与小麦苗期根系构型相关的KASP标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及与小麦苗期根系构型相关的kasp标记引物、包含该kasp标记引物的试剂盒以及利用该kasp标记引物鉴定或辅助鉴定小麦根系性状的方法。

背景技术：

根系作为支撑和固定植物地上部重要器官，也是合成多种激素、氨基酸物质的主要场所，优良的根系构型及根际进程为植株养分高效利用提供重要保障，并在促进作物生长与产量形成方面起关键支撑作用(kaushik等，2017)。植物生长初期根系发育对养分施入极为敏感，利用遗传育种方法掌握与地上部生长发育相适应并具有持久稳定活力的根系成为现代分子育种技术的重要环节。小麦根系构型不仅是奠定植株生长势强弱的基础，还与其抗旱、抗干热风能力密切相关。结合当今世界范围内极端气候频发及资源稀缺，培育高产稳产抗逆的小麦品种已经成为育种家们的研究热点。针对不同基因型小麦根系特性差异，挖掘苗期根系生长发育遗传调控机制,可为抗旱节水小麦品种选育过程中正确选择根系指标提供科学依据，对旱地小麦高产、高效栽培及充分利用土壤资源具有重要意义(baker等，2015)。由于根生长于地下，对其开展取样研究存在较大瓶颈，通过发掘根系结构相关分子标记结合育种工作，可降低劳动强度、提高育种效率，为小麦高产及品种改良提供实际意义(张维军等，2018)。

分子标记辅助选择技术可跟踪转育或聚合根系基因，为培育具有优良根系且高产广适型小麦品种提供了有效技术手段。发掘控制根系性状基因及其基因标记是开展分子标记辅助育种的前提，目前在水稻玉米上研究较为广泛。yusaku等(2013)通过对水稻深根基因dro1(deeperrooting1)的研究证明，dro1位于第9染色体，它的增强表达可以减小根系夹角，增加根系向下生长的趋势。研究表明，dro1是一个早期生长素响应基因，通过生长素起负向调节作用参与根尖细胞的伸长，可能直接受生长素信号通路arfs的影响。水稻第9染色体上携带的控制根系深度相关的qtl不仅利于提高植物抗旱性，而且可增强植物对根系营养元素的吸收，该基因遗传区段rm242-rm201对应标记已应用于分子辅助育种中，并获得携带该基因且根系性状优良的株系(steele等，2006)。此外，一个与玉米产量和根系相关的主效qtl已被发掘，并得到应用(landi等，2010)。小麦基因组结构较水稻和玉米复杂，根系性状如根长度、表面积、体积和干物质重等受多基因控制，在一定程度上还受控制株高基因rht影响，与株高相关的矮杆基因rht-b1c、rht-d1c和rht12显著降低小麦苗期根长、根表面积、根体积；部分苗期根系性状qtl和千粒重qtl在同一标记区间内，说明千粒重与苗期根系有密切联系(bai等，2013；lopes等，2010)。多数根部性状基因与肥水利用、农艺性状及产量性状相关基因相关联(bai等，2013)，但鲜有紧密连锁标记的报道。cao等(2014)通过研究178a(短根系)和178b(长根系)两种不同根系类型小麦品种杂交后代f1、f2的根系，发现qtalro-b1是影响普通小麦根系长度和相关性状的数量性状位点(qtl)。

因此，本领域需要开发与小麦苗期根系构型相关的连锁标记，从而利用该标记用于筛选苗期根系性状优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

技术实现要素：

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一个与小麦苗期根系构型相关的snp位点，并基于该位点开发了kasp标记专用引物，该kasp标记引物可以用来鉴定或辅助来鉴定小麦根系性状，进而能够筛选苗期根系性状优良的小麦品种。

在第一个方面，本发明提供了一种kasp标记引物组(在下文中有时简称“本发明的kasp标记引物组”)，所述kasp标记引物组可用于检测小麦4d染色体16.64mb位置处的基因(其核苷酸序列如序列表中的序列4所示)的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型。该kasp标记引物组包括上游引物f1、上游引物f2及下游引物r中的至少两种引物，其中所述上游引物f1的序列如序列1所示；所述上游引物f2如序列2所示；所述下游引物r的序列如序列3所示。

在一个实施方案中，所述上游引物f1包括自5’端到3’端依次排列的fam荧光序列和第22-39位的单链dna，所述fam荧光序列是序列1中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列9所示；所述上游引物f2包括自5’端到3’端依次排列的hex荧光序列和第22-39位的单链dna，所述hex荧光序列为序列2中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列10所示。

在一个实施方案中，本发明的kasp标记引物组可以仅包含引物f1和引物r两种引物，其用于扩增或检测序列4所示基因的第36位dna的基因型为aa的片段。

在另一个实施方案中，本发明的引物组可以仅包含引物f2和引物r两种引物，其用于扩增或检测序列4所示基因的第36位dna的基因型为gg的片段。

在第二个方面，本发明提供了一种试剂盒(在下文中有时简称为“本发明的试剂盒”)，该试剂盒包含本发明的kasp标记引物组。该试剂盒可以用于鉴定或辅助鉴定待测小麦的根系性状。

在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒还包含荧光探针、淬灭探针、taq酶和dntp等完成pcr扩增所需要的必要试剂。

在第三个方面，本发明提供了一段dna片段，其位于小麦4d染色体16.64mb位置处，且其核苷酸序列如序列4所示。

在第四个方面，本发明提供了一个与小麦苗期根系构型相关的snp位点(在下文中有时简称为“本发明的snp位点”)，该位点位于4d染色体16.64mb位置处的基因(其核苷酸序列如序列4所示)的第36位(4d染色体16.64mb位置处的基因的序列和本发明的snp位点的相对位置还可参见图1)。在本发明中，该snp位点被命名为ax-109816583。

在一个实施方案中，所述snp位点的基因型为aa、ag或gg，其中所述aa基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述ag基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a和g的杂合体；所述gg基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体。

在第五个方面，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦根系性状的方法(下文中有时简称为“本发明的鉴定方法”)，所述方法包括以下步骤：

1)检测待测小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是aa、gg和ag中的哪一种；以及

2)根据步骤1)所获得的所述待测小麦的基因型确定aa基因型的待测小麦的根系性状优于gg或ag基因型的待测小麦，

其中所述aa基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述ag基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a和g的杂合体；所述gg基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体；所述4d染色体16.64mb位置处的基因的核苷酸序列如序列4所示。

在一个优选实施方案中，所述小麦根系性状是小麦苗期根系性状。在另一个优选实施方案中，所述小麦根系性状以根苗比(rrs)表示，即，步骤2)中确定aa基因型的待测小麦的根苗比大于gg或ag基因型的待测小麦。优选地，所述小麦根系性状是小麦苗期根苗比。

在本发明的鉴定方法中，步骤1)的检测步骤包括：

a)以所述待测小麦的基因组dna为模板，采用本发明的kasp标记引物组进行pcr扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，和

b)根据所述荧光信号判断待测小麦4d染色体16.64mb位置的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是aa、gg和ag中的哪一种。

在步骤a)中所采用的kasp引物组由上游引物f1、上游引物f2及下游引物r组成；其中所述上游引物f1的序列如序列1所示；所述上游引物f2的序列如序列2所示；以及所述下游引物r的序列如序列3所示。

在一个实施方案中，上游引物f1包括自5’端到3’端依次排列的fam荧光序列和第22-39位的单链dna，所述fam荧光序列是序列1中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列9所示；上游引物f2包括自5’端到3’端依次排列的hex荧光序列和第22-39位的单链dna，所述hex荧光序列为序列2中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列10所示。

在本发明的鉴定方法中，根据荧光信号判断的步骤可以包括利用klustercaller^tm软件根据荧光信号判断基因型：若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现蓝色，则待测小麦的基因型为aa；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现红色，则待测小麦的基因型为gg；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现绿色，则待测小麦的基因型为ag。

在本发明的鉴定方法的一个具体实施方案中，用于pcr扩增的pcr扩增体系可以采用如下的体系(总体积为5.2μl)：20ng/μl模板dna3.0μl，2×kaspreactionmix2.0μl，引物混合试剂0.1μl，ddh2o0.1μl，其中2×kaspreactionmix包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b、以及高保真的taq酶和dntp等。荧光探针a的序列为5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′(序列5)，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b的序列为5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′(序列6)，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′(序列7)，3′末端连接淬灭基团bhq；淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′(序列8)，3′末端连接淬灭基团bhq。引物混合试剂包括引物f1、引物f2和引物r。在一个优选实施方案中，引物f1和引物f2在pcr扩增体系中体积比为1:1，例如，两者在pcr扩增体系中的终浓度均为0.134μm，引物r在pcr扩增体系中的终浓度为0.336μm。

在一个优选实施方案中，pcr扩增可以采用touchdownpcr扩增程序，具体如下：94℃预变性15min；(touchdown程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

在一个优选实施方案中，pcr扩增反应可以在本领域中常用的pcr扩增仪(例如，ptc-200pcr扩增仪)上进行，得到pcr扩增产物，然后将pcr扩增产物在本领域中常见的荧光酶标仪(例如，pherastarplus荧光酶标仪)上用荧光照射进行基因分型，再利用本领域中常用的荧光分型软件(例如，klustercaller^tm软件)读取分型后的数据。

在第六个方面，本发明提供了本发明的snp位点在如下(a1)-(a6)中任一种中的应用：

(a1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系性状；

(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦根系性状的产品；

(a3)选育小麦根系性状优良品种；

(a4)制备选育小麦根系性状优良品种的产品；

(a5)小麦育种；和

(a6)制备小麦育种的产品。

在第七个方面，本发明提供了一种选育根系性状优良的小麦的方法，该方法包括选择aa基因型的小麦品种进行育种，得到目的小麦；所述aa基因型为小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述4d染色体16.64mb位置处的基因的核苷酸序列如序列4所示。

在本发明中，小麦根系性状以根苗比表示，因此根系性状优良的小麦是指根苗比相对较大的小麦品种。优选地，根系性状是苗期根系性状。因此，优选地，所述小麦根系性状是指小麦苗期根苗比。

在本发明中，小麦包括但不限于如下品种中的任一种或任几种：阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号和镇麦6号等。

本发明的有益效果

本发明提供了一个与小麦苗期根系构型相关的snp位点，并基于该位点开发了kasp标记专用引物。利用本发明的kasp标记专用引物可用于鉴定待测小麦的基因型为aa、gg还是ag，根据待测小麦的基因型可确定aa基因型的待测小麦的根系性状(根苗比)大于ag或gg基因型的待测小麦，进而用于筛选苗期根系性状(根苗比)优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

附图说明

图1图示了小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的核苷酸序列以及本发明的snp位点的位置，图1中显示该snp位于第36位脱氧核糖核苷酸(见下划线，括号中的a/g表示在此位点a可以变异为g)。

图2图示了扬麦16和中麦895在高氮浓度下的苗期根系表型。

图3图示了本发明的snp标记与qrrs.caas-4ds基因的连锁图。

图4图示了供试小麦品种根苗比基因的kasp标记检测结果。

具体实施方式

定义：

kasp：kasp^tm基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性pcr，可对包括复杂基因组的各种基因组dna样本，针对重测序数据或者其他数据的snp和indel进行高精度双等位基因分型，或者kasp可以对经过性状定位得到的候选标记进行大群体的验证工作。kasp技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对snp分型以及检测indels。由于snpline的高度灵活性，其应用也十分广泛，适合于各种基因分型研究，无论是低通量研发项目，ngs之后的snp验证，还是农业种群研究等都是其适用的范围。由于传统方式对品种进行鉴定或对种子质量进行评估的成本较高，鉴定周期较长，而kasp技术则可以有效的避免这两个缺点，使得育种成本大大降低，鉴定周期也明显缩短，因此，kasp技术对于分子育种工作中品种鉴定与种子质量控制是一项优选技术。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的所有引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。下述实施例中的所有小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

实施例1、与小麦苗期根系构型相关的kasp标记专用引物的获得

一、根系性状调查及snp标记分析

1、根系性状调查

选用扬麦16(中国农业发展集团有限公司，品种权号：cna20030436.4)/中麦895(河南新大农业发展有限公司，国审麦2012010)dh群体，包括亲本共200个家系作为实验材料进行根部试验，对根部性状进行调查。(注：中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、根系活力强、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。)

根部试验采用水培法，即每种实验材料选取30粒种子。具体步骤如下：用10％h2o2浸泡处理种子15-20分钟，无菌水冲洗5-6次；然后从处理后的种子中选取饱满且大小一致的种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱暗室催芽；每种实验材料挑选发芽一致的幼苗培养，培养盘置于营养液中在可控温室内培养，营养液配置参照文献(ren等，2012)中的方法。连续培养10天后对苗期根部性状进行调查(图2图示了扬麦16和中麦895在高氮浓度下苗期根系表型)。调查性状包括总根长、总根尖数和根系干重。

2、snp标记分析

snp(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(capitalbiocorporation,beijing,china；http://bioservices.capitalbio.com)利用illuminasnp基因分型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦实验材料基因组dna进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将dna片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gdna酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的dna片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(a/t和c/g)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gdna发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，a/t和c/g将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

利用illuminasnp基因分型研究平台对扬麦16/中麦895dh群体进行660ksnp芯片分型，包括bs、bobwhite、cap、d_contig等系列标记，共计630518个，其中626276个snp标记在扬麦16/中麦895dh群体内存在差异。

二、关联基因定位和连锁标记ax-109816583的发现

利用sas9.2软件(sasinstitute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合sas的glmselect程序对snp数据和根系性状进行逐步回归，根据p值(p<0.01)判断关联位点。定位出ax-109816583与位点qrrs.caas-4ds关联(p<0.001)。

三、ax-109816583位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取12个扬麦16/中麦895dh群体的全基因组dna。以各个基因组dna为模板用snp标记ax-109816583位点的等位基因特异标记kasp^tm基因分型检测，出现aa分型的片段(图4)。表明snp标记ax-109816583能够有效鉴定小麦品种根苗比。

表1、ax-109816583标记等位变异在扬麦16/中麦895dh群体中的分离

结果表明：ax-109816583位点的基因型仅为aa时，与小麦品种具有较大根苗比表型相符，说明ax-109816583位点能够有效鉴定小麦品种根苗比基因及其基因型。

根据wheatdartmapsversion1.2(http://www.triticarte.com.au)和allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记ax-109816583整合到小麦遗传图谱上，结果如图3所示。确定qrrs.caas-4ds在染色体4d上的16.64mb位置(也称为根苗比基因)。

四、kasp标记专用引物的开发

本发明针对snp位点(序列4中的第36位)开发的kasp标记专用引物由2条上游引物即引物f1和引物f2和1条下游引物即引物r组成。kasp标记专用引物序列如下：

引物f1：gaaggtgaccaagttcatgctgcaggaattccatctactccatgaa(序列1)；

引物f2：gaaggtcggagtcaacggattgcaggaattccatctactccatgag(序列2)；

引物r：tggcgagccttttactaagca(序列3)。

其中，序列1所示的引物f1中的下划线标注的序列为fam荧光序列(5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’，序列9)，序列2所示的引物f2中的中的下划线标注的序列为hex荧光序列(5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’，序列10)。引物f1与引物r组合可以扩增snp位点基因型为aa的片段，引物f2与引物r组合可以扩增snp位点基因型为gg的片段。

实施例2、snp的应用

选用15个非扬麦16/中麦895dh群体的后代品种和双亲中麦895、扬麦16。其中15个非扬麦16/中麦895dh群体后代品种为测试组，中麦895和扬麦16为对照组；包括阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

一、检测不同品种的小麦的苗期根系性状

小麦品种苗期根系性状鉴定于2016年冬在中国农业科学院作物科学研究所温室中进行。每个品种选取饱满且大小一致的种子30粒，用10％的h2o2处理20-30分钟，无菌水冲洗5-6次；再将种子置于铺有滤纸的培养皿中，在培养箱中暗室催芽18-24h；然后挑选发芽一致的种子25粒置于发苗网上，生长6天后选取大小一致的麦苗10株转移至培养盘中，每个培养盘进行3次重复；再将培养盘置于营养液中在可控温室内进行培养。营养液配置参照文献(reny,hex,liud,lij,zhaox,lib,tongy,zhanga,liz.majorquantitativetraitlociforseminalrootmorphologyofwheatseedlings.molecularbreeding,2012,30:139-148)中的方法。幼苗培养条件为温度22±1℃，相对湿度在50％-60％。每3天更换一次营养液，连续培养10天后对苗期根部进行收获。用扫描仪对各品种收获后的根系进行扫描，再用图像分析软件winrhizo(加拿大regentinstruments公司)分析如下根部性状：总根长、根系表面积、总根尖数和根系干重等。二、检测不同品种小麦snp位点的基因型

分别提取各个品种小麦的基因组dna，以基因组dna为模板，采用kasp标记专用引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。其中，携带荧光序列fam的pcr扩增产物经荧光照射显示红色，而携带荧光序列hex的pcr扩增产物经荧光照射显示蓝色。

pcr扩增体系如下(总体积为5.2μl)：20ng/μl模板dna3.0μl，2×kaspreactionmix2.0μl，引物混合试剂(assaymix)0.1μl，ddh2o0.1μl。2×kaspreactionmix包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等。荧光探针a的序列为5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′(序列5)，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b的序列为5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′(序列6)，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′(序列7)，3′末端连接淬灭基团bhq；淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′(序列8)，3′末端连接淬灭基团bhq。引物混合试剂中包括引物f1、引物f2和引物r，引物f1和引物f2在pcr扩增体系中的终浓度均为0.134μm，引物r在pcr扩增体系中的终浓度为0.336μm。

pcr扩增反应在ptc-200pcr扩增仪上进行，采用touchdownpcr扩增程序为：94℃预变性15min；(touchdown程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将pcr扩增产物在pherastar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在klustercaller^tm软件读取分型后的数据，仅显示蓝色图像则说明待测小麦4d染色体16.64mb位置的基因(序列4)的第36位snp位点碱基均为a，该小麦基因型为aa；仅显示红色图像则说明待测小麦4d染色体16.64mb位置的基因(序列4)的第36位snp位点碱基均为g，该小麦基因型为gg；显示绿色图像则说明待测小麦4d染色体16.64mb位置的基因(序列4)的第36位snp位点碱基为a和g，该小麦基因型为ag。

对各小麦品种pcr扩增产物进行两两比较，若a小麦pcr扩增产物仅显示蓝色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体，基因型为aa)，b小麦的pcr扩增产物为仅显示红色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体，基因型为gg)或绿色(序列4第36位脱氧核糖核苷酸为a和g的杂合体，基因型为ag)，则a小麦的根系性状(根苗比)优于b小麦。

上述各个小麦的基因型及其小麦苗期根系性状(根苗比)见表2所示。

表2、15个小麦品种的snp位点的基因型和根苗比结果

注：中麦895为aa；扬麦16为gg。

以上结果表明：皖麦52、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52和绵阳26在snp位点的基因型均为aa，并且这些小麦均具有较大的根苗比。从上述结果中还可看出，snp位点的基因型为aa的小麦的根苗比大于基因型为gg的小麦。

上述结果表明，本发明的snp位点可以快速、准确地鉴定小麦品种是否具有较大的根苗比。

本发明包括以下的实施方案：

1.一种kasp标记引物组，其中所述kasp标记引物组包括上游引物f1、上游引物f2及下游引物r中的至少两种引物，其中所述上游引物f1的序列如序列1所示；所述上游引物f2的序列如序列2所示；以及所述下游引物r的序列如序列3所示。

2.实施方案1所述的kasp标记引物组，其中所述上游引物f1包括自5’端到3’端依次排列的fam荧光序列和第22-39位的单链dna，所述fam荧光序列是序列1中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列9所示；所述上游引物f2包括自5’端到3’端依次排列的hex荧光序列和第22-39位的单链dna，所述hex荧光序列为序列2中的第1-21位所示的单链dna，其核苷酸序列如序列10所示。

3.实施方案1或2所述的kasp标记引物组，其中所述kasp标记引物组仅包含引物f1和引物r两种引物。

4.实施方案1或2所述的kasp标记引物组，其中所述kasp标记引物组仅包含引物f2和引物r两种引物。

5.一种用于鉴定或辅助鉴定待测小麦根系性状的试剂盒，其中所述试剂盒包含实施方案1-4中任一项所述的kasp标记引物组。

6.实施方案5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含荧光探针、淬灭探针、taq酶和dntp。

7.一种dna片段，其中所述dna片段位于小麦4d染色体16.64mb位置处，且其核苷酸序列如序列4所示。

8.一种与小麦苗期根系构型相关的snp位点，其中所述snp位点位于小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位，所述基因的核苷酸序列如序列4所示。

9.实施方案8所述的snp位点，其中所述snp位点的基因型为aa、ag或gg，其中所述aa基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述ag基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a和g的杂合体；所述gg基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体。

10.一种鉴定或辅助鉴定小麦根系性状的方法，其中所述方法包括以下步骤：

1)检测待测小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是aa、gg和ag中的哪一种；以及

2)根据步骤1)所获得的所述待测小麦的基因型确定aa基因型的待测小麦的根系性状优于gg或ag基因型的待测小麦，

其中所述aa基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述ag基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a和g的杂合体；所述gg基因型为4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为g的纯合体；所述4d染色体16.64mb位置处的基因的核苷酸序列如序列4所示。

11.实施方案10所述的方法，其中所述根系性状是根苗比。

12.实施方案10所述的方法，其中步骤1)的检测步骤包括：

a)以所述待测小麦的基因组dna为模板，采用实施方案1-4中任一项所述的kasp标记引物组进行pcr扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，以及

b)根据所述荧光信号判断待测小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸的基因型是aa、gg和ag中的哪一种；

其中所述kasp标记引物组由上游引物f1、上游引物f2及下游引物r组成；其中所述上游引物f1的序列如序列1所示；所述上游引物f2的序列如序列2所示；以及所述下游引物r的序列如序列3所示。

13.实施方案12所述的方法，其中根据所述荧光信号判断的步骤包括利用klustercaller^tm软件根据荧光信号判断基因型：若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现蓝色，则所述待测小麦的基因型为aa；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现红色，则所述待测小麦的基因型为gg；若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller^tm软件分析呈现绿色，则所述待测小麦的基因型为ag。

14.实施方案8或实施方案9所述的snp位点在如下(a1)-(a6)中任一种中的应用：

(a1)鉴定或辅助鉴定待测小麦根系性状；

(a2)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦根系性状的产品；

(a3)选育小麦根系性状优良品种；

(a4)制备选育小麦根系性状优良品种的产品；

(a5)小麦育种；和

(a6)制备小麦育种的产品。

15.一种选育根系性状优良的小麦的方法，该方法包括选择aa基因型的小麦品种进行育种，得到目的小麦；所述aa基因型为小麦4d染色体16.64mb位置处的基因的第36位脱氧核糖核苷酸为a的纯合体；所述4d染色体16.64mb位置处的基因的核苷酸序列如序列4所示。

16.实施方案5或6所述的试剂盒、实施方案10-13中任一项所述的方法、实施方案14所述的应用或实施方案15所述的方法，其中所述根系性状是苗期根系性状。

17.实施方案5或6所述的试剂盒、实施方案8或9所述的snp位点、实施方案10-13中任一项所述的方法、实施方案14所述的应用、实施方案15或16所述的方法，其中所述小麦选自如下品种中的任一种或任几种：阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号和镇麦6号。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>与小麦苗期根系构型相关的kasp标记及其应用

<130>gncjx182374

<141>2018-12-28

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattgcaggaattccatctactccatgag46

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tggcgagccttttactaagca21

<210>4

<211>71

<212>dna

<213>triticumaestivum

<400>4

gatagaattcggcaggaattccatctactccatgaatccaattattgaccatcttataaa60

aagcaaaccta71

<210>5

<211>21

<212>dna

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<400>5

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<400>8

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<211>21

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<400>9

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<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

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