一种用于细胞形变和活性动态检测的细胞形变培养板的制作方法

本实用新型涉及生物学用具领域，尤其涉及一种用于细胞形变和活性动态检测的细胞形变培养板。

背景技术：

细胞形变和活性，是判断体外培养细胞在例如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等一些条件下是否能正常生长的重要指标。细胞活性的检测是进行相关科学研究的常用手段，更是体外筛选抗肿瘤药物和临床肿瘤药敏试验的重要方法之一。常用的细胞活性检测方法有很多，如有染色法，克隆(集落)形成法、比色法、放射性同位素掺入法等。

目前用于上述细胞活性检测中较为常用的细胞培养板为玻璃平板或塑料平板等硬质平板，并在硬质平板上设置有细胞培养孔。由于普通的细胞培养孔由硬质材料制成，不具备弹性和形变能力，只是作为细胞和菌种等培养时的容器，待进行药敏试验、细胞活性检测、细胞形变观察等实验时，需另外移至观测仪观测，同个细胞只能单次利用，利用完后废弃，无法在细胞培养板中进行动态持续观察；此外，操作过程繁琐，需要的样品量较大，造成实验成本较高。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术中存在的不足，本实用新型提供一种用于细胞形变和活性动态检测的细胞形变培养板，能够为持续、动态、直观地监测细胞在不同时间段内的形变及活性特性提供基础。

本实用新型解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于细胞形变和活性动态检测的细胞形变培养板，包括基板，所述的基板的上表面涂布有一层厚度均匀且厚度为5～10μm的弹性复合材料层，所述的弹性复合材料层上开设有若干个均匀排列的细胞形变培养孔。

在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的深度小于等于所述的弹性复合材料层的厚度。

在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的形状选自以下至少一种：圆型、米字型和X型。

在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的形状为X型或米字型，所述的细胞形变培养孔包括用于容置细胞的中心部和连通所述的中心部并向外延伸的多个形变端部。由此，能够更明显地展示形变情况，进一步有利于观察。

在一些实施方式中，所述的细胞形变培养孔的各个形变端部的长度为10～100μm，宽度为10～100μm。由此，能够较好的符合细胞在形变培养孔中的生长发展需要，形成更加稳定、直观、便于观测的细胞形变。

在一些实施方式中，所述的弹性复合材料层为聚二甲基硅氧烷层或水凝胶层。由此，具有较优的效果。

在一些实施方式中，所述的基板为玻璃基板、二氧化硅基板或塑料基板。

与现有技术相比，本实用新型的优点在于：在基板的上表面涂布一层厚度均匀且厚度为5～10μm的弹性复合材料层，并在弹性复合材料层中设置若干个均匀排列的细胞形变培养孔，使培养的细胞能够在细胞形变培养孔中产生持续形变，作多次观察，能够用于对同一细胞形变和细胞活性的动态检测，且操作更简便，观察更直观，无需消耗大量样品，降低实验成本；优选的细胞形变培养孔的形状为X型或米字型，能够更明显地展示形变情况，进一步有利于观察。

附图说明

图1为本实用新型一实施方式的细胞形变培养板的结构示意图；

图2为培养的细胞在细胞形变培养孔中的状态示意图；

图3为实施例二中实验组细胞在第1天和第3天的显微镜观测图；

图4为实施例三中第1组细胞在加药前和加药后的显微镜观测图。

其中，细胞形变培养板1，基板11，弹性复合材料层12，细胞形变培养孔13，中心部14，形变端部15。

具体实施方式

以下结合附图对本实用新型一种细胞形变和细胞活性的动态光学检测方法作进一步详细说明，但不作为对本实用新型的限定。

实施例一

一种用于细胞形变和活性动态检测的细胞形变培养板1，包括基板11，基板11的上表面涂布有一层厚度均匀且厚度为5～10μm的弹性复合材料层12，弹性复合材料层12上开设有若干个均匀排列的细胞形变培养孔13。

本实施例中，细胞形变培养孔13的深度小于等于弹性复合材料层12的厚度。

本实施例中，细胞形变培养孔13的形状为X型或米字型，在其他实施例中，细胞形变培养孔13的形状还可以选自：圆型或十字型等。细胞形变培养孔13包括用于容置细胞的中心部14和连通中心部并向外延伸的多个形变端部15。由此，能够更明显地展示形变情况，进一步有利于观察。

本实施例中，细胞形变培养孔13的各个形变端部15的长度为10～100μm，宽度为10～100μm。由此，能够较好的符合细胞在形变培养孔中的生长发展需要，形成更加稳定、直观、便于观测的细胞形变。

本实施例中，弹性复合材料层12为聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，在其他实施例中，弹性复合材料层12的材质可以选用水凝胶(hydrogel)等材料。由此，具有较优的效果。

本实施例中，基板11为玻璃基板，在其他实施例中，基板11可以为二氧化硅基板或塑料基板。

实施例二

为了便于展示细胞在细胞形变培养板内培养过程中形态的变化，我们以转染表达绿色荧光蛋白的血管平滑肌细胞为例，取其中的单细胞于细胞形变培养板中培养，显微镜下观察随培养时间不同其细胞形态的变化。

实验方法：

(1)血管平滑肌细胞的绿色荧光蛋白基因转染：①将绿色荧光蛋白基因克隆重组到真核表达载体上，将血管平滑肌细胞经培养到覆盖培养皿60—80％；②在真核表达重组载体中加入脂质体，室温孵育15Min，同时更换新鲜的血管平滑肌细胞培养基；③将重组表达载体和脂质体混合物加入细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀，37℃孵育6小时；④孵育后更换转染培养基，加入新鲜的生长培养基，37℃培养24小时后加入抗生素进行筛选培养。

(2)筛选的转染细胞进行扩大培养到细胞覆盖培养皿60—80％，然后弃去全部培养基，加入1ml胰酶37℃消化2min后吸取细胞悬浮液，4000rmp离心3min弃上清。

(3)用新培养基重悬稀释细胞，取单个转染的血管平滑肌细胞放入细胞形变培养板的培养孔中继续培养，作为实验组；取另一部分转染的血管平滑肌细胞放入普通细胞培养板中继续培养，作为对照组；实验组和对照组的培养环境和培养条件相同。

(4)在培养第1天，将实验组和对照组中的转染血管平滑肌细胞分别放至光学显微镜下观察细胞的形态，记录结果；在培养第3天，将实验组的同个细胞放至光学显微镜下观察细胞的形态，由于普通培养板(对照组)中的细胞只能作单次观察，因此另取对照组中的单个转染血管平滑肌细胞放至光学显微镜下观察细胞的形态，并记录结果。

实验结果：

观测结果显示普通细胞培养板(对照组)中培养的转染血管平滑肌细胞随着培养时间增加不断增殖，逐渐铺满培养板。细胞形变培养板(实验组)中培养的转染血管平滑肌细胞同样随时间增加，其体积在培养孔中不断膨胀，从第1天集中在培养孔的中心位置到第3天不断向“X型”培养孔的形变端部延伸，如图3所示。实验结果表明无论是在实验组中还是在对照组中，转染的血管平滑肌细胞都在不断生长增殖，本实用新型的细胞形变培养板在表现细胞形变和细胞活性方面的作用与对照组一致，此外将本实用新型的细胞形变培养板用于细胞活性检测还具有操作简单快捷，能够对同一个细胞在不同培养时间段内的细胞形变过程和细胞活性实现动态监测的优点。

实施例三

在本实施例中，我们以肺癌肿瘤细胞系A549细胞作为药敏试验对象，以卡铂(CAB)作为实验用抗肿瘤药物，对照传统的MTT染色法说明本实用新型的细胞形变培养板在细胞形变和细胞活性的动态监测上的应用。

实验方法：

(1)先将卡铂用磷酸缓冲液(PBS)进行稀释制备成卡铂母液，保存备用。

(2)A549细胞复苏：将A549细胞在培养皿中培养至铺满培养皿大约80％时弃去全部培养基，加入1ml胰酶37℃消化2min后吸取细胞悬浮液，4000rmp离心3min后，弃上清。

(3)第1组(细胞形变培养板组)：用新培养基重悬稀释细胞至浓度为105个/ml，取100个单细胞分别放入细胞形变培养板的100个培养孔中，37℃继续培养，本实施例中选用100孔细胞形变培养板和X型培养孔，但不限于此；

另取一块96孔普通培养板，在其上划分3个实验区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，实验区域Ⅰ包含6个平行孔，实验区域Ⅱ包含6个平行孔，实验区域Ⅲ包含1个平行孔；

第2组(普通培养板加药组)：各取单细胞和200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅰ的6个平行培养孔中，37℃继续培养；

第3组(普通培养板对照组)：各取单细胞和200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅱ的6个平行培养孔中，37℃继续培养；

第4组(普通培养板空白组)：仅取无细胞的200μL细胞悬浮液于实验区域Ⅲ的1个平行培养孔中，37℃继续培养。

(4)用新鲜培养基将卡铂母液稀释成浓度为3×10^-5nmol/L的药液培养基；

(5)用光学显微镜观察第1组的细胞形态并记录，显示为第1组加药前的结果，然后将培养孔中的培养基完全弃去，全部换成含卡铂浓度为3×10^-5nmol/L的药液培养基继续培养；

同时用光学显微镜观察第2组、第3组、第4组，待细胞铺满各培养孔后将第2组、第3组、第4组中的培养基完全弃去，然后在第2组与第4组各培养孔中加入200μL含卡铂浓度为3×10^-5nmol/L的药液培养基，在第3组各培养孔中加入200μL不含卡铂的新鲜培养基，继续培养。

(6)培养24小时后，在光学显微镜下观察第1组细胞形变培养板内细胞的形态并记录；

同时分别向第2组、第3组、第4组的各孔中加入20μL浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续培养4小时，吸取培养基，加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，放入自动酶联免疫仪中，以第4组作为空白对照，分别测定第2组和第3组各孔的吸光值(OD值)，然后分别计算第2组和第3组的平均OD值。

实验结果：

经测得96孔普通培养板上第3组6个孔的平均OD值为0.618，第2组6个孔的平均OD值为0.237，由此可见由于药物的作用，第2组加药后的细胞有一部分发生了凋亡。通过对细胞形变培养板内细胞形态的观察，如图4所示，细胞同样由加药前充满整个培养孔到不断萎缩，反映出细胞不断凋亡的过程，与96孔普通培养板中经MTT染色的细胞表现一致。但本实用新型的细胞形变培养板用于细胞活性检测，其操作更简便，检测更直观，培养的细胞能够在细胞形变培养孔中产生持续形变，无需多次取样，能够对同一个细胞的细胞形变和细胞活性实现动态的、持续的观测。

值得注意的是，以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并非因此限定本实用新型的专利保护范围，本实用新型还可以对上述各种零部件的构造进行材料和结构的改进，或者是采用技术等同物进行替换。故凡运用本实用新型的说明书及图示内容所作的等效结构变化，或直接或间接运用于其他相关技术领域均同理皆包含于本实用新型所涵盖的范围内。