一种记忆T细胞体外扩增试剂盒的制作方法

本实用新型涉及一种记忆T细胞体外扩增试剂盒，属于试剂盒技术领域。

背景技术：

淋巴细胞从功能性观点考虑，可分为初始淋巴细胞(lymphocyte)和记忆淋巴细胞(memory lymphocyte)。初始淋巴细胞是尚未受到抗原刺激的、细胞表面表达有CD45RA抗原的淋巴细胞，已知其于在局部淋巴结等处与抗原相遇并受到刺激的过程中被活化。记忆淋巴细胞是已经受到抗原刺激(无论是特异性刺激还是非特异性刺激)而表达有CD45RO抗原的淋巴细胞。T淋巴细胞和B淋巴细胞还可以根据各自的状态分为初始T细胞和记忆T细胞、初始B细胞和记忆B 细胞。记忆T细胞可以进一步分为效应型记忆(effector memory；EM)T细胞和中央型记忆(central memory；CM)T细胞。中央型记忆T细胞具有归巢至淋巴结、迎击侵入体内的异物和抗原的功能，效应型记忆T细胞具有处于本应所在的部位、捕捉异物和抗原的作用。研究发现：记忆T细胞在体内的增殖能力和抗肿瘤活性，均优于效应型记忆T细胞和效应性T细胞，此外，记忆T细胞对维持机体免疫内环境的稳态及重建具有重大意义。记忆T细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应，同时具有自我更新能力，能够提供更为长期的免疫保护，可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞。有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。因此，预期含有记忆T细胞群作为主要成分的制剂能够在过继性免疫疗法中取得高的治疗效果。但是，现状是没有在不给淋巴细胞提供者强加很大的负担的情况下大量简便地采集为供给于临床而所需的记忆T细胞的方法。且现使用的一些试剂盒各试剂需单独准备，取用时存在一定的污染风险。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是，提供一种制备容量大，封闭性强，受污染几率小以及操作简单的记忆T细胞体外扩增试剂盒。

为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案为：

一种记忆T细胞体外扩增试剂盒，包括盒体与可开合的盒盖，所述盒体内设有若干用于放置细胞培养袋的第一凹槽、用于放置细胞激活添加试剂瓶D的第二凹槽、用于放置第一细胞因子试剂瓶E的第三凹槽、用于放置第二细胞因子试剂瓶F的第四凹槽、用于放置若干密封夹的第五凹槽以及用于放置若干注射器的第六凹槽，所述细胞培养袋包括内装有第一细胞培养液A的主体袋以及与所述主体袋连通的出液口、内装有第二细胞培养液B的第一附加袋、内装有细胞培养添加剂C的第二附加袋和取样口，所述出液口、所述第一附加袋以及所述第二附加袋与所述主体袋连通管道上设有控制开关，所述取样口外设有管套。

所述主体袋容量为100-500mL，所述第一附加袋容量为10-50mL，所述第二附加袋容量为1-50mL，所述细胞激活添加试剂瓶D容量为2-5mL，所述第一细胞因子试剂瓶E的容量为0.5-2mL，所述第二细胞因子试剂瓶F的容量为 0.5-2mL。

所述注射器的规格为1mL、10mL、100mL，数量为各2-5个。

所述细胞培养袋整体外部带有无菌塑封膜。

所述第一细胞培养液A为RPMI1640、AIM-V、X-VIVO15或GT-T551液体培养基。

所述第二细胞培养液B为人血清白蛋白。

所述细胞培养添加剂C为含200mM L-谷氨酰胺、200mM丙酮酸钠、 200mM非必须氨基酸、100mM Hepes、10KU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素浓度为0.85％的生理盐水。

所述细胞激活添加剂D为包被有单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28的纳米微粒，浓度为2*10⁸个纳米微粒/mL的DPBS溶液。

所述第一细胞因子试剂E为含5-10μg/mL的IFN-γ、10-20μg/mL的重组人 IL-2、10000-20000U/mL的重组人IL-1α无菌蒸馏水溶液。

所述第二细胞因子试剂F为含5-20μg/mL的重组人IL-2、10-30μg/mL重组人IL-7和10-30μg/mL重组人IL-15的无菌蒸馏水溶液。

本实用新型所达到的有益效果：本装置中采用细胞培养袋作为细胞培养容器，培养袋气体交换面积大，可获得更多数量的细胞，以制得大量活化的记忆 T细胞，用于临床前研究或入库保存，并且封闭性强、通过附加袋还减少了较多外部加液的环节，可以显著降低细胞污染和操作人员感染几率。

附图说明

图1是实施例外部结构示意图；

图2是实施例俯视结构示意图；

图3是实施例中细胞培养袋结构示意图；

图4是实施例中试剂瓶结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本实用新型的技术方案，而不能以此来限制本实用新型的保护范围。

一种记忆T细胞体外扩增试剂盒，如图1所示，包括盒体2与可开合的盒盖1，如图2所示，盒体2内的海绵衬垫上设有2个用于放置细胞培养袋的第一凹槽3，4、用于放置细胞激活添加试剂瓶D的第二凹槽5、用于放置第一细胞因子试剂瓶E的第三凹槽6、用于放置第二细胞因子试剂瓶F的第四凹槽7、用于放置若干平口密封夹的第五凹槽8、用于放置若干注射器的第六凹槽9 以及使用说明书，平口密封夹放置1-2只，注射器有三种规格，1mL、10mL、 100mL，数量为各2-5个，如图3所示，细胞培养袋包括内装有第一细胞培养液A的主体袋11以及与主体袋11连通的出液口10、内装有第二细胞培养液B 的第一附加袋12、内装有细胞培养添加剂C的第二附加袋13和取样口14，出液口10、第一附加袋12以及第二附加袋13与主体袋11连通管道上设有控制开关，通过开关上的旋钮进行操作，用于管道两侧的连通与关闭，取样口14 外设有无菌硅胶管套，用于取样口14的通止，具体规格如下，细胞培养袋主体袋11容量为200mL，内装有AIM-V液体培养基，第一附加袋12容量为 10mL，内装有人血清白蛋白，第二附加袋13容量为2mL，内装有含200mM L-谷氨酰胺、200mM丙酮酸钠、200mM非必须氨基酸、100mM Hepes、10KU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素浓度为0.85％的生理盐水，细胞培养袋采用乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)材料制成，外部还带有无菌塑封膜，可以降低细胞培养袋受感染几率，如图4所示，细胞激活添加试剂瓶D容量为 4mL，内装有包被有单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28的纳米微粒，浓度为2*10⁸个纳米微粒/mL的DPBS溶液，第一细胞因子试剂瓶E的容量为 1mL，内装有含5μg/mL的IFN-γ、20μg/mL的重组人IL-2、10000U/ml的重组人IL-1α无菌蒸馏水溶液，第二细胞因子试剂瓶F的容量为1mL，内装有含 20μg/mL的重组人IL-2、25μg/mL重组人IL-7和25μg/mL重组人IL-15的无菌蒸馏水溶液。

本试剂盒使用方法如下：

一、细胞培养液G的配制，用平口密封夹在细胞培养袋主体袋11中间夹紧，将连接附加袋一侧袋的第一细胞培养液A和第二细胞培养液B进行混合，再加入细胞培养添加剂C。添加方法为松开附加袋12,13与主体袋11连接管道处的旋钮，多次挤压附加袋。

二、PBMC的分离，供者签署知情同意书后，采集外周血50mL，利用 Ficoll-Paque梯度离心法进行PBMC的分离，分离出单个核细胞层。

三、吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入DPBS，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分离柱中去除非T细胞，再次离心洗涤；离心和洗涤操作依次交替进行两次，第一次1200rpm离心 6min，第二次1500rpm离心10min，依次进行四次离心和洗涤的操作。

四、用注射器从取样口14吸取少量细胞培养液G重悬步骤三离心后的细胞，加入1.00％第一细胞因子添加剂E，细胞激活添加剂D。

五、用注射器将上述混合液加入细胞培养袋中，混合均匀后将细胞培养袋置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

六、第三天取下平口密封夹，使细胞培养液G在细胞培养袋中充分混匀，用1ml注射器加入1.00％第一细胞因子添加剂E。

七、当细胞密度达到2*10⁶时，用100ml注射器抽取一半的细胞悬液与另一细胞培养袋中的细胞培养液交换混合培养；

用1ml注射器补加1.00％第二细胞因子添加剂F。

八、培养十四天后，从出液口10收集T细胞，将T细胞离心后，生理盐水洗涤三次，即得到活化的记忆T细胞。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本实用新型的保护范围。