本发明为一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型的试剂盒。
背景技术：
手足口病一种儿童传染病，又称为发疹性水疱性口腔炎。多发生于5岁以下儿童，潜伏期：多为2～10天，平均3～5天，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎等并发症，重症患儿可导致死亡。该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要临床症状。普通病例表现为：急性起病，发热、口痛、厌食、口腔黏膜出现散在疱疹或溃疡，手、足、臀部、臂部、腿部出现斑丘疹，后转为疱疹。皮疹数少则几个多则几十个，部分病例仅表现为皮疹或疱疹性咽峡炎，多在一周内痊愈，预后良好。重症病例表现为：少数病例（尤其是小于3岁者）病情进展迅速，在发病1～5天左右出现脑膜炎、脑炎（以脑干脑炎最为凶险）、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒为单链正义小rna，长度大约7.5kb，肠道病毒起初大体分为四类：脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒a型、柯萨奇病毒b型以及埃可病毒，其中62种致病的非脊髓灰质炎肠道病毒包括：23种亚型的柯萨奇病毒a型、6种亚型的柯萨奇病毒b型、28种亚型的埃可病毒以及5种其他型的肠道病毒。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），包括柯萨奇病毒a组的16、4、5、7、9、10型，b组的2、3、5、7型，埃可病毒中的某些型，以及肠道病毒71型等均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒a16型（coxa16）和肠道病毒71型（ev71）最为常见。
临床诊断病例具有下列之一者即可确诊：（1）肠道病毒（coxa16、ev71等）特异性核酸检测阳性。（2）分离出肠道病毒，并鉴定为coxa16、ev71或其它可引起手足口病的肠道病毒。（3）急性期与恢复期血清coxa16、ev716或其它可引起手足口病的肠道病毒中和抗体有4倍以上的升高。目前肠道病毒的检测主要有以下几种方法：（1）病毒分离是实验室诊断的“金标准”。对于急性感染病例，可用咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便以及组织液等样本，经青霉素（1000iu/ml）和链霉素（1000iu/ml）处理后接种单层vero细胞，待出现细胞病变后收集分离病毒。ev71常接种llc-mk2、mrc-5等细胞系。（2）中和试验以测得病毒的感染力为基础，有固定血清稀释病毒法和固定病毒稀释血清法两种。通过观察细胞病变程度了解北侧血清中抗肠道病毒的抗体水平。但病毒颗粒的完整性、抗血清滴度的强弱、宿主细胞的敏感性等都影响检测结果，而且整个实验需要双份血清，结果判读时间长，不利于快速诊断。
本发明提供一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型的检测试剂盒，利用taqman探针多色荧光pcr技术，选择在病毒序列相对保守的5’-utr区为靶位点设计肠道病毒通用引物和特异性引物探针，通过特异性探针检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型以及柯萨奇病毒a16型。同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行试验优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序，检测过程无需荧光pcr后的熔解曲线分析而仅凭不同荧光标记的探针检测就能检测肠道病毒，并区分肠道病毒71型以及柯萨奇病毒a16型；同时本发明还引入了人工构建的内参照系统，用于避免检测结果的假阴性。本发明的检测结果稳定可靠，试剂盒使用方便，检测灵敏度高，适合于环境、疾控以及临床中肠道病毒、柯萨奇病毒a16型、肠道病毒71型的快速检测。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型的检测试剂盒，其特征在于，基于肠道病毒5’-utr靶序列seqidno.1和seqidno.2设计引物探针，并对所设计的引物探针进行试验验证、浓度优化，同时对扩增体系中的重要组分及扩增程序进行优化，确定扩增效果最优的引物探针序列、最优扩增体系以及试验运行程序。通过taqman探针多波长荧光pcr技术单管扩增检测咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便以及组织液样本中肠道病毒，并对其中的柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型区分鉴别。
本发明的技术方案为：提供一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型的检测试剂盒，采用一步法荧光pcr技术对肠道病毒进行核酸定性检测。在使用磁珠法核酸提取纯化试剂对咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便以及组织液样本进行全自动核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需进行熔解曲线分析或者pcr产物开盖电泳，并且体系中引入了dutp-ung酶系统防止产物污染。本发明方法操作简便、检测灵敏、结果明晰、可靠性高。
1.实时荧光pcr引物探针的设计与优化
通过对genbank中肠道病毒5’-utr序列查询，用分子生物学专业软件对基因序列进行比对后发现，其中序列seqidno.1、seqidno.2两端序列在所有肠道病毒中较为保守，而seqidno.1、seqidno.2的中间序列则分别在肠道病毒71型以及柯萨奇病毒a16型中保守。因此，按照taqman荧光pcr设计的原则，基于seqidno.1和seqidno.2序列，设计肠道病毒通用型引物，同时设计肠道病毒通用型探针、ev71特异性谈和柯萨奇病毒a16型探针。通过试验验证、优化，选择效果较好的引物探针用于肠道病毒荧光pcr检测，同时进行柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型区分。确认的最优引物和探针碱基序列组合，肠道病毒通用型引物序列为seqidno.3、seqidno.4，肠道病毒通用型探针序列为seqidno.5，seqidno.5探针其5’端标记fam荧光基团。ev71和柯萨奇病毒a16型特异性探针分别为seqidno.6和seqidno.7的序列：ev71荧光探针可以为seqidno.6序列，其5’端标记joe荧光基团；柯萨奇病毒a16型荧光探针可以为seqidno.7序列，其5’端标记rox；三条探针3’端标记bhq1淬灭基团，序列如下。
上游引物为：
5’-ccctgaatgcggmtaatc-3’如seqidno.3所示。
下游引物为：
5’-attgtcaccataagcagcca-3’如seqidno.4所示。
探针序列为：
5’-cggaaccgactactttgggtgtcc-3’，5’端标记fam，3’端标记bhq1(blackholequencher)，如seqidno.5所示。
5’-agcacacgcccacaagccagc-3’，5’端标记joe荧光基团，3’端标记bhq1，如seqidno.6所示。
5’-agcgcgcaccctcaayccagg-3’，5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq1，如seqidno.7所示。
本发明的另一方面是采用了人工构建的内参对照系统，用于监测样本的提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参对照系统包括内参引物、探针和内参dna，内参dna为人工合成的dna序列，引物和探针序列如下：
5’-gtgcgtaggtggttgctt-3’，如seqidno.8所示。
5’-ctttcgtgcctcagtgtc-3’，如seqidno.9所示。
5’-ttcagcgagcgtgggacatcagg-3’，5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq3，如seqidno.10所示。
通过试验验证、优化，最后选择出四条引物四条探针，引物探针由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为50μm，-20℃保存。
2.试剂盒制备
含有上述引物和探针的肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒（荧光pcr法）（32人份），其主要组分如下：
（1）pcr缓冲液288μl，主要组分及反应终浓度：tris-hcl(ph8.3)15mm、kcl75mm、datp、dgtp、dctp、dutp各0.3mm、mgcl23mm。配制方法：在54ml超纯水中依次加入10xpcrbuffer75.0ml，100mmdatp、100mmdgtp、100mmdctp、100mmdutp各1.5ml，0.1mol/lmgcl215ml，振荡混匀，终体积为150.0ml，分装后即为试剂盒中缓冲液。
（2）引物探针256μl，主要组分及反应终浓度：肠道病毒引物各0.3μm、探针各0.2μm，内参引物各0.2μm，内参探针为0.1μm。配制方法：在28.02ml灭菌超纯水中分别加入720μl50pmol/μl引物seqidno.3、（终浓度为1.125pmol/μl），720μl50pmol/μl引物seqidno.4（终浓度为1.125pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.5（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.6（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.7（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl引物seqidno.8（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl引物seqidno.9（终浓度为0.75pmol/μl），240μl50pmol/μl探针seqidno.9（终浓度为0.375pmol/μl），分装后即为试剂盒中引物探针。
（3）dna聚合酶96μl，其中每个反应用量：taqdna聚合酶1.2u、ung酶0.05u、逆转录酶2.67u。配制方法：在45.4ml酶稀释液（外购）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）4ml、ung酶（1u/μl）600μl和逆转录酶（200u/μl）53.4μl，颠倒多次混匀,终体积为50.0ml。
（4）内参对照160μl，主要为合成的rna，配制方法为：用te溶液将质粒根据已知浓度，稀释至104copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，分装后即为内参。
（5）阴性对照400μl，为灭菌的甘油生理盐水。
（6）阳性对照和临界阳性对照400μl，甘油生理盐水稀释的rna，配制方法为：用含20%甘油的生理盐水溶液将转录rna根据已知浓度，分别稀释至105copies/ml、103copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，分装后即为阳性对照和临界阳性对照。
（7）将上述组分（1）～（6）分别进行抽检，检验合格后进行包装。
（8）上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次。
由（1）～（3）及模板配制的30μl反应体系，加入提取的样本后各组分浓度为：tris-hcl(ph8.3)15mm、kcl75mm、dntps(atp、dgtp、dctp、dutp)均为0.3mm、mgcl23mm，肠道病毒引物为0.3μm、探针各0.2μm，内参引物为0.2μm，内参探针为0.1μm，每个反应含taqdna聚合酶1.2u、ung酶0.05u、逆转录酶2.67u。
3.试剂盒使用方法
本发明试剂盒在样本检测过程中使用方法之一如下：
（1）样本提取
取临床采集的咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便以及组织液样本（拭子先用1ml生理盐水漂洗），样本分别吸取400μl置于磁珠法核酸提取纯化96孔板的a1-h1、a7-h7孔中，加入样本前应先在a1-h1、a7-h7孔中加入5μl内参，按照提取试剂盒说明书的要求设置自动提取程序进行核酸提取，提取板的a5-h5、a11-h11孔为提取的核酸用于荧光pcr扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同；
（2）扩增检测
按照发明内容中的方法，启封试剂盒，将各组分冻融振荡混匀后配制反应预混液，其配制方法如下：
a按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n配制反应液：取pcr反应液n×9μl、引物探针n×8μl、dna聚合酶n×3μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中，再分别加入10μl提取待检测的核酸
b取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光pcr仪上；
c荧光pcr反应程序如下：
[1]50℃25min
[2]95℃5min
[3]95℃10s
[4]60℃45s
[5]goto[3]，5cycles
[6]95℃10s
[7]60℃45s
[8]goto[5]，40cycles
在第五步采集fam、joe和cy5通道荧光信号；
[9]end
d仪器pcr程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析：fam通道和joe通道检测ct值满足ct<35，cy5通道检测结果应符合下表要求：ct<32。
4.有益效果
本发明根据上述位点设计多对引物探，通过试验验证选择最优的引物探针组合，并对反应体系和扩增条件进行优化，研制成肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒（荧光pcr法），其主要特点如下：
(1)采用特异性靶序列并据此设计引物探针，并通过荧光pcr扩增检测肠道病毒并同时区分肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型，试剂盒检测灵敏度高，结果稳定可靠；
(2)引入内参对照，可以监测提取和扩增整个过程，可以尽可能的避免假阳性和假阴性结果；
(3)扩增体系中的dutp-ung酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
本发明方法原理是基于taqman水解探针荧光pcr原理，以肠道病毒5’-utr为靶位点，采用特异性引物探针，经一步法荧光pcr实验，可快速、准确的检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于疾控和临床中肠道病毒、肠道病毒71型以及柯萨奇病毒a16型的检测。
具体实施方式
以下为该发明结合具体的实施例，进一步阐述本发明。
实施例1肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法)
1.引物探针合成
委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物探针，合成的引物探针序列具体如下：
上游引物为：
5’-ccctgaatgcggmtaatc-3’如seqidno.3所示；
下游引物为：
5’-attgtcaccataagcagcca-3’如seqidno.4所示；
探针序列为：
5’-cggaaccgactactttgggtgtcc-3’，5’端标记fam，3’端标记bhq1，如seqidno.5所示
5’-agcacacgcccacaagccagc-3’，5’端标记joe荧光基团，3’端标记bhq1，如seqidno.6所示
5’-agcgcgcaccctcaayccagg-3’，5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq1，如seqidno.7所示
本发明的另一方面是采用了人工构建的内参对照系统，用于监测样本的提取和扩增，避免检测结果假阴性，内参对照系统包括内参引物、探针和内参dna，内参dna为人工合成的dna序列，引物和探针序列如下：
5’-gtgcgtaggtggttgctt-3’，如seqidno.8所示；
5’-ctttcgtgcctcagtgtc-3’，如seqidno.9所示；
5’-ttcagcgagcgtgggacatcagg-3’，5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq3，如seqidno.10所示；
合成后用无菌双蒸水溶解至浓度为50μm，-20℃保存；
2.pcr缓冲液配制，在54ml超纯水中依次加入10xpcrbuffer75.0ml，100mmdatp、100mmdgtp、100mmdctp、100mmdutp各1.5ml，0.1mol/lmgcl215ml,振荡混匀,终体积为150.0ml，288μl分装；
3.引物探针配制，在28.02ml灭菌超纯水中分别加入720μl50pmol/μl引物seqidno.3、（终浓度为1.125pmol/μl），720μl50pmol/μl引物seqidno.4（终浓度为1.125pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.5（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.6（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl探针seqidno.7（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl引物seqidno.8（终浓度为0.75pmol/μl），480μl50pmol/μl引物seqidno.9（终浓度为0.75pmol/μl），240μl50pmol/μl探针seqidno.10（终浓度为0.375pmol/μl），256μl分装；
4.dna聚合酶，在45.4ml酶稀释液（外购）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）4ml、ung酶（1u/μl）600μl和逆转录酶（200u/μl）53.4μl，颠倒多次混匀,终体积为50.0ml，96μl分装；
5.内参对照，主要为合成的质粒，配制方法为：用te溶液将合成rna根据已知浓度，稀释至104copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，160μl分装；
6.阴性对照400μl，为灭菌的甘油生理盐水；
7.阳性对照和临界阳性对照400μl，甘油生理盐水稀释的rna，配制方法为：用含20%甘油的生理盐水溶液将转录rna根据已知浓度，分别稀释至105copies/ml、103copies/ml，旋涡震荡混匀10分钟，分装后即为阳性对照和临界阳性对照；
8.将上述组分2-7分别进行抽样检验，检验合格后进行包装；
9.上述组装的试剂盒在-20℃保存，冻融次数应小于3次；
制备工艺简述如下：
(1)合成的引物探针定量配制、浓度检测、抽样质检；
(2)将pcr缓冲液、taq酶、核酸提取液、内参照无菌分装，抽样质检；
(3)将阴性、阳性对照品进行浓度测定、分装，抽样质检；
(4)组装成品试剂盒，保存于-20℃。
实施例2肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法)的应用
采用本发明所得试剂盒对20例临床样本进行测试，同时用江苏默乐生物科技有限公司生产的ev71、ca16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒(荧光pcr法)进行平行对比试验，评价试剂盒效果。
1.肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法)检测临床样本
(1)样本提取
取临床采集的咽拭子、直肠拭子、疱疹液、粪便以及组织液样本(拭子先用1ml生理盐水漂洗)，样本分别吸取400μl置于核酸提取板的a1-h1、a7-h7孔中，加入样本前应先在a1-h1、a7-h7孔中加入5μl内参，按照提取试剂盒说明书的要求设置自动提取程序进行核酸提取，提取板的a5-h5、a11-h11孔为提取的核酸用于荧光pcr扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同；
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法，启封试剂盒，将各组分冻融振荡混匀后配制反应预混液，其配制方法如下：
a按反应样本数（反应样本数＝待检样品数＋对照品3个＋1）n配制反应液：取pcr反应液n×9μl、引物探针n×8μl、dna聚合酶n×3μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按20μl/管分装到反应管中，再分别加入10μl提取待检测的核酸
b取样本提取物、对照品提取物各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光pcr仪上；
c荧光pcr反应程序如下：
[1]50℃25min
[2]95℃5min
[3]95℃10s
[4]60℃45s
[5]goto[3]，5cycles
[6]95℃10s
[7]60℃45s
[8]goto[5]，40cycles
在第五步采集fam、joe、rox和cy5通道荧光信号；
[9]end
仪器pcr程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析，要求fam通道和joe通道以及rox通道检测ct值满足ct<35、cy5通道检测结果应符合下表要求ct<32。
2.ev71、ca16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒（荧光pcr法）对比检测临床样本
对比方法采用江苏默乐生物科技有限公司生产的ev71、ca16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒（荧光pcr法），并按其说明书进行临床样本操作检测，和本发明试剂盒分别检测20例手足口病临床标本，检测结果显示本发明试剂盒对20例标本均检出阳性，而对比方法试剂盒只有15例样本，显示本发明试剂盒对肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型检测灵敏度更高。
序列表
<110>上海星耀医学科技发展有限公司
<120>一种检测肠道病毒并区分柯萨奇病毒a16型和肠道病毒71型的试剂盒
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>204
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gtcctccggcccctgaatgcggctaatcccaactgcggagcacacgcccacaagccagcg60
ggtagtgtgtcgtaacgggtaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgttt120
ccttttatctttatattggctgcttatggtgacaattaaagaattgttaccatatagcta180
ttggattggccatccggtgtgcaa204
<210>2
<211>204
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<400>4
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>5’utr
<222>(2)..(25)
<223>b=“fam”，d=“bhq1”
<400>8
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<212>dna
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<221>5’utr
<222>(2)..(22)
<223>b=“joe”，d=“bhq1”
<400>8
bagcacacgcccacaagccagcd23
<210>9
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>5’utr
<222>(2)..(22)
<223>b=“rox”，d=“bhq1”
<400>9
bagcgcgcaccctcaayccaggd23
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
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<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
ctttcgtgcctcagtgtc18
<210>10
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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<222>(2)..(24)
<223>b=“cy5”，d=“bhq3”
<400>10
bttcagcgagcgtgggacatcaggd25