一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置的制作方法

本实用新型涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置。

背景技术：

近年来免疫细胞治疗技术等在内的多种细胞技术的研究取得了飞速的发展。2017年下半年，美国FDA先后批准两款CAR-T疗法上市，标志着人类在细胞治疗领域取得了重大突破。当前，我国细胞免疫治疗的发展也进入了快车道。2017年12月22日，国家食品药品监督管理总局制定了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》并发布试行，迫切需要把握免疫细胞治疗技术的发展机遇，在标准化T细胞培养装置领域占据制高点，推进我国生物医药产业创新驱动发展进程。

但细胞免疫治疗与传统药物的开发模式是不同的，细胞免疫治疗是个性化的治疗，细胞药物是一种活的成分，因此实现CAR-T回输细胞产品的标准化，做到细胞药效和风险可控，也就是实现T细胞生产的质量稳定是一个关键技术难题。

现有基因改造T细胞的生产包括以下步骤：

S1、单核细胞的获得，对全血进行处理获取单核细胞；

S2、单核细胞——T细胞筛选分离，通过相关技术从单核细胞内分离的到T细胞；

S3、T细胞的激活，通过相关因子激活T细胞，激活后的T细胞能够实现扩增培养；

S4、T细胞的转导，激活并培养后的T细胞在包装能够表达CAR（嵌合抗原受体）的相关载体的慢病毒或腺病毒存在下可把表达CAR的相关病毒载体转导至T细胞内并进行表达；

S5、T细胞培养，对转导后的T细胞进行培养；

S6、T细胞纯化，去除培养基内慢病毒或腺病毒，达到病毒残留指标；

S7、检测，对转导后的T细胞进行采样、检测；

S8、收集；待细胞数达到需求，并经过检测后可对富集的可表达CAR的T细胞进行收获。

现有T细胞的生产的各步骤均是通过人工或半自动操作实现的，各个步骤间的转换是个半开放的过程，费时费力，并且容易引入污染，不符合GMP的生产规范要求，也难以实现T细胞生产的质量稳定。而细胞免疫治疗的临床实施发展方向必定将是治疗流程标准化、细胞技术平台产品的规模化、细胞培养扩增的标准化与自动化生产操作。所以为了实现对细胞免疫治疗技术的应用和细胞免疫治疗的临床转化，我们提出设计一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置。

技术实现要素：

针对上述问题，本实用新型提供了一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置，其能实现T细胞生产质量稳定。

其技术方案是这样的，一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置，其特征在于，其包括：

细胞培养反应器，包括用于细胞培养的罐体和对罐体内的液体进行混合的混合机构；

细胞培养箱，用于容置所述细胞培养反应器并提供所需的细胞培养温度和气体浓度；

试剂储存机构，包括单核细胞储存单元、培养基储存单元、磁珠A储存单元、溶液A储存单元、磁珠B储存单元、溶液B储存单元、病毒储存单元、IL-2储存单元、T细胞保存溶液储存单元，磁珠A为抗CD3抗体标记磁珠、用于与CD3⁺T细胞免疫结合，溶液A用于将T细胞从磁珠A上分离，病毒为包装能够表达CAR的载体的慢病毒，磁珠B为抗CD3/CD28抗体标记磁珠、用于T细胞的激活，溶液B用于将磁珠A、磁珠B从去磁的电磁分离柱上冲洗去除，T细胞保存溶液用于保持T细胞活性；

试剂收集机构，包括细胞采样收集单元、细胞成品收集单元和废液收集单元；

细胞分离机构，包括电磁分离柱，磁珠A和磁珠B能够吸附于所述电磁分离柱上并能在电磁分离柱去磁性情况下从分离柱上脱落；

管道和输送机构，包括用于将单核细胞储存单元、培养基储存单元、磁珠A储存单元、磁珠B储存单元、病毒储存单元、IL-2储存单元、T细胞保存溶液储存单元中的试剂分别输送至罐体内的第一管道和输送机构，

用于将罐体内的包含细胞的液体输送经过电磁分离柱后由废液收集单元收集的第二管道和输送机构，

用于将溶液A储存单元内的试剂输送经过电磁分离柱后回流至罐体内的第三管道和输送机构，

用于将罐体内的未包含细胞的液体输送至废液收集单元的第四管道和输送机构，

用于将罐体内的包含细胞的液体输送经过电磁分离柱后并回流至罐体内的第五管道和输送机构，

用于将罐体内的包含细胞的液体分别输送至细胞采样收集单元、细胞成品收集单元的第六管道和输送机构；

控制器，与所述混合机构、所述细胞培养箱、所述第一管道和输送机构、所述第二管道和输送机构、第三管道和输送机构、第四管道和输送机构、第五管道和输送机构、第六管道和输送机构分别电控连接。

进一步的，所述试剂储存机构还包括IL-5储存单元、IL-7储存单元、人血清储存单元，所述IL-5储存单元、IL-7储存单元、人血清储存单元内的试剂分别通过第一管道和输送机构输送至罐体内。

进一步的，废液收集单元包括除被磁珠吸附T细胞外其他单核细胞收集单元和管道冲洗培养基收集单元。

进一步的，所述混合机构包括气囊和双向气泵，所述罐体安装有柔软的底壁，所述底壁与所述气囊贴合并能跟随所述气囊的膨胀、收缩同步膨胀、收缩。

更进一步的，所述底壁具有弹性。

更进一步的，所述气囊和双向气泵连通的管道上安装有气体流量计，所述气体流量计、所述双向气泵分别与PID控制器电控连接。

进一步的，所述细胞培养箱的侧壁上安装有视窗。

更进一步的，所述细胞培养箱内安装有灭菌机构，灭菌机构通过紫外照射进行灭菌。

进一步的，所述罐体的侧壁设有第一接管、第二接管、第三接管和第四接管，所述第二接管位于所述罐体底部，所述第三接管位于所述第二接管上方，所述第一管道和输送机构的管道输出端连接第一接管，所述第二管道和输送机构的管道输入端、所述第五管道和输送机构的管道输入端、所述第六管道和输送机构的管道输入端分别连接所述第二接管，所述第四管道和输送机构的管道输入端连接所述第三接管，所述第三管道和输送机构的管道输出端、所述第五管道和输送机构的管道输出端分别连接所述第四接管。

更进一步的，所述第一管道和输送机构包括第一蠕动泵，所述第二管道和输送机构、第三管道和输送机构、第四管道和输送机构、第五管道和输送机构、第六管道和输送机构共用第二蠕动泵，所述第一蠕动泵的输入端连接有第一蠕动泵输入管、输出端连接有第一蠕动泵输出管，所述第一蠕动泵输出管连接所述第一接管，所述第二蠕动泵的输入端连接有第二蠕动泵输入管、输出端连接有第二蠕动泵输出管；

所述第一管道和输送机构还包括第一支管，所述单核细胞储存单元、所述培养基储存单元、所述磁珠A储存单元、所述磁珠B储存单元、所述病毒储存单元、所述IL-2储存单元、所述IL-5储存单元、所述IL-7储存单元、所述人血清储存单元、所述T细胞保存溶液储存单元均安装有第一支管，各个所述第一支管上均安装有第一阀门并连接所述第一蠕动泵输入管；

所述第二管道和输送机构包括第二输入支管、第二中间支管、第二输出支管，所述第二输入支管安装有第二前端阀门并连接所述第二接管和所述第二蠕动泵输入管，所述第二中间支管连接所述第二蠕动泵输出管和所述电磁分离柱的输入端，所述第二输出支管安装有第二后端阀门并连接所述电磁分离柱的输出端和所述废液收集单元；

所述第三管道和输送机构包括第三输入支管、第三输出支管并与所述第二管道和输送机构共用所述第二中间支管，所述第三输入支管安装有第三前端阀门并连接所述溶液A储存单元和所述第二蠕动泵输入管，所述第三输出支管安装有第三后端阀门并连接所述电磁分离柱的输出端和所述第四接管；

所述第四管道和输送机构包括第四支管并与所述第二管道和输送机构共用第二中间支管、第二输出支管、第二后端阀门，所述第四支管安装有第四阀门并连接所述第三接管和所述第二蠕动泵输入管；

所述第五管道和输送机构、所述第二管道和输送机构共用所述第二输入支管、第二前端阀门、第二中间支管并和所述第三管道和输送机构共用所述第三输出支管、所述第三后端阀；

所述第六管道和输送机构包括第六支管并和所述第二管道和输送机构共用所述第二输入支管、第二前端阀门，所述细胞采样收集单元、所述细胞成品收集单元分别连接有第六支管，各个所述第六支管分别安装有第六阀门并与所述第二蠕动泵输出管连接。

使用上述装置进行T细胞培养的方法，包括以下步骤：

S1、细胞培养，第一管道和输送机构将单核细胞储存单元内的单核细胞、培养基储存单元内的培养基输送至罐体内，混合机构将单核细胞和培养基混匀，细胞培养箱提供所需的细胞培养温度和气体浓度；

S2、单核细胞——T细胞筛选分离，a、第一管道和输送机构将磁珠A储存单元中的CD4/CD8标记磁珠输送至罐体内，混合机构将抗CD3抗体标记磁珠混匀并与单核细胞免疫结合形成T细胞—抗CD3抗体磁珠复合物，b、第二管道和输送机构将T细胞—抗CD3抗体磁珠复合物和培养基一起输送至电磁分离柱，T细胞—抗CD3抗体磁珠复合物吸附于电磁分离柱上，其余单核细胞、培养基由废液收集单元收集，c、第三管道和输送机构将溶液A储存单元中的溶液A输送经过电磁分离柱，使得T细胞洗脱并与溶液A回流至罐体内，d、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，通过第四管道和输送机构将溶液A排出后由废液收集单元收集，e、第一管道和输送机构将培养基储存单元内的培养基输送至罐体内，首次加入少量培养基（约50-100ml），混合机构将T细胞和培养基混匀，停止混合，待细胞沉降后通过第四管道和输送机构将培养基排除后由培养基废液收集单元收集，该过程实现了细胞的清洗，并重复该步骤，确保剩余溶液A的去除，f、重复加入适量培养基，对T细胞进行培养；

S3、T细胞的激活，第一管道和输送机构将磁珠B储存单元内的CD3/CD28标记的磁珠、IL2储存单元内的IL2输送至罐体内，混合机构将CD3/CD28标记的磁珠、IL2和培养基混匀；

S4、T细胞的转导，第一管道和输送机构将病毒储存单元内的包装能够表达CAR（嵌合抗原受体）的载体的慢病毒输送至罐体内，混合机构将慢病毒和培养基混匀；

S5、T细胞培养，对转导后的T细胞进行培养，培养过程可通过培养箱对其温度和CO2、氧气浓度进行控制，并通过混合机构对其混合效率进行控制；

S6、病毒—抗CD3抗体标记的磁珠—T细胞筛选分离，a、第五管道和输送机构将罐体内的T细胞、CD3/CD28标记的磁珠、慢病毒和培养基一起输送至电磁分离柱，CD3/CD28标记的磁珠吸附于电磁分离柱上，而T细胞、慢病毒和培养基一起回流至罐体内；b、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，而慢病毒悬浮于培养基中，通过第四管道和输送机构将慢病毒随培养基一同排出后由废液收集单元收集；c、第一管道和输送机构将培养基储存单元内的培养基或者T细胞保存溶液储存单元内的保存溶液输送至罐体内，混合机构将T细胞和培养基混匀；d、重复该步骤b和步骤c 3~5次，使得慢病毒的残留量达到指标需求；e、通过第一管道和输送机构加入培养基对T细胞进行培养；

S7、检测，第六管道和输送机构将罐体内的T细胞输送至细胞采样收集单元，采样后对T细胞进行检测，包括细胞活力、CAR阳性细胞比例、病毒残留、磁珠残留、内毒素残留等；

S8、收集；待细胞数达到需求，并经过检测后，对T细胞进行收集，a、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，第四管道和输送机构将培养基排除后由废液收集单元收集，b、第一管道和输送机构将T细胞保存溶液储存单元内的T细胞保存溶液输送至罐体内，混合机构工作，将T细胞和T细胞保存溶液混匀，c、重复步骤a和步骤b 2~6次，d、第六管道和输送机构将罐体内的T细胞和T细胞保存溶液一起输送至细胞成品收集单元，完成细胞成品的收集。

采用本实用新型的基因改造T细胞培养装置，其能实现基因改造T细胞生产全流程，即自单核细胞培养、单核细胞——T细胞筛选分离、T细胞的激活、T细胞的转导、T细胞培养、病毒——T细胞筛选分离至检测、收集全流程的机械化操作，能够实现细胞培养扩增的标准化与自动化生产操作，控制T细胞产品质量稳定，并能促进细胞技术平台产品的规模化。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图，其中细胞培养箱示出。

图2为本实用新型的结构示意图，其中细胞培养箱未示出。

图3为本实用新型的试剂储存机构、试剂收集机构、细胞分离机构、管道和输送机构的结构示意图。

图4为本实用新型的细胞培养反应器的结构示意图。

具体实施方式

磁珠A为抗CD3抗体标记磁珠：Dynabeads® FlowComp™ Human CD3，thermo fisher；

磁珠B为抗CD3/CD28抗体标记磁珠：Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28；

T细胞保存溶液：0.9%的NaCl溶液并含有5%人血清白蛋白；

溶液A：d FlowComp™ Release buffer, thermo fisher，或含有0.1%BSA和2Mm EDTA改性生物素溶液；

溶液B：PBS 溶液，含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA，pH 7.4。

如图1~图4所示，一种细胞免疫治疗临床应用的基因改造T细胞培养装置，包括：

细胞培养反应器100，包括用于细胞培养的罐体130和对罐体130内的液体进行混合的混合机构，混合机构包括气囊120和双向气泵，罐体130安装有柔软的底壁131，底壁131与气囊120贴合并能跟随气囊120的膨胀、收缩同步膨胀、收缩，底壁131优选具有弹性，气囊120安装于基座110上部的弧形定位凹槽112，弧形定位凹槽112的设置能够实现气囊120的定向膨胀、收缩，气囊120和双向气泵连通的管道111上安装有气体流量计，气体流量计、双向气泵分别与PID控制器电控连接，气囊的混合可通过两个方面进行调节：1.频率调节，通过调节气囊呼吸频率实现混合不同（1-30次/min）；2.强度调节，通过气囊充放气量的不同实现混合效果的不同，气囊的混合相较于传统搅拌式或摇床式混匀方式，更加柔和，对T细胞造成的剪切损伤更小，能够有效提高T细胞活性；

细胞培养箱200，用于容置细胞培养反应器并提供所需的细胞培养温度和气体浓度，细胞培养箱的温控功能和供气调控功能均为现有技术，不在赘述，细胞培养箱的侧壁上安装有视窗，细胞培养箱内安装有紫外灭菌机构，通过紫外照射进行灭菌；

试剂储存机构300，包括单核细胞储存单元301、培养基储存单元304、磁珠A储存单元302、溶液A储存单元311、磁珠B储存单元303、溶液B储存单元310、病毒储存单元305、IL-2储存单元306、IL-5储存单元307、IL-7储存单元308、T细胞保存溶液储存单元309，磁珠A为抗CD3抗体标记磁珠、用于与CD3⁺T细胞免疫结合，溶液A用于将T细胞从磁珠A上分离，病毒为包装有表达CAR（嵌合抗原受体）的载体的慢病毒，磁珠B为抗CD3/CD28抗体标记磁珠、用于T细胞的激活，溶液B用于将磁珠A、磁珠B从去磁的电磁分离柱上冲洗去除，T细胞保存溶液用于保持T细胞活性；

试剂收集机构400，包括细胞采样收集单元420、细胞成品收集单元430和废液收集单元410；

细胞分离机构500，包括电磁分离柱，磁珠A和磁珠B能够吸附于电磁分离柱上并能在缓冲液的作用下洗脱；

管道和输送机构600，包括用于将单核细胞储存单元301、培养基储存单元304、磁珠A储存单元302、磁珠B储存单元303、病毒储存单元305、IL-2储存单元306、IL-5储存单元307、IL-7储存单元308、T细胞保存溶液储存单元309中的试剂分别输送至罐体内的第一管道和输送机构，

用于将罐体内的包含细胞的液体输送经过电磁分离柱后由废液收集单元410收集的第二管道和输送机构，

用于将溶液A储存单元311内的试剂输送经过电磁分离柱后回流至罐体内的第三管道和输送机构，

用于将罐体内的未包含细胞的液体输送至废液收集单元410的第四管道和输送机构（，

用于将罐体内的包含细胞的液体输送经过电磁分离柱后并回流至罐体内的第五管道和输送机构，

用于将罐体内的包含细胞的液体分别输送至细胞采样收集单元420、细胞成品收集单元430的第六管道和输送机构；

控制器，与混合机构、细胞培养箱、第一管道和输送机构、第二管道和输送机构、第三管道和输送机构、第四管道和输送机构、第五管道和输送机构、第六管道和输送机构分别电控连接。

具体的，罐体130的侧壁设有第一接管132、第二接管133、第三接管134和第四接管135，第二接管132位于罐体130底部，以将细胞连通培养基/溶液A/溶液B尽可能的全部吸出，第三接管134位于第二接管上方，避免将沉淀于底部的T细胞吸出；

第一管道和输送机构包括第一蠕动泵611，第二管道和输送机构、第三管道和输送机构、第四管道和输送机构、第五管道和输送机构、第六管道和输送机构共用第二蠕动泵621，第一蠕动泵611的输入端连接有第一蠕动泵输入管612、输出端连接有第一蠕动泵输出管613，第一蠕动泵输出管613连接第一接管132，第二蠕动泵的输入端连接有第二蠕动泵输入管622、输出端连接有第二蠕动泵输出管623；

第一管道和输送机构还包括第一支管614，单核细胞储存单元301、培养基储存单元304、磁珠A储存单元302、磁珠B储存单元303、病毒储存单元305、IL-2储存单元306、IL-5储存单元307、IL-7储存单元308、人血清储存单元、T细胞保存溶液储存单元309均安装有第一支管614，各个第一支管614上均安装有第一阀门615并连接第一蠕动泵输入管612；

第二管道和输送机构包括第二输入支管624、第二中间支管625、第二输出支管626，第二输入支管624安装有第二前端阀门627并连接第二接管133和第二蠕动泵输入管622，第二中间支管625连接第二蠕动泵输出管623和磁分离柱电磁分离柱500的输入端，第二输出支管626安装有第二后端阀门628并连接磁分离柱电磁分离柱500的输出端和废液收集单元410；

第三管道和输送机构包括第三输入支管631、第三输出支管632并与第二管道和输送机构共用第二中间支管625，第三输入支管631安装有第三前端阀门633并连接溶液A储存单元311和第二蠕动泵输入管622，第三输出支管632安装有第三后端阀门634并连接磁分离柱电磁分离柱500的输出端和第四接管135；

第四管道和输送机构包括第四支管641并与第二管道和输送机构共用第二中间支管625、第二输出支管626、第二后端阀门628，第四支管641安装有第四阀门642并连接第三接管134和第二蠕动泵输入管622；

第五管道和输送机构、第二管道和输送机构共用第二输入支管624、第二前端阀门627、第二中间支管625并和第三管道和输送机构共用第三输出支管632、第三后端阀634；

第六管道和输送机构包括第六支管661并和第二管道和输送机构共用第二输入支管624、第二前端阀门627，细胞采样收集单元410、细胞成品收集单元420分别连接有第六支管661，各个第六支管661分别安装有第六阀门662并通过第六输入总管663与第二蠕动泵输出管623连接。

其中，各阀门可选择为夹管阀，安装有夹管阀的管道或支管选择为软管；第二中间支管625、第六输入总管663也可分别安装夹管阀；控制器，具体与双向气泵的供气单元，以及第一管道和输送机构、第二管道和输送机构、第三管道和输送机构、第四管道和输送机构、第五管道和输送机构、第六管道和输送机构相应的各个阀门、第一蠕动泵和第二蠕动泵电控连接。

使用上述装置进行T细胞培养的方法，包括以下步骤：

S1、细胞培养，第一管道和输送机构将单核细胞储存单元内的单核细胞、培养基储存单元内的培养基输送至罐体内，混合机构将单核细胞和培养基混匀，细胞培养箱提供所需的细胞培养温度和气体浓度；

S2、单核细胞——T细胞筛选分离，a、第一管道和输送机构将磁珠A储存单元中的CD4/CD8标记磁珠输送至罐体内，混合机构将CD4/CD8标记磁珠混匀并与单核细胞免疫结合形成T细胞—CD4/CD8—磁珠复合物，b、第二管道和输送机构将T细胞—CD4/CD8—磁珠复合物和培养基一起输送至电磁分离柱，T细胞—CD4/CD8—磁珠复合物吸附于电磁分离柱上，其余单核细胞、培养基由废液收集单元收集，c、第三管道和输送机构将溶液A储存单元中的溶液A输送经过电磁分离柱，使得T细胞洗脱并与溶液A回流至罐体内，d、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，通过第四管道和输送机构将溶液A排出后由废液收集单元收集，e、第一管道和输送机构将培养基储存单元内的培养基输送至罐体内，，首次加入少量培养基（约50-100ml），混合机构将T细胞和培养基混匀，停止混合，待细胞沉降后通过第四管道和输送机构将培养基排除后由培养基废液收集单元收集，该过程实现了细胞的清洗，并重复该步骤，确保剩余溶液A的去除，f、重复加入适量培养基，对T细胞进行培养；

S3、T细胞的激活，第一管道和输送机构将磁珠B储存单元内的CD3/CD28标记的磁珠、IL2储存单元内的IL2输送至罐体内，混合机构将CD3/CD28标记的磁珠、IL2和培养基混匀；

S4、T细胞的转导，第一管道和输送机构将病毒储存单元内的包装能够表达CAR的载体的慢病毒输送至罐体内，混合机构将慢病毒和培养基混匀；

S5、T细胞培养，对转导后的T细胞进行培养，并通过pH控制单元对细胞培养过程pH进行控制，pH的控制可增设碱液储存单元和酸液储存单元，碱液储存单元和酸液储存单元内的碱液、酸液分别通过第一管道输送机构输送至罐体内；

S6、病毒—CD3/CD28标记的磁珠—T细胞筛选分离，a、第五管道和输送机构将罐体内的T细胞、CD3/CD28标记的磁珠、慢病毒和培养基一起输送至电磁分离柱，CD3/CD28标记的磁珠吸附于电磁分离柱上，而T细胞、慢病毒和培养基一起回流至罐体内；b、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，而慢病毒悬浮于培养基中，通过第四管道和输送机构将慢病毒随培养基一同排出后由废液收集单元收集；c、第一管道和输送机构将培养基储存单元内的培养基或者T细胞保存溶液储存单元内的保存溶液输送至罐体内，混合机构将T细胞和培养基混匀；d、重复该步骤b和步骤c3~5次，使得慢病毒的残留量达到指标需求；e、通过第一管道和输送机构加入培养基对T细胞进行培养；

S7、检测，第六管道和输送机构将罐体内的T细胞输送至细胞采样收集单元，采样后对T细胞进行检测，检测对象包括细胞活力、CAR阳性细胞比例、病毒残留、磁珠残留、内毒素残留等；

S8、收集；待细胞数达到需求，并经过检测后，对T细胞进行收集，a、混合机构非工作状态下，T细胞静置于罐体底层，第四管道和输送机构将培养基排除后由废液收集单元收集，b、第一管道和输送机构将T细胞保存溶液储存单元内的T细胞保存溶液输送至罐体内，混合机构工作，将T细胞和T细胞保存溶液混匀，c、重复步骤a、步骤c 2~6次，d、第六管道和输送机构将罐体内的T细胞和T细胞保存溶液一起输送至细胞成品收集单元，完成细胞成品的收集。