一种与苏淮猪肌肉滴水损失相关的SNP标记及检测方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肌肉滴水损失相关的snp标记及检测方法。

背景技术：

肉的持水力是指当肌肉收到外力作用，例如：加压、切碎、加热、冷冻、贮存、加工等，保持其原有水分的能力。持水力的表示方法很多，如滴水损失(driploss)、蒸煮损失(cookingloss)、离心损失(purgeloss)等。猪肉的持水力是衡量其品质和经济价值的一项重要指标。持水力的高低直接关系到肉及其制品的质地、弹性、嫩度、口感以及出品率等。

滴水损失指的是在不施加任何外力，只受重力作用下，蛋白质系统的液体损失量，称贮存损失或自由滴水。它能较好地模拟鲜肉在自然吊挂以及贮存销售过程中水分的流失状况，更能反应生产过程中水分的流失状况，因此在冷却肉生产中用得最多。滴水损失过程中除了会使可销售产品品质损失以外，同时也会引起重要蛋白质的损失，因此鉴别影响苏淮猪肌肉滴水损失的基因位点，利用分子标记辅助选育技术降低苏淮猪肌肉的滴水损失性状具有重要意义。

苏淮猪由淮安市淮阴种猪场、南京农业大学、江苏省畜牧总站和淮安市农业委员会等单位于1998年开始培育，2011年3月25日获得国家畜禽遗传资源委员会新品种授权，证书为“(农01)新品种证字第18号”。苏淮猪是在新淮猪基础上再导入大白猪血统，通过横交、多世代选育而成，含淮猪血统25％，大白猪血统75％。研究发现，苏淮猪肌肉滴水损失平均值为(1.83±0.07)％(mean±se，n＝301)，变异系数为67.88％，而中国地方猪的持水力较强，滴水损失总的平均水平为0.8％。由此可见，苏淮猪肌肉滴水损失性状仍有较大的选育改善空间。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供与苏淮猪肌肉滴水损失相关的snp标记并将其开发为分子标记。

本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物对和检测方法。

本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。

一种开发与苏淮猪肌肉滴水损失性状相关的分子标记的方法，以含有国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点转化为分子标记。

所述的引物对序列为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3。

按照上述的方法得到的分子标记。

所述的分子标记序列优选如seqidno：1所示，所述的国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点在seqidno：1中位于第166位，存在c/t多态性。

一种用于检测与苏淮猪肌肉滴水损失性状相关的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno：2，下游引物为：seqidno：3；所述的与苏淮猪肌肉滴水损失性状相关的snp标记位于猪6号染色体上的mamstr基因的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点的分子标记，且具有c/t多态性，所述snp标记与苏淮猪肌肉滴水损失极显著相关。

一种检测所述的与苏淮猪肌肉滴水损失性状相关的snp标记的方法，包含pcr扩增苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的c/t多态性。

检测所述的与苏淮猪肌肉滴水损失性状相关的snp标记的方法优选包括以下步骤：

(1)取苏淮猪耳组织样品提取总dna；

(2)用已提取的苏淮猪基因组dna为模板，使用本发明所述的引物对进行pcr扩增；

(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第166位的c/t多态性。

本发明所述的分子标记、所述的引物对在筛选低滴水损失苏淮猪群体中的应用。

一种筛选低滴水损失苏淮猪群体的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组11.1版本参考序列猪6号染色体rs337473375核苷酸位点的基因型，选育rs337473375核苷酸位点的cc型个体优先作为种猪。

有益效果：

本发明提供的snp标记与苏淮猪肌肉滴水损失相关，基于该snp开发的分子标记及引物可用于snp的检测。因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选低滴水损失苏淮猪品系，所得的低滴水损失苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为mamstr基因rs337473375位点扩增胶图。

图2为mamstr基因rs337473375位点分型图示例。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：

1试验动物来源

江苏省淮安市淮阴种猪场

2提取苏淮猪基因组dna

采集301头苏淮猪耳组织样4份/头，其中1份用于个体dna提取；

参考天根生物科技公司组织dna提取试剂盒说明书，提取按以下步骤顺序进行：

①先在缓冲液gd和漂洗液pw中分别加入68ml和200ml无水乙醇，充分混匀。

②采集组织样约100mg置于2mlep管内，完全剪碎后加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮。

③加入20μl蛋白酶k溶液，混匀后放在56℃金属浴中消化过夜，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，放在70℃金属浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。

⑦向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中

⑧向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，以12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。

⑨重复操作步骤⑧。

⑩将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min，12,000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。

经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。

3、目的片段pcr扩增与测序

用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板1μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各1μl、pcrmix试剂22μl；设置pcr扩增体系：

pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小约301bp，电泳图见图1，将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读rs337473375位点的基因型。

4、统计分析

利用sas软件一般线性模型进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为yijnbkl＝ui+gj+sn+bb+dl+eijkl

其中：yijnkl为猪的滴水损失；ui代表平均值，gj代表第j个snp的基因型固定效应；sn代表性别的固定效应；bb代表批次的固定效应；dl是日龄协变量；eijkl为残差。

5、结果

表1给出了rs337473375突变位点c/t在苏淮猪群体中对滴水损失的影响效应。由表1可知，rs337473375位点三种基因型之间滴水损失有极显著差异(p<0.01)，其中tt型个体滴水损失极显著高于ct型和cc型(p<0.01)，cc型个体滴水损失高于ct型个体，但是差异不显著。由此可见，在苏淮猪群体中，继代选育rs337473375位点的cc型个体，可逐步降低苏淮猪群体的滴水损失，从而达到提高苏淮猪肉质性能的目的。

表1mamstr基因rs337473375位点与苏淮猪肌肉滴水损失的关联分析

注：a、b同行比较，上标无相同字母表示差异极显著(p<0.01)。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种与苏淮猪肌肉滴水损失相关的snp标记及检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>301

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>gene

<222>(166)..(166)

<223>n=c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(166)..(166)

<223>nisa,c,g,toru

<400>1

aggagattcagaattcgggtccctcactttcccgcatcttcctgagcccctgtctttgag60

gactctagaaggccttttctttctgctccttctaacttgtctttccccctcccaactatc120

gtcaggatgaagcccactcccttcacttcctccccaccaggagtcnccggtccctcgccc180

ccttcacacaagttggaacttcagaccctcaaactggaggagctgacggtgagtttgggg240

agtaacctcccaggctggccctttccctcagtgcggacccagaaatctaaccctgcaacc300

c301

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aggagattcagaattcgggt20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gggttgcagggttagattt19