一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片的制作方法

本实用新型涉及分子生物医学技术领域，具体是一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片。

背景技术：

细菌感染是世界范围内最常见的疾病之一，易导致多种疾病的产生，主要的临床表现为：骤发寒战，高热，心动过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神，神志改变等一系列严重临床症状，其危害性大、易导致死亡。因此快速测定人类全血中的细菌类型对了解全血中细菌的多样性，指导抗生素的选择和使用，杀死具毒害性的细菌等，具有极大的学术研究和临床应用价值。为获取高质量的不同细菌总核酸，前期样品的处理、提取方法及试剂盒的选择尤为重要。此外，必须要指出的是，对于不同的细菌，同一种方法所呈现出的结果往往差异很大。目前发表的提取细菌总核酸的方法有很多，但多数方法不仅要使用一些有毒的试剂，而且方法费时、复杂、花费较高，且提取效果不佳。另外许多细菌是很难被破坏裂解的，因为它们有细胞壁保护，例如，革兰氏阴性菌，细胞壁成分相对较单一，结构较脆弱，易破碎；而对于革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，化学结构保守固定，三维细胞壁结构交联紧密，细胞难破碎，提取难度大。而且现有方法无法检测到含量极低的细菌数，致使病原菌的检测有漏检的可能性。因此为解决以上问题，亟待研发一种高效且广泛适用的细菌总核酸提取的方法。

技术实现要素：

本实用新型目的在于克服现有技术的不足，适应现实发展，在可操作性、耗时短、敏感性高、安全无污染、节省时间等方面解决上述问题，提供一种用于提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片，同时集PCR反应和检测为一体。

本实用新型所述的一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片，包括定位孔和主体，所述主体包括位于加样腔体上的加样孔、加样腔体、第一单向阀、第二单向阀、第三单向阀、第四单向阀、第五单向阀、第六单向阀、第七单向阀、第八单向阀、第九单向阀、第十单向阀、第十一单向阀、核酸提取材料、核酸提取腔体、PCR反应腔体、缓冲液I腔体、缓冲液II腔体、RNA酶抑制剂腔体、MIX1腔体、DNaseI腔体、MIX2腔体、70％乙醇腔体、缓冲液III腔体、MIX3 腔体、PCR Master Mix腔体、PCR引物腔体、PCR反应探针腔体和缓冲液V腔体；

所述核酸提取材料位于所述核酸提取腔体内；

所述核酸提取腔体的上下带有两种不同的滤芯，滤芯将其内部分隔为上核酸提取腔体、中带滤芯的核酸提取腔体和下带滤芯的核酸提取腔体；

所述加样腔体通过进样流道与所述核酸提取腔体连通；

所述缓冲液I腔体、缓冲液II腔体、RNA酶抑制剂腔体分别通过第一分流道、第二分流道、第三分流道与第一流道连通，所述第一流道一端与所述第一分流道连通，另一端与所述核酸提取腔体连通；

所述MIX1腔体、DNaseI腔体、MIX2腔体分别通过第四分流道、第五分流道、第六分流道与第二流道连通，所述第二流道一端与所述第四分流道连通，另一端与所述核酸提取腔体连通；

所述70％乙醇腔体、缓冲液III腔体、MIX3腔体、缓冲液V腔体分别通过第七分流道、第八分流道、第九分流道、第十分流道与第三流道连通，所述第三流道一端与所述第七分流道连通，另一端与所述核酸提取腔体连通；

所述PCR反应腔体通过出样流道与所述核酸提取腔体连通；

所述PCR Master Mix腔体、引物腔体、探针腔体分别通过第十一分流道、第十二分流道、第十三分流道与所述PCR反应腔体连通；

所述第一分流道、第二分流道、第三分流道、第四分流道、第五分流道、第六分流道、第七分流道、第八分流道、第九分流道、第十分流道上分别对应的设有第一单向阀、第二单向阀、第三单向阀、第四单向阀、第五单向阀、第六单向阀、第七单向阀、第八单向阀、第十一单向阀；

所述出样流道上设有一个外接2ml废液管的单向阀；

所述缓冲液I腔体内含有缓冲液I，所述缓冲液II腔体内含有缓冲液II，所述RNA酶抑制剂腔体内含有RNA酶抑制剂，所述MIX1腔体内含有MIX1溶液，所述DNaseI腔体内含有DNaseI溶液，所述MIX2腔体内含有混合均匀的 MIX2溶液，所述70％乙醇腔体内含有混合均匀的70％乙醇溶液，所述缓冲液III 腔体内含有缓冲液III，所述MIX3腔体内含有混合均匀的MIX3溶液，所述缓冲液V腔体内含有缓冲液V，所述PCR Master Mix腔体内含有混合均匀的PCR Master Mix溶液，所述引物腔体内含有PCR扩增引物，所述探针腔体内含有TaqMan探针。

进一步，所述主体呈扇形，由PC材料制作而成，半径为40mm，厚度为2mm。

与现有技术相比，本实用新型的优点和积极效果：

①可快速裂解该细菌，释放RNA，操作简单快捷，大大提高了提取效率；且低至10copies的细菌数也可被检测到，将检测限降到最低，避免漏检的可能性；简化病原菌检测的操作过程，降低人为操作引入的检测误差；

②耗时短，通量高，可快速、高效地完成临床上常见病原菌的检测，及时获知结果辅助进一步诊断与治疗；

③敏感性高，低至10copies的细菌也可以被检测到，将检测限降到最低，避免漏检的可能性；

④检测过程为闭管反应，逆转录与PCR扩增反应相结合，减少实验步骤，也大大降低了污染及结果偏差的可能性；

⑤安全无污染，整个体系中不含有毒有害物质，对环境与操作人员都好。

附图说明

图1本实用新型所述微流控芯片的总体结构示意图。

图1附图标记的含义：1-定位孔，2-主体，3-加样腔体，4-加样孔，5-第一单向阀，6-第二单向阀，7-第三单向阀，8-第四单向阀，9-第五单向阀，10-第六单向阀，11-第七单向阀，12-第八单向阀，13-第九单向阀，14-核酸提取材料， 15-核酸提取腔体，16-第十单向阀，17-PCR反应腔体，18-缓冲液I腔体，19-缓冲液II腔体，20-RNA酶抑制剂腔体，21-MIX1腔体，22-DNaseI腔体，23-MIX2 腔体，24-70％乙醇腔体，25-缓冲液III腔体，26-MIX3腔体，27-PCR Master Mix 腔体，28-PCR引物腔体，29-PCR反应探针腔体，30-缓冲液V腔体，31-第十一单向阀，32-进样流道，33-第一分流道，34-第二分流道，35-第三分流道，36-第一流道，37-第四分流道，38-第五分流道，39-第六分流道，40-第二流道，41-第七分流道，42-第八分流道，43-第九分流道，44-第十分流道，45-第三流道，46- 出样流道。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的具体实施例做详细说明。

一种提取人类全血中细菌总核酸的微流控芯片，如图1所示，包括定位孔1 和主体2，所述主体2包括位于加样腔体3上的加样孔4、加样腔体3、第一单向阀5、第二单向阀6、第三单向阀7、第四单向阀8、第五单向阀9、第六单向阀10、第七单向阀11、第八单向阀12、第九单向阀13、第十单向阀16、第十一单向阀31、核酸提取材料14、核酸提取腔体15、PCR反应腔体17、缓冲液I 腔体18、缓冲液II腔体19、RNA酶抑制剂腔体20、MIX1腔体21、DNaseI腔体22、MIX2腔体23、70％乙醇腔体24、缓冲液III腔体25、MIX3腔体26、PCR Master Mix腔体27、PCR引物腔体28、PCR反应探针腔体29和缓冲液V腔体 30；

所述核酸提取材料14位于所述核酸提取腔体15内；

所述核酸提取腔体15的上下带有两种不同的滤芯，滤芯将其内部分隔为上核酸提取腔体、中带滤芯的核酸提取腔体和下带滤芯的核酸提取腔体；

所述加样腔体3通过进样流道32与所述核酸提取腔体15连通；

所述缓冲液I腔体18、缓冲液II腔体19、RNA酶抑制剂腔体20分别通过第一分流道33、第二分流道34、第三分流道35与第一流道36连通，所述第一流道36一端与所述第一分流道33连通，另一端与所述核酸提取腔体15连通；

所述MIX1腔体21、DNaseI腔体22、MIX2腔体23分别通过第四分流道 37、第五分流道38、第六分流道39与第二流道40连通，所述第二流道40一端与所述第四分流道37连通，另一端与所述核酸提取腔体15连通；

所述70％乙醇腔体24、缓冲液III腔体25、MIX3腔体26、缓冲液V腔体 30分别通过第七分流道41、第八分流道42、第九分流道43、第十分流道44与第三流道45连通，所述第三流道45一端与所述第七分流道41连通，另一端与所述核酸提取腔体15连通；

所述PCR反应腔体17通过出样流道46与所述核酸提取腔体15连通；

所述PCR Master Mix腔体27、引物腔体28、探针腔体29分别通过第十一分流道47、第十二分流道48、第十三分流道49与所述PCR反应腔体17连通；

所述第一分流道33、第二分流道34、第三分流道35、第四分流道37、第五分流道38、第六分流道39、第七分流道41、第八分流道42、第九分流道43、第十分流道44上分别对应的设有第一单向阀5、第二单向阀6、第三单向阀7、第四单向阀8、第五单向阀9、第六单向阀10、第七单向阀11、第八单向阀12、第十一单向阀31；

所述出样流道46上设有一个外接2ml废液管的单向阀16；

所述缓冲液I腔体18内含有缓冲液I，所述缓冲液II腔体19内含有缓冲液II，所述RNA酶抑制剂腔体20内含有RNA酶抑制剂，所述MIX1腔体21内含有MIX1溶液，所述DNaseI腔体22内含有DNaseI溶液，所述MIX2腔体23 内含有混合均匀的MIX2溶液，所述70％乙醇腔体24内含有混合均匀的70％乙醇溶液，所述缓冲液III腔体25内含有缓冲液III，所述MIX3腔体26内含有混合均匀的MIX3溶液，所述缓冲液V腔体30内含有缓冲液V，所述PCR Master Mix腔体27内含有混合均匀的PCR Master Mix溶液，所述引物腔体28内含有 PCR扩增引物，所述探针腔体29内含有TaqMan探针。

所述主体2呈扇形，由PC材料制作而成，半径为40mm，厚度为2mm。

一种提取人类全血中细菌总核酸的试剂盒，包括上述的微流控芯片。

上述微流控芯片应用于提取人类全血中细菌总核酸的方法，包括如下步骤：

步骤S1，从所述加样孔4向所述加样腔体3中加入人类全血样本和细菌的混合物；

步骤S2，开启所述第一单向阀5，以2000rpm的速率顺时针旋转离心3min，样品与缓冲液I在所述上核酸提取腔体15内混匀，低温冰上浴12min，充分裂解红细胞；

步骤S3，以12000rpm的速率在4℃时顺时针旋转离心5min，经所述第十单向阀16上外接的2ml废液管弃上清，开启所述第二单向阀6、第三单向阀7，样品与缓冲液II、缓冲液III在所述上核酸提取腔体15内混匀，室温孵育5min，以12000rpm的速率顺时针旋转离心5min，经所述第十单向阀16上外接的2ml 废液管弃上清；

步骤S4，开启所述第四单向阀8，样品与MIX1溶液在所述上核酸提取腔体 15内混匀，37℃室温孵育30min；

步骤S5，开启所述第五单向阀9，样品与DNaseI溶液在所述上核酸提取腔体15内混匀，涡旋10s，室温孵育5min；

步骤S6，开启所述第六单向阀10，样品与MIX2溶液在所述上核酸提取腔体15内混匀，涡旋直至沉淀溶解，室温静置2min；

步骤S7，瞬离转移样品至所述中带滤芯的核酸提取腔体15，全速离心2min，保存滤液；

步骤S8，开启所述第七单向阀11，样品与70％乙醇溶液在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内混匀，10000rpm，离心20s，直至样品全部通过；

步骤S9，开启所述第八单向阀12，样品与缓冲液III在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内混匀，10000rpm，离心20s，经所述单向阀16上外接的2ml废液管弃滤液；

步骤S10，开启所述第九单向阀13，样品与MIX3溶液在所述下带滤芯的核酸提取腔体15中心，室温孵育15min；

步骤S11，开启所述第十一单向阀31，样品与缓冲液V在所述下带滤芯的核酸提取腔体15内轻轻涡旋混匀，10000rpm，离心20s；

步骤S12，经多次洗脱离心后得最终样品以2500rpm高速逆时针旋转离心1 分钟，以强大的离心力使洗脱的核酸溶液进入PCR反应腔体17，并与PCR Master Mix、引物、探针结合。

步骤S13，将所述微流控芯片放入平板加热装置中进行PCR扩增；

步骤S14，PCR扩增完成后，将所述微流控芯片放在CCD光源下进行荧光检测；

所述PCR反应腔体17内的PCR扩增反应条件如下：50℃逆转录15～30min； 92～97℃预变性1～10min；93～96℃变性10～15s；55～63℃退火35～55s；38～45个循环。

上述实施例仅是本实用新型的较优实施方式，凡是依据本实用新型的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本实用新型技术方案的范围内。