgtgttcacgccag18当前第1页12