一种多功能T瓶全自动、全封闭干细胞扩增、诱导分化系统的制作方法

本发明涉及干细胞培养技术，尤其涉及一种多功能T瓶全自动、全封闭干细胞扩增、诱导分化系统。

背景技术：

干细胞（Stem Cells）是具有自我复制功能及多向分化潜能的细胞，在特定条件下能再生成人体的各种细胞、组织或器官，医学界称为“万能细胞”。干细胞在基础研究和转化医学应用中具有重要意义，在再生医学、细胞治疗、药物筛选、精准医学等领域具有广阔的应用前景。

但是，在以往，干细胞培养、诱导分化及筛选过程只能依靠人工操作完成，人工操作主要存在两大问题。一是技术门槛高，一位研究员要经过长时间的技术训练，才能储备足够的经验，掌握相关技术。二是通过人工培养，效率低、成本高、易污染，而且存在质量不均一等安全性问题，限制了干细胞在再生医学领域，尤其是将来在人体内的应用。

为此如何实现干细胞全封闭、智能化、自动化培养、诱导分化，是当下亟待解决的主要问题，尽管国内推出了自动化、智能化干细胞诱导培养设备，实现了以机器学习及人工智能算法为判定的细胞自动化诱导。

但是该设备运行对空间要求较高，需要设置在全封闭的洁净室内，占地面积较大，且进料、出料及换液时仍需要机械手移至A级空间操作，操作复杂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种多功能T瓶全封闭、全自动干细胞扩增、诱导分化系统，基于多功能T瓶，采用全封闭式自动化培养箱，解决现有技术存在的缺憾，实现干细胞全自动扩增、诱导分化，无需占用专门的密闭洁净室，中间过程无需人工添收料，效率高，杜绝了中间过程污染的风险。

本发明采用如下技术方案实现：

一种多功能T瓶的全自动、全封闭干细胞扩增、诱导分化系统，包括：封闭式自动化培养箱，模块化培养T瓶系统，显微在线监测系统，自动化加液系统，自动化收液系统和自动控制系统。

所述封闭式自动化培养箱为卧式单开门结构，可自动控制温度和CO2浓度。

所述模块化培养T瓶系统设置在封闭式自动化培养箱内，包括底板、若干T瓶托盘，及若干培养T瓶；所述底板上设置有若干适配T瓶托盘的镂空位，所述T瓶托盘上设置有若干适配培养T瓶的镂空位；所述底板下部设置有横向的转轴和设置有与镂空位对应的电动升降杆；所述T瓶托盘后端通过轴承座设置在转轴上，前端设置在电动升降杆上。

所述培养T瓶设有进液口及出液口，所述进液口设置在培养T瓶的瓶口处，所述出液口设置在培养T瓶的上部。

所述显微在线监测系统设置在封闭式自动化培养箱内、模块化培养T瓶系统下方，由显微镜头、光源及X轴、Y轴、Z轴移动系统构成；所述X轴、Y轴、Z轴移动系统包括X轴轨道、可在X轴轨道上滑动的Y轴轨道及可在Y轴轨道上升降的Z轴轨道；所述显微镜头设置在沿Y轴轨道滑动的Z轴基座上，光源与显微镜头同步。

所述自动加液系统包括多通输送管及若干储液袋，所述储液袋连接至多通输送管，所述多通输送管通过T瓶上进液管连接至培养T瓶的进液口，所述多通输送管上设置有若干管夹阀及气泡探测器。

所述自动排液系统包括多通排液管、成品收集袋及废液收集袋， 所述培养T瓶的出液管通过多通排液管与成品收集袋及废液收集袋连接；所述多通排液管上设置有若干管夹阀和气泡检测器。

优选的，所述储液袋通过无菌接头与多通输送管连接。

优选的，所述多通输送管及多通排液管分别通过无菌接头与封闭式自动化培养箱内的培养T瓶连接。

优选的，所述多通输送管上设置有进料蠕动泵。

优选的，所述多通排液管上设置有排液蠕动泵。

优选的，所述成品收集袋及废液收集袋分别通过无菌接头与多通排液管连接。

进一步的，所述显微在线监测系统与计算机端的智能化细胞成像分析系统连接，采用国际最先进的细胞成像获取和数据分析软件。本发明的使用方法如下：

生产准备：事先将装好进液和排液管的T瓶、多通输送管、多通排液管分别封闭包装，γ射线灭菌处理。

1. 将经γ射线灭菌处理过的T瓶分别装入T瓶托盘中，并且弹簧卡固定，通过更换不同规格的T瓶托盘，可以适配不同尺寸的培养T瓶，以满足不同的需求。将T瓶上装有无菌接头的进液管、出液管分别穿过封闭式自动化培养箱上部与多通输送管及多通排液管对号无菌连接，关上培养箱门。

2. 将各种装有试剂的试剂袋分别与多通输送管对号无菌连接。

3. 将废液袋、细胞收集袋分别与多通排液管对号无菌连接。

4. 启动计算机，设备自动巡检，无异常，控制培养箱内温度37℃，CO2浓度5%。

5. 细胞扩增：

5.1 T瓶包被：向T瓶内加包被液，37℃静置n小时，将包被液移出，此步骤可根据培养基情况，若不需要包被可省略。

5.2 加培养基。

5.3 加细胞进行细胞培养。根据细胞生长曲线实时换液。

5.4 细胞诱导分化：（单纯扩增，此步骤可省略）

以间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞为例（仅供参考）

5.4.1 当细胞培养融合度达到85%时，弃去原培养基，添加诱导液A，37度、5% CO2,培养72小时；

5.4.2 去除诱导液A，添加诱导液B, 37度、5% CO2培养24小时；

5.4.3去除诱导液B，添加诱导液A, 37度、5% CO2培养；

5.4.4 重复5.4.2、5.4.3约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换新鲜诱导液B，继续培养至脂滴足够大时，培养结束。

5.5收获：

5.5.1 移出培养基；

5.5.2加pps清洗；

5.5.3移出pps（根据工艺可重复清洗）；

5.5.4 加消化液静置n分钟，成像系统计数；

5.5.5 收集细胞。

细胞图像分析：

细胞图像分析贯穿于细胞培养扩增、诱导分化整个过程。细胞图像分析系统由X轴、Y轴、Z轴系统组成，由计算机控制，细胞的图形摄像的点及范围，可事先设定好，分有n个模块：

1. 点模块，每一个T瓶底部面积上可捕捉n个点，可分为1个点、4个点、9个点等，根据工艺要求，事先设定，并根据取点的间隔时间，自动捕捉点位置的信息可以追踪细胞生长状态。

2. 面捕捉，每一个T瓶底部可分为n个面积来成像，捕捉面积大小可事先设定，由计算机控制图像自动拼接，可设定捕捉的间隔时间，收集面上的信息，自动生成细胞生长曲线。

细胞图像分析系统选用世界上最先进细胞成像获取和数据分析软件，选配高精度X、Y、Z轴系统及顶尖的显微镜，可实现明场观察和荧光观察，提供实时的超高分辨率图像，可实现活细胞成像，实时细胞生长监控，绘制细胞生长曲线，细胞的计数等，根据需要还可以进行细胞培养的质控、细胞培养优化、细胞的诱导、细胞的分化、细胞迁移的研究，可实现一机多用。

本发明的有益技术效果是：

1、本发明采用模块化设计，基于模块化多功能T瓶，通过更换不同规格的T瓶托盘，可以适配不同尺寸的培养T瓶，以满足不同的需求。

2、本发明通过自动化加液系统及自动化收液系统实现了全封闭自动加液及收液，效率高，过程中无需开启培养箱，培养T瓶全程处于密闭的培养箱内，杜绝了中间过程污染的风险；

3、本发明通过电动升降杆实现T瓶托盘在一定倾斜角度内摆动，实现了培养T瓶全自动摇动功能，无需人工，即可实现摇匀培养T瓶内液体的目的，同时亦可通过电动升降杆将T瓶倾斜，便于液体全部排出。

4、本发明采用世界上最先进细胞成像获取和数据分析软件，选配高精度X、Y、Z轴系统及顶尖的显微镜，可实现明场观察和荧光观察，提供实时的超高分辨率图像，可实现活细胞成像，实时细胞生长监控，绘制细胞生长曲线，细胞的计数等。

5、本发明除了可以大规模全封闭全自动进行细胞扩增之外，还可以进行细胞诱导分化，细胞的质控，细胞培养优化，细胞分化、细胞迁移的研究。可实现一机多用。

6、本发明无需专门的密闭洁净室，节省空间，适于推广。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2为本发明的A向剖视图；

图3为T瓶托盘微调倾斜时，本发明的A向剖视图；

图4为培养T瓶的结构示意图。

具体实施方式

通过下面对实施例的描述，将更加有助于公众理解本发明，但不能也不应当将申请人所给出的具体的实施例视为对本发明技术方案的限制，任何对部件或技术特征的定义进行改变和/或对整体结构作形式的而非实质的变换都应视为本发明的技术方案所限定的保护范围。

本实施例提供一种多功能T瓶的全自动、全封闭干细胞扩增、诱导系统，结构如图1-4所示，包括：封闭式自动化培养箱1，模块化培养T瓶系统2，显微在线监测系统3，自动化加液系统4，自动化收液系统5。

所述封闭式自动化培养箱1为卧式单开门结构，可自动控制温度和CO2浓度。

所述模块化培养T瓶系统2设置在封闭式自动化培养箱1内，包括底板21、若干T瓶托盘22，及若干培养T瓶23；所述底板21上设置有若干适配T瓶托盘22的镂空位，所述T瓶托盘22上设置有若干适配培养T瓶23的镂空位；所述底板21内端设置有横向的转轴24，外端设置有与镂空位对应的电动升降杆25；所述T瓶托盘22后端通过轴承座设置在转轴24上，前端设置在电动升降杆25上。

所述培养T瓶23设有进液口231及出液口232，所述进液口231设置在培养T瓶23的瓶口处，所述出液口232设置在培养T瓶23的上部。

所述显微在线监测系统3设置在封闭式自动化培养箱1内、模块化培养T瓶系统2下方，由显微镜头31及X轴、Y轴、Z轴移动系统构成；所述X轴、Y轴、Z轴移动系统包括X轴轨道32、可在X轴轨道32上滑动的Y轴轨道33及可在Y轴轨道33上升降的Z轴轨道34；所述显微镜头31设置在Z轴轨道34上。

所述自动加液系统4包括多通输送管41及若干储液袋42，所述储液袋42连接至多通输送管41，所述多通输送管41连接至培养T瓶23的进液口232，所述多通输送管41上设置有若干管夹阀6及气泡探测器7。

所述自动排液系统5包括多通排液管51、成品收集袋52及废液收集袋53， 所述培养T瓶23的出液口232通过多通排液管51与成品收集袋52及废液收集袋53连接；所述多通排液管51上设置有若干管夹阀6和气泡检测器7。

所述储液袋42通过无菌接头与多通输送管41连接。

所述多通输送管41及多通排液管51分别通过无菌接头与封闭式自动化培养箱1内的培养T瓶23连接。

所述多通输送管41上设置有进料蠕动泵。

所述成品收集袋52及废液收集袋53分别通过无菌接头与多通排液管51连接。

所述显微在线监测系统3与计算机端的智能化细胞成像分析系统连接，选用世界上最先进细胞成像获取和数据分析软件。本发明的使用方法如下：

生产准备：事先装好进液和排液管的T瓶、多通输送管、多通排液管分别封闭包装，γ射线灭菌处理。

1. 将经γ射线灭菌处理过的T瓶分别装入T瓶托盘中，并且弹簧卡固定，通过更换不同规格的T瓶托盘，可以适配不同尺寸的培养T瓶，以满足不同的需求。将T瓶上装有无菌接头的进液管、出液管分别穿过封闭式自动化培养箱上部与多通输送管及多通排液管对号无菌连接，关上培养箱门。

2. 将各种装有试剂的试剂袋分别与多通输送管对号无菌连接。

3. 将废液袋、细胞收集袋分别与多通排液管对号无菌连接。

4. 启动计算机，设备自动巡检，无异常，控制培养箱内温度37℃，CO2浓度5%。

5. 细胞扩增：

5.1 T瓶包被：向T瓶内加包被液，37℃静置n小时，将包被液移出，此步骤可根据培养基情况，若不需要包被可省略。

5.2 加培养基

5.3 加细胞进行细胞培养。根据细胞生长曲线实时换液。

5.4细胞诱导分化：（单纯扩增，此步骤可省略）

以间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞为例（仅供参考）

5.4.1 当细胞培养融合度达到85%时，弃去原培养基，添加诱导液A，37度、5% CO2,培养72小时；

5.4.2 去除诱导液A，添加诱导液B, 37度、5% CO2培养24小时；

5.4.3去除诱导液B，添加诱导液A, 37度、5% CO2培养；

5.4.4 重复5.4.2、5.4.3约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换新鲜诱导液B,继续培养至脂滴足够大时，培养结束。

5.5收获：

5.5.1 移出培养基；

5.5.2加pps清洗；

5.5.3移出pps（根据工艺可重复清洗）；

5.5.4 加消化液静置n分钟，成像系统计数；

5.5.5 收集细胞。

细胞图像分析：

细胞图像分析贯穿于细胞培养扩增、诱导整个过程。细胞图像分析系统由X轴、Y轴、Z轴系统组成，由计算机控制，细胞的图形摄像的点及范围，事先已设定好，分有n个模块：

1. 点模块，每一个T瓶底部面积上可捕捉n个点，可分为1个点、4个点、9个点等，根据工艺要求，事先设定，并根据取点的间隔时间，自动捕捉点位置的信息。

2. 面捕捉，每一个T瓶底部可分为n个面积来成像，捕捉面积大小可事先设定，由计算机控制图像自动拼接，可设定捕捉的间隔时间，收集面上的信息。

细胞图像分析系统选用世界上最先进细胞成像获取和数据分析软件，选配高精度X、Y、Z轴系统及顶尖的显微镜，提供实时的超高分别率图像，可实现活细胞成像，实时细胞生长监控，绘制细胞生长曲线，细胞的计数等，根据需要还可以进行细胞培养的质控、细胞培养优化、细胞的诱导、细胞的分化、细胞迁移的研究。

当然，本发明还可以有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可以根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。