本申请要求我们于2017年3月5月3日提交的具有序列号62/500,497的共同未决的美国临时申请，该临时申请以其全文并入本文。
本发明的领域是核酸的分析，并且尤其是无细胞rna(cfrna)用于指导、监测、和/或修改对诊断患有肿瘤的患者的治疗的用途。
背景技术：
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多年来，无细胞dna(cfdna)一直是已知的并已从生物流体中表征，并且已采用cfdna致力于诊断癌症并监测癌症对治疗的应答。最近，分子遗传学的进展已经不仅使得能够在相对较低的水平下检测cfdna，而且允许鉴定突变的cfdna。由于获得cfdna的方式简便，循环核酸的分析已成为诊断和治疗癌症的有吸引力的工具。然而，cfdna分析受到一些限制，因为获得的信息不能提供有关基因的实际翻译(即，对应蛋白质的存在)或表达水平的深入了解。
为了克服至少一些与cfdna相关联的困难，最近开发了用于检测和分析无细胞rna(cfrna)的组合物和方法，并且某些方法见于wo2016/077709中。虽然从各个角度来说都希望检测cfrna，但仍存在许多困难。除其他因素之外，由于cfrna相对稀少，因此cfrna测试需要对患者的肿瘤具有显著的敏感性和特异性。由于循环肿瘤rna(ctrna)的级分可能仅占血液或其他生物流体中总cfrna的一小部分的事实，在疾病(并且尤其是癌症)分析方面的这种挑战更进一步增大。
为了克服此类困难，所选择的cfrna测试一直聚焦于检测已经已知的对某些肿瘤具有特异性的标记物。例如，授予kuslich的美国专利号9,469,876和授予shelton的美国专利号8,597,892讨论了检测血液中与循环囊泡相关联的循环微rna生物标记物以诊断特定类型的癌症(例如，前列腺癌等)。在另一实例中，授予kopreski的美国专利号8,440,396披露了检测编码已知为几种类型的癌症(例如，黑素瘤、白血病等)的标记物的肿瘤相关抗原的基因的循环mrna片段。然而，这种方法通常在确定癌症患者的预后方面受到限制，因为并非所有肿瘤都具有可以经由cfrna方便地监测的通用标记物(例如，her2、psa等)，而且并非所有患有相同或相似类型的癌症的患者甚至可能以相同的方式表达相同类型的标记基因。
因此，尽管本领域已知许多实施、监测、和修改癌症治疗的方法，但它们几乎全部都具有各种缺点。因此，仍然需要改进的系统和方法以能够实现对cfrna的周期性、非侵入性且高度特异性分析。
技术实现要素：
本发明主题涉及用于尤其是在涉及对肿瘤治疗的实施、监测、和/或改变时分析cfrna的各种组合物和方法。所设想的cfrna将优选地包括具有患者和肿瘤特异性突变的cfrna，并且还包括优选地对肿瘤具有特异性的mirna和其他调控性rna分子，包括sirna、shrna、和内含子rna。
在本发明主题的一方面，本发明人设想了监测患者中的癌症的方法，该方法包括鉴定该患者的肿瘤的基因中的患者和肿瘤特异性突变的步骤。在另一步骤中，从该患者中获得体液，并且在更进一步的步骤中，定量该患者的体液中包含患者和肿瘤特异性突变的cfrna。
更典型地，可以通过将来自同一患者的肿瘤组织和正常组织的一种或多种组学数据进行比较来鉴定该基因中的患者和肿瘤特异性突变。优选地，该组学数据包括全基因组序列数据、外显子组序列数据、转录物组序列数据、和/或蛋白质组序列数据中的至少一种。优选地，该组学数据以增量同步方式进行比较。在一些实施例中，可以使用这种鉴定的患者和肿瘤特异性突变连同途径模型(例如，paradigm)来推断肿瘤的生理参数(例如，肿瘤对药物的敏感性)以及利用经验数据向途径模型提供反馈。
关于该患者和肿瘤特异性突变，设想这种突变可以编码新表位、可以来源于癌症驱动基因。此外，该患者和肿瘤特异性突变也可以与该肿瘤内癌细胞的克隆群体相关联以允许监测同一患者中癌细胞的不同亚群。当然，还应认识到，在治疗期间或在治疗之前/之后，可以重复所设想方法的一个或多个步骤(例如，获得该体液的步骤和定量该cfrna的步骤)。在这种情况下，鉴定该患者和肿瘤特异性突变的步骤因此可以鉴定第二基因中的第二患者和肿瘤特异性突变，然后可以使用该第二患者和肿瘤特异性突变来定量包含该第二患者和肿瘤特异性突变的cfrna。
此外，通常优选的是，该体液是血清或血浆。在这种实施例中，还优选的是，该定量步骤包括在条件下并且使用基本上避免细胞裂解的rna稳定剂从该体液中除去细胞的步骤。然后可以使用对由该cfrna制备的cdna的实时定量pcr进行定量。在希望时，可以将该体液或从该体液分离的该cfrna或由该cfrna制备的该cdna中的至少一些存档。例如，cfrna可以冷冻在-80℃下，而cdna可以冷冻在-4℃下或冷藏在+2℃-8℃下。所设想的方法还可以包括关于与该cfrna的数量相关联的肿瘤预后的指示生成或更新患者记录的步骤，和/或将治疗选择和/或该治疗选择成功的可能性与经定量cfrna的量相关联的步骤。
因此，并且从不同角度来看，本发明人还设想了一种监测患者中的癌症的方法，该方法包括在多个对应时间点从该患者中获得多个体液样品的步骤，和定量该患者的每个该体液样品中的第一cfrna的另一步骤，其中该第一cfrna包含该患者的肿瘤的基因中的第一患者和肿瘤特异性突变。
在本发明主题的一些方面，所设想的方法可以进一步包括鉴定该患者的该肿瘤的第二基因中的第二患者和肿瘤特异性突变的步骤，和定量该患者的体液中包含该第二患者和肿瘤特异性突变的第二cfrna的另一步骤。最典型地，通过将来自同一患者的肿瘤组织和正常组织的组学数据(例如，全基因组序列数据、外显子组序列数据、转录物组序列数据、和/或蛋白质组序列数据)进行比较来鉴定该第一肿瘤特异性突变和第二患者和肿瘤特异性突变中的至少一种。在希望或实用时，优选地通过增量同步比对来比较组学数据。此外，可以使用途径模型(例如，paradigm)和该患者和肿瘤特异性突变推断肿瘤的生理参数(例如，肿瘤对药物的敏感性)。
如先前所指出的，该第一患者和肿瘤特异性突变和该第二患者和肿瘤特异性突变中的至少一种可以编码新表位、和/或位于癌症驱动基因中、和/或可以与该肿瘤内的癌基因的克隆群体相关联。还如先前所指出的，典型地在向患者提供治疗方案期间和/或之前/之后，可重复获得该体液的步骤和定量该第一cfrna和/或该第二cfrna的步骤。
在本发明主题的其他方面，此类方法还可以包括鉴定该患者的该肿瘤的第二基因的步骤，和定量该患者的体液中来源于该第二基因的第二cfrna的另一步骤。优选地，该第二基因可以是癌症驱动基因、癌症相关基因、或癌症特异性基因。替代性地，该第二基因还可以是确定为在该患者的该肿瘤中相对于同一患者的正常组织过表达或低表达的基因。在更进一步设想的方面，该第二基因可以是检查点抑制相关基因、细胞因子相关基因、以及趋化因子相关基因中的至少一种。
在本发明主题的更进一步方面，本发明人还设想了一种确定患者中的突变标签(mutationalsignature)的方法。该方法包括定量该患者的体液中第一基因和第二基因的cfrna的步骤，其中该第一基因和该第二基因中的至少一种包含患者和肿瘤特异性突变。优选地，该第一基因或该第二基因中患者和肿瘤特异性突变中的至少一种可以编码新表位。
在一些实施例中，该第一基因和该第二基因可以是相同类型的基因。在其他实施例中，该第一基因和该第二基因可以是不同类型的基因。例如，该第一基因是癌症驱动基因，而该第二基因可以是免疫状态相关基因(例如，检查点抑制相关基因、编码细胞因子的基因、或编码趋化因子的基因)。在希望时，该定量cfrna的步骤可以在治疗(例如，使用检查点抑制剂、免疫治疗药物、化学治疗药物、和/或放射治疗)之前或期间进行。
在本发明主题的仍另一方面，本发明人设想了一种cfrna收集试剂盒。该试剂盒包括第一容器(优选用于收集血液)，该第一容器包括rna酶抑制剂、防腐剂、代谢抑制剂、和螯合剂，其中该第一容器适用于在16,000的相对离心力下离心；和第二容器(优选用于分离/纯化cfrna)，该第二容器包括选择性结合或降解cfdna的材料。
在一个优选的实施例中，该rna酶抑制剂可以包括金精三羧酸，该防腐剂可以包括重氮烷基脲，该代谢抑制剂可以包括甘油醛和氟化钠中的至少一种，和/或该螯合剂可以包括含edta。此外，通常优选的是，该第一容器进一步包括血清分离剂凝胶，而该第二容器包括不含rna酶的dna酶。在进一步特别优选的方面，该第一容器和该第二容器被构造成允许机器人加工(roboticprocessing)。
此外，本发明人还设想了一种分离cfrna的方法。此方法包括以第一相对离心力(rcf)离心全血以获得血浆级分的步骤；以第二rcf离心该血浆级分以获得澄清血浆级分的步骤；以及使该澄清的血浆级分的至少一部分经受dna降解步骤以降解ctdna和基因组dna(gdna)的又另一步骤。
最典型地，该离心全血的步骤是在如上所指出的rna酶抑制剂、防腐剂、代谢抑制剂、和螯合剂存在下进行的。此外，通常优选的是，该离心全血的步骤是在保持细胞组分的完整性的条件下进行的。例如，该第一rcf可以在700与2,500之间(例如，1,600)，和/或该第二rcf可以在7,000与25,000之间(例如，16,000)。预期将以第一rcf的离心进行15-25分钟(例如，20分钟)并且将以第二rcf的离心进行5-15分钟(例如，10分钟)。在希望或需要时，可以将cfrna储存在-80℃下和/或可以将由该cfrna制备的cdna储存在-4℃下或冷藏在+2℃-8℃下。
根据优选实施例的以下详细描述，本发明主题的各种目标、特征、方面和优点将变得显而易见。
具体实施方式
本发明人设想，肿瘤细胞和/或与肿瘤细胞相互作用或围绕肿瘤细胞的一些免疫细胞将无细胞dna和/或rna、并且更具体地是无细胞肿瘤dna(ctdna)和/或rna(ctrna)释放至患者的体液中，并且因此可能与健康个体相比增加了患者体液中特异性ctrna的数量。鉴于此，本发明人现已发现，ctdna和/或ctrna、并且特别是具有患者和肿瘤特异性突变的ctrna可以用作用于诊断肿瘤、监测肿瘤的预后、监测向患者提供的治疗的有效性、基于治疗方案成功的可能性评价该治疗方案的敏感性、选择性和定量用标记物，以及甚至用作允许对患者重复且非侵入性取样的发现工具。在此上下文中，应指出的是，总cfrna包括ctrna，其中ctrna可以具有患者和肿瘤特异性突变并且因此可与健康细胞的相应cfrna区分开来，或者其中ctrna可以选择性地在肿瘤细胞中表达但在相应健康细胞中不表达。
从不同角度来看，本发明人因此发现，可以选择各种核酸、更具体地cfdna和/或cfrna以用于检测和/或监测特定疾病(例如，肿瘤、癌症等)、疾病阶段、疾病预后、治疗方案在特定患者中的治疗应答/有效性，以及甚至在开始治疗之前预期治疗方案在特定患者中的治疗应答/有效性。
因此，在本发明主题的一个尤其优选的方面中，本发明人设想了一种使用cfdna和/或cfrna、并且尤其是ctdna和/或ctrna监测患者中的癌症的方法。在此方法中，从患者的肿瘤中鉴定基因中的患者和肿瘤特异性突变。然后，可以分析和/或定量从患者的体液中获得的ctdna/rna以确定癌症的预后。最优选地，ctdna/ctrna包含患者和肿瘤特异性突变，和/或ctrna仅在肿瘤细胞中表达。
如本文所用，术语“肿瘤”是指以下项并且可以与以下项互换地使用：可以位于或见于人体内的一个或多个解剖位置中的一种或多种癌细胞、癌组织、恶性肿瘤细胞、或恶性肿瘤组织。应当指出的是，如本文所用的术语“患者”包括被诊断为患有病状(例如，癌症)的个体以及为了检测或鉴定病状经历检查和/或测试的个体。因此，患有肿瘤的患者是指诊断为患有癌症的个体以及疑似患有癌症的个体。如本文所用，术语“提供(provide)”或“提供(providing)”是指并且包括制造、生成、放置、使得能够使用、转移、或准备好使用的任何动作。
最典型地，肿瘤中的患者和肿瘤特异性突变可以通过全基因组或全外显子组的高通量基因组测序来鉴定，该高通量基因组测序允许快速且特异性地鉴定基因中的患者和肿瘤特异性突变。优选地，进行这种高通量基因组测序以比较肿瘤和相匹配的正常组织(即，来自同一患者的非患病组织)的全基因组或外显子组从而确定基因中的肿瘤特异性突变，优选地使用如us9721062中所述的增量同步比对、和/或使用rna测序。此外，可以进行蛋白质组学分析，最优选地使用定量质谱法。在一些实施例中，进一步进行高通量基因组测序以比较肿瘤和相匹配健康个体组织(例如，肺癌患者的鳞状细胞和健康个体的鳞状细胞等)从而确定患者特异性突变。虽然不受限于本发明主题，但含有肿瘤和相匹配的正常组织的序列信息的数据格式是呈sam、bam、gar格式、或在仅列出差异的情况下呈vcf格式。
本发明人设想，患者和肿瘤特异性突变可以存在于可能与肿瘤细胞的功能直接或间接相关的任何基因中。因此，患者和肿瘤特异性突变可以是已知与已知癌症的发展和/或预后通常相关联的已知突变。然而，还设想患者和肿瘤特异性突变可能并非是具有相同类型肿瘤的患者中的常见或已知突变。因此，患者和肿瘤特异性突变可以存在于已知的肿瘤相关基因中、尤其是在癌症驱动基因中，或者可以存在于并非公知为与特定类型的肿瘤或任何类型的肿瘤相关联的基因中。当然，应理解，突变可以包括错义或无义突变、插入、缺失、融合和/或易位中的一种或多种，所有这些突变在转录时可能导致或可能不导致全长mrna的形成。如本文所用，癌症驱动基因是指这样的基因，其突变可以触发、导致或促进细胞向肿瘤细胞的转化，或触发、导致或促进在特定的微环境条件下的净细胞生长。
例如，患者和肿瘤特异性突变可以存在于肿瘤相关基因、尤其是癌症驱动基因中，该癌症驱动基因包括但不限于abl1、abl2、actb、acvr1b、akt1、akt2、akt3、alk、amer11、apc、ar、araf、arfrp1、arid1a、arid1b、asxl1、atf1、atm、atr、atrx、aurka、aurkb、axin1、axl、bap1、bard1、bcl2、bcl2l1、bcl2l2、bcl6、bcor、bcorl1、blm、bmpr1a、braf、brca1、brca2、brd4、brip1、btg1、btk、emsy、card11、cbfb、cbl、ccnd1、ccnd2、ccnd3、ccne1、cd274、cd79a、cd79b、cdc73、cdh1、cdk12、cdk4、cdk6、cdk8、cdkn1a、cdkn1b、cdkn2a、cdkn2b、cdkn2c、cea、cebpa、chd2、chd4、chek1、chek2、cic、crebbp、crkl、crlf2、csf1r、ctcf、ctla4、ctnna1、ctnnb1、cul3、cyld、daxx、ddr2、deptor、dicer1、dnmt3a、dot1l、egfr、ep300、epcam、epha3、epha5、epha7、ephb1、erbb2、erbb3、erbb4、ereg、erg、errfi1、esr1、ewsr1、ezh2、fam46c、fanca、fancc、fancd2、fance、fancf、fancg、fancl、fas、fat1、fbxw7、fgf10、fgf14、fgf19、fgf23、fgf3、fgf4、fgf6、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fh、flcn、fli1、flt1、flt3、flt4、folh1、foxl2、foxp1、frs2、fubp1、gabra6、gata1、gata2、gata3、gata4、gata6、gid4、gli1、gna11、gna13、gnaq、gnas、gpr124、grin2a、grm3、gsk3b、h3f3a、havcr2、hgf、hmgb1、hmgb2、hmgb3、hnf1a、hras、hsd3b1、hsp90aa1、idh1、idh2、ido、igf1r、igf2、ikbke、ikzf1、il7r、inhba、inpp4b、irf2、irf4、irs2、jak1、jak2、jak3、jun、myst3、kdm5a、kdm5c、kdm6a、kdr、keap、kel、kit、klhl6、klk3、mll、mll2、mll3、kras、lag3、lmo1、lrp1b、lyn、lztr1、magi2、map2k1、map2k2、map2k4、map3k1、mcl1、mdm2、mdm4、med12、mef2b、men1、met、mitf、mlh1、mpl、mre11a、msh2、msh6、mtor、muc1、mutyh、myc、mycl、mycn、myd88、myh、nf1、nf2、nfe2l2、nfkbia、nkx2-1、notch1、notch2、notch3、npm1、nras、nsd1、ntrk1、ntrk2、ntrk3、nup93、pak3、palb2、park2、pax3、pax、pbrm1、pdgfra、pdcd1、pdcd1lg2、pdgfrb、pdk1、pgr、pik3c2b、pik3ca、pik3cb、pik3cg、pik3r1、pik3r2、plcg2、pms2、pold1、pole、ppp2r1a、prex2、prkaria、prkc1、prkdc、prss8、ptch1、pten、ptpn11、qk1、rac1、rad50、rad51、raf1、ranbp1、rara、rb1、rbm10、ret、rictor、rit1、rnf43、ros1、rptor、runx1、runx1t1、sdha、sdhb、sdhc、sdhd、setd2、sf3b1、slit2、smad2、smad3、smad4、smarca4、smarcb1、smo、sncaip、socs1、sox10、sox2、sox9、spen、spop、spta1、src、stag2、stat3、stat4、stk11、sufu、syk、t(brachyury)、taf1、tbx3、terc、tert、tet2、tgfrb2、tnfaip3、tnfrsf14、top1、top2a、tp53、tsc1、tsc2、tshr、u2af1、vegfa、vhl、wisp3、wt1、xpo1、zbtb2、znf217、znf703、cd26、cd49f、cd44、cd49f、cd13、cd15、cd29、cd151、cd138、cd166、cd133、cd45、cd90、cd24、cd44、cd38、cd47、cd96、cd45、cd90、abcb5、abcg2、alcam、alpha-fetoprotein、dll1、dll3、dll4、endoglin、gja1、ovastacin、amacr、nestin、stro-1、micl、aldh、bmi-1、gli-2、cxcr1、cxcr2、cx3cr1、cx3cl1、cxcr4、pon1、trop1、lgr5、msi-1、c-maf、tnfrsf7、tnfrsf16、sox2、podoplanin、l1cam、hif-2alpha、tfrc、ercc1、tubb3、top1、top2a、top2b、enox2、tymp、tyms、folr1、gpnmb、pappa、gart、ebna1、ebna2、lmp1、bage、bage2、bcma、c10orf54、cd4、cd8、cd19、cd20、cd25、cd30、cd33、cd80、cd86、cd123、cd276、ccl1、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl7、ccl8、ccl11、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl5、cxcl6、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl16、cxcl17、cxcr3、cxcr5、cxcr6、ctag1b、ctag2、ctag1、ctag4、ctag5、ctag6、ctag9、cage1、gage1、gage2a、gage2b、gage2c、gage2d、gage2e、gage4、gage10、gage12d、gage12f、gage12j、gage13、hhla2、icoslg、lag1、magea10、magea12、magea1、magea2、magea3、magea4、magea4、magea5、magea6、magea7、magea8、magea9、mageb1、mageb2、mageb3、mageb4、mageb6、mageb10、mageb16、mageb18、magec1、magec2、magec3、maged1、maged2、maged4、maged4b、magee1、magee2、magef1、mageh1、magel2、ncr3lg1、slamf7、spag1、spag4、spag5、spag6、spag7、spag8、spag9、spag11a、spag11b、spag16、spag17、vtcn1、xage1d、xage2、xage3、xage5、xcl1、xcl2、和xcr1。
对于另一实例，一些患者和肿瘤特异性突变可以存在于编码一种或多种炎症相关蛋白的基因中，该一种或多种炎症相关蛋白包括但不限于hmgb1、hmgb2、hmgb3、muc1、vwf、mmp、crp、pbef1、tnf-α、tgf-β、pdgfa、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、嗜酸性粒细胞趋化因子、fgf、g-csf、gm-csf、ifn-γ、ip-10、mcp-1、pdgf、和htert，并且在又一实例中，ctrna编码hmgb1的全长或片段。
对于仍另一实例，一些患者和肿瘤特异性突变可以存在于基因dna修复相关蛋白或rna修复相关蛋白中。表1提供了本文所设想的主要rna修复基因及其相关修复途径的示例性集合，但应认识到，本文还明确地设想了许多其他与dna修复相关联的基因和修复途径，并且表2和表3说明了用于分析的其他示例性基因及其在dna修复中的相关功能。
表1
表2
表3
在又另一实例中，一些患者和肿瘤特异性突变可以存在于与疾病不相关联的基因(例如，持家基因)中，该基因包括与以下相关的那些：转录因子(例如，atf1、atf2、atf4、atf6、atf7、atfip、btf3、e2f4、erh、hmgb1、ilf2、ier2、jund、tceb2等)、阻遏物(例如，puf60)、rna剪接(例如，bat1、hnrpd、hnrpk、pabpn1、srsf3等)、翻译因子(eif1、eif1ad、eif1b、eif2a、eif2ak1、eif2ak3、eif2ak4、eif2b2、eif2b3、eif2b4、eif2s2、eif3a等)、trna合成酶(例如，aars、cars、dars、fars、gars、hars、iars、kars、mars等)、rna结合蛋白(例如，elavl1等)、核糖体蛋白(例如，rpl5、rpl8、rpl9、rpl10、rpl11、rpl14、rpl25等)、线粒体核糖体蛋白(例如，mrpl9、mrpl1、mrpl10、mrpl11、mrpl12、mrpl13、mrpl14等)、rna聚合酶(例如，polr1c、polr1d、polr1e、polr2a、polr2b、polr2c、polr2d、polr3c等)、蛋白质加工(例如，ppid、ppi3、ppif、canx、capn1、naca、pfdn2、snx2、ss41、sumo1等)、热激蛋白(例如，hspa4、hspa5、hsbp1等)、组蛋白(例如，histihsbc、h1fx等)、细胞周期(例如，arhgap35、rab10、rab11a、ccny、ccnl、ppp1ca、rad1、rad17等)、碳水化合物代谢(例如，aldoa、gsk3a、pgk1、pgam5等)、脂质代谢(例如，hadha)、柠檬酸循环(例如，sdha、sdhb等)、氨基酸代谢(例如，comt等)、nadh脱氢酶(例如，ndufa2等)、细胞色素c氧化酶(例如，cox5b、cox8、cox11等)、atp酶(例如，atp2c1、atp5f1等)、溶酶体(例如，ctsd、cstb、lamp1等)、蛋白酶(例如，psma1、uba1等)、细胞支架蛋白(例如，anxa6、arpc2等)、和细胞器合成(例如，bloc1s1、ap2a1等)。
关于突变类型，通常优选的是，患者和肿瘤特异性突变存在于基因的编码区(例如，外显子组)中，使得该突变可以影响由基因编码的蛋白质的氨基酸序列。因此，在一些实施例中，患者和肿瘤特异性突变可以导致产生肿瘤和患者特异性新表位。最典型地，患者特异性表位为患者所特有，并且可能因此产生患病细胞或细胞群体(例如，肿瘤的亚克隆部分)的独特且患者特异性的标记物。因此，尤其应理解，携带这种患者和肿瘤特异性突变的ctrna可以不仅作为肿瘤存在的替代标记物，而且作为特异性肿瘤亚克隆(例如，治疗抗性肿瘤)的细胞的替代标记物进行跟踪。此外，在突变编码在免疫疗法中用作靶标的患者和肿瘤特异性新表位的情况下，这种携带这种突变的ctrna将能够充当免疫疗法治疗功效的高度特异性标记物。
替代性地，还设想患者和肿瘤特异性突变存在于基因的非编码区(例如，内含子、启动子等)中，使得突变可以在不影响由基因编码的蛋白质的氨基酸序列情况下影响表达水平或转录模式(例如，选择性剪接等)。在一些实施例中，患者和肿瘤特异性突变可以存在于产生非编码rna(例如，微rna、小干扰rna、长非编码rna(incrna))的基因中，使得非编码rna的活性或功能可能会受到突变的影响。
本发明人设想，可以在从患者体液中获得的一种或多种ctdna和/或ctrna中检测到肿瘤细胞的基因中的患者和肿瘤特异性突变。另外，还设想某些患者和肿瘤特异性突变可能影响具有患者和肿瘤特异性突变的基因的表达水平或在信号传导级联下游或与具有患者和肿瘤特异性突变的基因相互作用的另一基因的表达水平。在一些实施例中，表达水平受到影响的基因可以位于同一细胞(例如，肿瘤细胞)中。例如，在另一患者和肿瘤特异性突变位于肿瘤细胞中编码蛋白激酶的基因a中的情况下，基因a的表达水平可能受到影响从而减少或增加基因a的mrna转录物的量。在仍另一实例中，在患者和肿瘤特异性突变位于肿瘤细胞中编码蛋白激酶的基因a中的情况下，在同一细胞中，在基因b表达依赖于蛋白激酶的磷酸化活性时，基因b的表达水平可能受到影响。对于仍其他的实例，在患者和肿瘤特异性突变位于肿瘤细胞中编码蛋白激酶的基因a中的情况下，在不同类型细胞(例如，nkt细胞等)中，在与具有突变的基因b编码的蛋白相互作用时基因c的表达可能受到影响。因此，肿瘤细胞基因中的患者和肿瘤特异性突变可能直接或间接影响具有突变的基因的ctrna、另一基因的ctrna、或来源于除肿瘤细胞以外的细胞的任何其他一种或多种基因的其他无细胞rna的数量。
最典型地，合适的组织来源包括全血，该全血优选地提供为血浆或血清。因此，在一个优选的实施例中，从全血样品中分离ctdna和/或ctrna，在保持细胞完整性和ctrna稳定性的条件下对全血样品进行加工。替代性地，应指出的是，也认为各种其他体液是适当的，只要ctdna和/或ctrna存在于此类流体中即可。适当的流体包括唾液、腹水、脊髓液、尿液或任何其他类型的体液，它们可以是新鲜的、化学保存的、冷藏的或冷冻的。
根据组学分析的目的，可以在任何希望的一个或多个时间点获得患者的体液。例如，可以在确认患者患有肿瘤之前和/或之后和/或此后周期性地(例如，每周、每月等)获得患者的体液以便将ctdna和/或ctrna数据与癌症的预后相关联。在一些实施例中，可以在癌症治疗(例如，化学疗法、放射疗法、药物治疗、癌症免疫疗法等)之前和之后从患者获得患者的体液。虽然它可能根据治疗类型和/或癌症类型而改变，但可以在癌症治疗后至少24小时、至少3天、至少7天获得患者的体液。为了更准确地进行比较，可以在开始癌症治疗前少于1小时、少于6小时、少于24小时、少于一周获得来自患者的体液。另外，可以在癌症治疗之前和/或之后的时段期间(例如，在24小时后每天一次，持续7天等)获得多个患者体液的样品。
另外或替代性地，可以获得健康个体的体液以比较ctdna和/或ctrna序列的顺序/修饰、和/或ctrna的数量/亚型表达。如本文所用，健康个体是指未患肿瘤的个体。优选地，健康个体可以在与患者具有共同特征(例如，年龄、性别、种族、饮食、生活环境、家族史等)的人群中选择。
设想了用于分离无细胞dna/rna的任何合适方法。例如，在一个示例性dna分离方法中，以抽入试管中的10ml全血形式接收样本。可以使用磁珠将无细胞dna与来自单核小体和双核小体复合物中的其他物分离，这些磁珠可以分离出大小在100-300bp之间的无细胞dna。对于另一实例中，在一个示例性rna分离方法中，以抽入分别含有rna稳定剂的无细胞rna
通常优选的是，使用rna稳定试剂分离cfrna。虽然设想了任何合适的rna稳定剂，但优选的rna稳定试剂包括核酸酶抑制剂、防腐剂、代谢抑制剂、和/或螯合剂中的一种或多种。例如，所设想的核酸酶抑制剂可以包括rna酶抑制剂，如焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ata)、甲酰胺、钒基-核糖核苷复合物、硅藻土、肝素、膨润土、硫酸铵、二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐，最典型地量在0.5重量％至2.5重量％之间。防腐剂可以包括重氮烷基脲(du)、咪唑烷基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂-3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1-氮杂-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、季金刚烷(quaternaryadamantine)、或其任何组合。在大多数实例中，防腐剂以约5重量％-30重量％的量存在。此外，通常设想防腐剂不含离液剂和/或洗涤剂，以减少或避免细胞与防腐剂接触时裂解。
合适的代谢抑制剂可以包括甘油醛、磷酸二羟丙酮、3-磷酸甘油醛、1,3-双磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和二羟基乙酸甘油酸、和氟化钠，其浓度典型地在0.1重量％-10重量％之间的范围内。优选的螯合剂可以包括二价阳离子螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)和/或乙二醇-双(β-氨乙基醚)-n,n,n’,n’-四乙酸(egta)，其浓度典型地在1重量％-15重量％之间的范围内。
另外，rna稳定试剂可以进一步包括蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和/或聚胺。因此，用于收集和稳定全血中的ctrna的示例性组合物可以包含金精三羧酸、重氮烷基脲、甘油醛/氟化钠、和/或edta。用于ctrna分离的其他组合物和方法在美国专利号8,304,187和美国专利号8,586,306中描述，这些专利通过援引并入本文。
最优选地，此类所设想的用于ctrna稳定化的rna稳定剂置于适用于血液收集、储存、运输、和/或离心的试管中。因此，在最典型的方面，收集管被构造为抽空的血液收集管，该血液收集管还包括一种或多种血清分离剂物质，以帮助将全血分离成含有细胞的相和基本上无细胞的相(存在不超过所有细胞的1％)。一般来讲，优选的是，rna稳定剂不使或基本上不使血细胞裂解(例如，裂解等于或小于1％、或等于或小于0.1％、或等于或小于0.01％、或等于或小于0.001％等)。从不同的角度来看，rna稳定试剂在试剂与血液组合后不会导致血清或血浆中rna数量的实质性增加(例如，总rna增加不超过10％、或不超过5％、或不超过2％、或不超过1％)。同样，这些试剂还将保持血液中细胞的物理完整性，以减少甚至消除存在于血细胞中的细胞rna的释放。这种保持可以呈可能已经或可能尚未分离的收集血液形式。在一些方面，所设想的试剂将除血液以外的收集组织中的ctrna稳定2天、更优选至少5天、且最优选至少7天。当然，应认识到，除收集管以外的许多其他收集方式(例如，测试板、芯片、收集纸、盒等)也被认为是合适的，并且ctdna和/或ctrna可以至少部分地纯化或吸附到固相上，以便在进一步加工之前增加稳定性。
容易理解的是，血浆的分级分离和cfdna和/或cfrna的提取可以按多种方式进行。在一个示例性优选方面，将10ml管中的全血离心以在1600rcf下分级分离血浆20分钟。然后将如此获得的澄清血浆级分分离并且以16,000rcf离心10分钟以除去细胞碎片。当然，各种替代性离心方案也被认为是合适的，只要离心不会导致实质性细胞裂解即可(例如，裂解不超过所有细胞的1％、或不超过0.1％、或不超过0.01％、或不超过0.001％)。使用市售凯杰公司(qiagen)试剂从2ml血浆中提取ctdna和ctrna。例如，在分离cfrna的情况下，本发明人使用了第二容器，该第二容器包括保留在过滤材料中的dna酶。值得注意的是，cfrna还包括mirna(和其他调控性rna，如shrna、sirna、和内含子rna)。因此，应理解，所设想的组合物和方法也适用于分析来自全血的mirna和其他rna。
此外，还应认识到，提取方案被设计来除去潜在的污染血细胞、其他杂质，和维持核酸在提取期间的稳定性。将所有核酸保存在有条形码的矩阵储存管中，其中将ctdna储存在-4℃下，并将ctrna储存在-80℃下或逆转录为cdna(例如，使用商业逆转录酶，如maxima或superscriptvilo)，然后将其储存在-4℃下或冷藏在+2℃-8℃下。值得注意的是，如此分离的ctrna可以在进一步加工之前进行冷冻。
设想cfdna和cfrna可以包括起源于或来源于肿瘤细胞、在人的体液中循环而未被封闭在细胞体或细胞核中的任何类型的dna/rna。虽然不希望受到特定理论的束缚，但设想当肿瘤细胞与免疫细胞相互作用时或当肿瘤细胞经历细胞死亡(例如坏死、细胞凋亡、自体吞噬等)时，cfdna/cfrna的释放可能增加。因此，在一些实施例中，可以将cfdna/cfrna封闭在小泡结构(例如，经由细胞质物质的体外释放)中，使得它可以受到保护免受某种类型的体液中的核酸酶(例如，核糖核酸酶)活性。但是，还设想在其他方面，cfdna/cfrna是裸dna/rna，该裸dna/rna没有被封闭在任何膜结构中，但可以自身呈稳定形式，或经由与一种或多种非核苷酸分子(例如，任何rna结合蛋白等)的相互作用而稳定化。
因此，cfdna可以包括任何完整的或片段化的基因组dna、或线粒体dna，并且cfrna可以包括mrna、trna、微rna、小干扰rna、长非编码rna(incrna)。最典型地，无细胞dna是片段化dna，典型地长度为至少50个碱基对(bp)、100bp、200bp、500bp、或1kbp。另外，设想cfrna是mrna的全长或片段(例如，全长的至少70％、全长的至少50％、全长的至少30％等)。
优选地，ctdna/ctrna可以来源于包含患者和肿瘤特异性突变的基因。因此，在一些实施例中，ctdna/ctrna可以是包括患者和肿瘤特异性突变的至少一部分的基因片段。然而，还设想，虽然ctdna/ctrna来源于包含患者和肿瘤特异性突变的基因，但ctdna/ctrna片段可能不包含患者和肿瘤特异性突变的整体或一部分。在一些实施例中，ctdna和ctrna是可能对应于基因的相同或基本上相似的部分的片段(例如，ctrna序列的至少50％、至少70％、至少90％与ctdna序列互补，等等)。在其他实施例中，ctdna和ctrna是可能对应于基因的不同部分的片段(例如，ctrna序列的少于50％、少于30％、少于20％与ctdna序列互补，等等)。
虽然较不优选，但还设想ctdna和无细胞rna可以来源于肿瘤细胞的不同基因。在一些实施例中，还设想ctdna和cfrna可以来源于不同类型细胞的不同基因(例如，ctdna来自肿瘤细胞而cfrna来自nk细胞，等等)。在此类情形下，优选的是，ctdna可以包含患者和肿瘤特异性突变的整体或一部分。
尽管ctdna/ctrna或cfrna可以包括编码任何细胞蛋白、胞外蛋白或非蛋白元件的任何类型的dna/rna，但优选的是至少一些ctdna/ctrna(或来自非肿瘤细胞的cfrna)编码一种或多种癌症相关蛋白、炎症相关蛋白、dna修复相关蛋白、或rna修复相关蛋白，其突变、表达和/或功能可以直接或间接与肿瘤发生、转移、免疫抑制性肿瘤微环境的形成、免疫逃逸、或肿瘤细胞上患者、肿瘤特异性新表位的呈递相关联。还设想ctdna/ctrna(或来自非肿瘤细胞的cfrna)可以来源于一种或多种编码细胞机器或结构蛋白的基因，这些细胞机器或结构蛋白包括但不限于持家基因、转录因子、阻遏物、rna剪接机器或元件、翻译因子、trna合成酶、rna结合蛋白、核糖体蛋白、线粒体核糖体蛋白、rna聚合酶、与蛋白质加工相关的蛋白质、热激蛋白、细胞周期相关蛋白、与碳水化合物代谢相关的元件、脂质、柠檬酸循环、氨基酸代谢、nadh脱氢酶、细胞色素c氧化酶、atp酶、溶酶体、蛋白酶体、细胞骨架蛋白和细胞器合成。
在尤其优选的实施例中，所设想的ctrna包括编码以下的那些：肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、过表达的rna(其中rna以高于非肿瘤细胞中的水平表达)、包含患者和肿瘤特异性突变的rna、并且特别是其中突变编码新表位(即，突变是导致氨基酸变化的密码子的一部分)的那些。在尤其设想的方面，应理解，患者和肿瘤特异性突变、并且尤其是新表位突变在治疗和监测其中用基于新表位的治疗性组合物(例如，dna质粒疫苗、酵母、或病毒表达系统)治疗患者的治疗方面是有利的。此外，合适的ctrna还包括已知为或疑似为原癌基因和/或癌基因(肿瘤启动子或肿瘤抑制子)的所有序列。因此，所设想的癌基因包括编码一种或多种生长因子、编码形成信号转导网络的一部分的蛋白质(例如，酪氨酸激酶、丝氨酸或苏氨酸激酶、gtp酶等)、和/或编码作为转录因子起作用或参与细胞周期调控或dna修复的蛋白质的那些。
例如，在癌症与ras中的一个或多个种突变相关联的情况下，设想合适的ctrna测定可以检测和/或定量突变的ras序列，并且尤其设想ras突变包括h-ras、n-ras、和k-ras中的氨基酸位置12、13、和61处的突变(例如，g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p、和q61r)。ras中进一步设想的突变包括所有已知的致癌突变，并且示例性突变在wo2015/123532和naturereviewsdrugdiscovery[自然综述药物发现]13,828-851(2014)中披露，这些文献通过援引并入本文。其他ctrna包括编码egfr、alk融合物和ros1的序列。合适ctrna的选择可以基于患者组学数据的分子谱，和/或常在特定癌症中常发现的已知突变序列的存在。
在另一优选的实施例中，合适的ctrna还可以包括参与免疫刺激和/或免疫抑制的那些。例如，已知nkd2d配体(并且尤其是可溶性nkg2d配体，如mica)降低nk细胞和ctl的细胞毒活性，并且因此尤其设想了对编码nkg2d配体(并且尤其是可溶性nkg2d配体)的ctrna的检测和/或定量。相似地，并且如下文更详细地讨论的，编码各种免疫调控因子(包括pd-1l)的其他ctrna也认为是合适的。合适的ctrna分子还可以编码间接下调抗肿瘤免疫应答的蛋白质，并且因此所设想的ctrna包括编码muc1的那些。在其他实例中，设想了编码各种癌症标志基因的ctrna。例如，在标志是emt(上皮-间质转化)的情况下，所设想的ctrna可以编码短尾蛋白(brachyury)。在这些和其他情况下(尤其是在存在分泌型抑制因子情况下)，设想一旦检测到ctrna，就可以采用合适的治疗行为(例如，此类可溶性因子的单采术去除，等等)。
还设想ctdna/ctrna或cfrna可以呈修饰形式或以不同同种型存在。例如，ctdna可以以甲基化或羟基甲基化存在的，并且一些基因(例如，gstp1、p16、apc等)的甲基化水平可以是特定癌症类型(例如，结肠直肠癌等)的标志。ctrna可以以多种同种型(例如，剪接变体等)存在，这些同种型可以与不同细胞类型和/或位置相关联。优选地，ctrna的不同同种型可以是特定组织(例如，大脑、肠、脂肪组织、肌肉等)的标志，或者可以是癌症的标志(例如，与相应正常细胞相比不同同种型存在于癌细胞中，或者不同同种型的比率在癌细胞中与相应正常细胞相比是不同的，等等)。例如，编码hmgb1的mrna以18种不同的选择性剪接变体和2种未剪接形式存在。预期那些同种型在患者身体的不同组织/位置中表达(例如，同种型a对前列腺具有特异性，同种型b对大脑具有特异性，同种型c对脾具有特异性，等等)。因此，在这些实施例中，鉴定患者体液中ctrna的同种型可以提供关于ctrna的来源(例如，细胞类型、组织类型等)的信息。
替代性地或另外，本发明人设想，ctrna可以包括调控性非编码rna(例如，微rna、小干扰rna、长非编码rna(incrna))，其数量和/或同种型(或亚型)可以因肿瘤或针对肿瘤的免疫应答的存在而变化和波动。不希望受任何具体理论的束缚，癌症患者体液中的调控性非编码rna的不同表达可能归因于癌细胞的遗传修饰(例如，染色体部分的缺失、易位等)、和/或由免疫系统在癌症组织处引起的炎症(例如，通过干扰素信号传导和/或病毒感染的激活对mir-29家族的调控，等等)。因此，在一些实施例中，ctrna可以是调节下述mrna的表达(例如，下调、沉默等)的调控性非编码rna，该mrna编码癌症相关蛋白或炎症相关蛋白(例如，hmgb1、hmgb2、hmgb3、muc1、vwf、mmp、crp、pbef1、tnf-α、tgf-β、pdgfa、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、嗜酸性粒细胞趋化因子、fgf、g-csf、gm-csf、ifn-γ、ip-10、mcp-1、pdgf、htert等)。
还设想一些无细胞调控性非编码rna可以以可与不同细胞类型和/或位置相关联的多种同种型或成员(例如，mir-29家族的成员等)存在。优选地，调控性非编码rna的不同同种型或成员可以是特定组织(例如，大脑、肠、脂肪组织、肌肉等)的标志，或者可以是癌症的标志(例如，与相应正常细胞相比不同同种型存在于癌细胞中，或者不同同种型的比率在癌细胞中与相应正常细胞相比是不同的，等等)。例如，可以将体液中mir-155的较高表达水平与乳腺肿瘤的存在相关联，并且可以将mir-155减少的表达水平与乳腺肿瘤减小的大小相关联。因此，在这些实施例中，鉴定患者体液中无细胞调控性非编码rna的同种型可以提供关于无细胞调控性非编码rna的来源(例如，细胞类型、组织类型等)的信息。
一旦分离ctdna/ctrna或cfrna，就可以使用任何合适的方法获得各种类型的组学数据。dna序列数据将不仅包括与癌症或炎症相关联的基因的存在或不存在，而且考虑其中基因突变的突变数据、拷贝数(例如，用以鉴定复制、等位基因损失或杂合性)、以及表观遗传状态(例如，甲基化、组蛋白磷酸化、核小体定位等)。关于rna序列数据，应指出的是，所设想的rna序列数据包括mrna序列数据、剪接变体数据、聚腺苷酸化信息等。此外，通常优选的是rna序列数据还包括关于转录强度(例如，损伤修复基因的转录物数目/百万个总转录物、损伤修复基因的转录物数目/所有损伤修复基因的转录物总数目、损伤修复基因的转录物数目/肌动蛋白或其他持家基因rna的转录物数目等)，以及关于转录物稳定性(例如，聚a尾的长度等)的度量。
关于转录强度(表达水平)，可以通过定量ctrna或cfrna来检查ctrna或cfrna的转录强度。v的定量可以以多种方式进行，然而，分析物的表达优选地通过使用对每种基因具有特异性的引物对ctrna或cfrna进行定量实时rt-pcr来测量。例如，可以使用在含有2μlctrna或cfrna、引物和探针的10μl反应混合物中的测定进行扩增。α-肌动蛋白或β-肌动蛋白的mrna可用作ctrna或cfrna的输入水平的内部对照。每个pcr板中包括具有已知浓度的每种分析物的样品的标准曲线或单一反应以及每种基因的阳性和阴性对照。通过扫描含有核酸的矩阵管上的2d条形码来鉴定测试样品。δct(dct)由每种分析物的定量pcr(qpcr)扩增得出的ct值减去每个单独患者血液样品的肌动蛋白的ct值而计算。患者样本的相对表达使用通用人类参考rna或已知表达所关注基因的另一对照的连续稀释液的δct的标准曲线计算，该标准曲线设定在10或合适整数的基因表达值下，从而允许针对该特定值的患者样品结果的范围产生在大约1到1000的范围内(当针对每个分析物的log浓度绘制δct时)。替代性地和/或另外，每个基因测试的δct与log10相对基因表达(标准曲线)可以在反应(历史反应)的数百个pcr板上捕获。可以对每个测定进行线性回归分析，并将该分析用于从原始标准曲线的单个点开始计算基因表达。
替代性地或另外，当希望发现或扫描新的突变或特定基因表达的变化时，实时定量pcr可以被rna测序替换或添加rna测序，以覆盖患者转录物组的至少一部分。此外，应理解，可以静态地进行分析，或者在重复取样的时间过程中进行分析以获得动态图片，而无需对肿瘤或转移进行活检。
除了rna定量之外，还可以进行cfrna的rna测序(直接或经由逆转录)以验证身份和/或鉴定转录后修饰、剪接变型、和/或rna编辑。为此，可以将序列信息与同一患者(另一患者、或参考rna)的先前rna序列进行比较，优选地使用同步位置引导的分析(例如，使用如美国专利公开号2012/0059670和/或us2012/0066001中所述的bambam)。这种分析是特别有利的，因为此类鉴定的突变可以针对患者特有的、存在于患者的mhci和/或ii复合物中的新表位进行过滤，并因此充当治疗性靶标。此外，合适的突变还可以进一步使用途径模型和患者和肿瘤特异性突变表征以推断肿瘤的生理参数。例如，合适的途径模型包括paradigm(参见例如，wo2011/139345、wo2013/062505)和相似的模型(参见例如，wo2017/033154)。此外，合适的突变还可以是癌细胞的亚群体所特有的。因此，可以基于患者和特异性肿瘤(以及甚至转移)、作为治疗性靶标的稳定性、基因类型(例如，癌症驱动基因等)、以及由具有突变的基因所编码的基因产物的受影响功能选择突变。
此外，本发明人设想，可以从患者的相同体液样品中分离、检测和/或定量多种类型的cfdna和/或cfrna，使得可以确定多种cfdna和/或cfrna的突变、数量、和/或亚型之间的关系或关联以便进一步分析。因此，在一个实施例中，从来自患者的单一体液样品中或从在基本上相似的时间点从患者获得的多个体液样品中，可以检测和定量多种cfrna物种。在此实施例中，尤其优选的是，至少一些cfrna测量值对癌症相关核酸具有特异性。
因此，这种获得的ctdna/ctrna或cfrna的组学数据信息以及一种或多种基因中肿瘤特异性、患者特异性突变的信息可以用于诊断肿瘤、监测肿瘤的预后、监测向患者提供的治疗的有效性、基于治疗方案成功的可能性评价治疗方案、以及甚至用作允许对患者重复且非侵入性取样的发现工具。
例如，不管肿瘤的具体解剖或分子类型如何，癌症的早期检测可以通过测量患者体液的样品中ctdna和/或ctrna的总数量来实现(如例如，通过援引并入本文国际专利申请pct/us18/22747中所述的)。设想当总cfdna和/或cfrna数量达到特定或预定阈值时可以假定或推断患者中存在癌症。cfdna和/或cfrna数量的预定阈值可以通过测量来自处于相似的身体状况(例如，种族、性别、年龄、其他易感遗传或疾病状况等)下的多名健康个体的总cfdna和/或cfrna数量来确定。
例如，cfdna和/或cfrna数量的预定阈值比健康个体的cfdna和/或cfrna数量的平均值或中位数多至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。应理解，这种早期检测肿瘤的方法可以在不具备关于解剖或分子特征或肿瘤、或甚至肿瘤存在的先验知识的情况下进行。为了进一步获得癌症具体信息和/或关于免疫系统状态的信息，可以检测和/或定量额外的cfrna标记物。最典型地，此类额外的cfrna标记物包括编码一种或多种如上所述的癌基因的cfrna和/或一种或多种编码与免疫抑制或其他免疫逃逸机制相关联的蛋白质的cfrna。在这种用途中的其他标记物之中，特别设想的cfrna包括编码muc1、mica、短尾蛋白和/或pd-l1的那些。
本发明人进一步设想，一旦鉴定或检测到肿瘤，就可以通过在各个时间点监测cfdna和/或cfrna的类型和/或数量来监测肿瘤的预后。如所述那样，在患者的肿瘤基因中鉴定患者和肿瘤特异性突变。一旦鉴定到，就从患者体液(典型地全血、血浆、血清)中分离cfdna和/或cfrna(其中至少一种包含患者和肿瘤特异性突变)，并且然后检测和/或定量cfdna和/或cfrna的突变、数量、和/或亚型。本发明人设想，从患者体液中检测到的cfdna和/或cfrna的突变、数量、和/或亚型可以是肿瘤状态、大小、和位置的有力指示物。例如，具有患者和肿瘤特异性突变的cfdna和/或cfrna的数量增加可以是针对肿瘤细胞的免疫应答时肿瘤细胞裂解增加和/或具有突变的肿瘤细胞数目增加的指示物。在另一实例中，具有患者和肿瘤特异性突变的cfrna对cfdna的比率增加(其中cfrna和cfdna来源于具有突变的同一基因)可以表明这种患者和肿瘤特异性突变可能导致突变基因的转录增加，从而潜在地触发肿瘤发生或影响肿瘤细胞功能(例如，免疫抗性、涉及转移等)。在仍另一实例中，具有患者和肿瘤特异性突变的ctrna的数量增加以及另一ctrna(或非肿瘤相关cfrna)的数量增加可以表明另一ctrna可能与具有患者和肿瘤特异性突变的ctrna处于相同途径中，由此使得两种ctrna(或cfrna和cfrna)的表达或活性可以相关联(例如，共同调控、一者影响另一者、在该途径中一者位于另一者的上游，等等)。
因此，应理解，cfrna定量的结果不仅可以用作产生所测量cfrna的特定细胞或细胞群体的存在或不存在的指示物，而且可以充当此类细胞或细胞群体的状态(例如，遗传、代谢，与细胞分裂、坏死和/或细胞凋亡相关)的另外指示物，尤其是在将cfrna定量的结果用作途径分析和/或机器学习模型中的输入数据的情况下。例如，合适的模型包括预测单一途径或多个途径中的途径活性(或途径组分的活性)的那些。因此，除了来自转录组学分析的rna数据(例如，经由rna测序或cdna或rna阵列获得)之外或作为其替代，定量的cfrna还可以用作模型和建模系统中的输入数据。
在特别优选的方面，ctdna/ctrna或cfrna可以包括编码新表位的核酸序列，该新表位也是免疫疗法的合适靶标。不希望受任何具体理论的束缚，本发明人设想，如果在患肿瘤时患者中来源于基因的ctrna的数量增加(例如，增加至少20％、至少40％、至少50％等)，则具有患者和肿瘤特异性突变的基因可能产生新表位。基于具有患者和肿瘤特异性突变的基因序列，可以生成潜在新表位的序列，然后可以针对与患者的hla类型的匹配进一步对其进行过滤，从而增加新表位抗原呈递的可能性。最优选地，这种匹配可以经由电脑模拟完成。最典型地，患者特异性表位为患者特有，但在至少一些情况下还可以包括肿瘤类型特异性新表位(例如，her-2、psa、短尾蛋白等)或癌症相关新表位(例如，cea、muc-1、cypb1等)。设想了靶向新表位的任何合适的免疫疗法，并且示例性免疫疗法可以包括用针对新表位的结合分子(例如，抗体、抗体片段、scfv等)靶向新表位的基于抗体的免疫疗法和基于细胞的免疫疗法(例如，具有对新表位具有特异性的受体的免疫感受态细胞等)。例如，基于细胞的免疫疗法可以包括t细胞、nk细胞、和/或nkt细胞，它们表达对来源于具有患者和肿瘤特异性突变的基因的新表位具有特异性的嵌合抗原受体。
另外，还设想，可以随时间推移(在不同时间点)检测、定量和/或分析ctdna和/或ctrna以确定肿瘤的进展/预后和/或确定治疗对患者的有效性。一般来讲，可以随时间推移从同一患者和相同的体液获得多种测量结果，并且可以在单一时间点或随时间推移定量至少第一ctrna。最优选地，这种第一ctrna来自肿瘤相关基因、肿瘤特异性基因、或涵盖患者和肿瘤特异性突变。在至少一个其他时间点，然后可以定量第二cfrna，并且然后可以将第一数量和第二数量进行关联，以进行诊断和/或监测治疗。替代性地，第二cfrna还可以来源于与患者的免疫状态相关的基因。例如，合适的cfrna可以来源于检查点抑制相关基因、细胞因子相关基因、和/或趋化因子相关基因，或该第二cfrna为mirna。因此，设想的系统和方法将不仅允许监测特定基因，而且允许监测免疫系统的状态。例如，在第二cfrna来源于检查点受体配体或il-8基因的情况下，可以抑制免疫系统。在另一方面，在第二cfrna来源于il-12或il-15基因的情况下，可以激活免疫系统。因此，第二cfrna的测量可以进一步报告治疗。同样，第二cfrna还可以来源于第二转移或亚克隆，并且可以用作治疗功效的替代标记物。就这一点而言，还应当指出的是，可以使用设想的系统和方法间接监测免疫疗法的功效。例如，在用表达新表位或多表位的dna质粒、重组酵母或腺病毒疫苗接种患者的情况下，可以检测此类重组载体的cfrna，并因此验证来自这些重组载体的转录。
特别地，在随时间推移定量cfrna的情况下，通常优选的是，对同一(并且在一些情况下新鉴定到的)突变进行多于一次的测量。例如，随着时间推移进行的多次测量可用于监测靶向特定突变或新表位的治疗效果。因此，此类测量可以在治疗之前/期间和/或之后进行。在检测到新突变的情况下，此类新突变将典型地位于不同基因中并因此监测此类多种且不同的cfrna。
不论突变的类型和数目如何，通常优选的是，关于与cfrna的数量相关联的指示生成或更新患者记录，和/或将治疗选择与经定量cfrna的特定测量量相关联，和/或将治疗(例如，免疫疗法、放射疗法、化学疗法等)对肿瘤的有效性。此外，还可以针对特定疾病(例如，特定癌症、或癌症的亚型)、特定疾病参数(例如，对特定药物具有抗性、对药物敏感的治疗)、或疾病相关状态(例如，对免疫刺激剂(如细胞因子或检查点抑制剂)有应答)建立患者记录。从不同角度来看，因此还应认识到，cfrna结果可以是患者特异性的，或者对特定疾病、疾病参数、或疾病相关状态具有特异性的，并且因此也具有作为群组特异性参数的资格。
因此，应理解，可以以任何合适的方式鉴定、定量或者在其他方面表征患者的cfrna。例如，设想单独地或与活检组织的分析组合地使用与基于血液的rna表达测试(cfrna)相关的系统和方法，这些系统和方法鉴定、定量表达、并且允许非侵入性地监测疾病驱动因素(例如，pd-l1和尼沃鲁单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab))的变化。此类cfrna中心系统和方法允许监测疾病驱动因素的变化，和/或鉴定可能与新出现的化学疗法抗性相关联的药物靶标的变化。例如，一种或多种特定基因(例如，突变型或野生型，来自肿瘤组织和/或t淋巴细胞)的cfrna存在和/或数量可以用作诊断工具以评估患者是否可能对一种或多种检查点抑制剂敏感，如可通过分析用于icos信号传导的cfrna来提供。
此外，并且从又另一角度来看，本发明还设想，所设想的系统和方法可以用于产生患者中的肿瘤的突变标签。在这种方法中，定量一种或多种cfrna，其中产生那些cfrna的基因中的至少一种包含患者和肿瘤特异性突变。这种标签可以特别有用于与实体肿瘤的突变标签进行比较，尤其是在针对同一患者的健康组织归一化两种标签的情况下。标签的差异可以指示治疗选择和/或治疗选择成功的可能性。此外，还可以随时间推移监测此类标签以鉴定呈现出治疗抗性或对治疗应答较少的细胞亚群。此类突变标签还可以用于鉴定一种或多种蛋白质、并且尤其是膜结合或分泌蛋白的肿瘤特异性表达，该表达可以充当and/nand门控的治疗性组合物中的信号传导和/或反馈信号。此类组合物在共同未决的具有序列号15/897816的美国申请中描述，该申请通过援引并入本文。
在各种其他优点中，应理解，使用所设想的系统和方法简化了治疗监测以及甚至患者的长期随访，因为靶序列已经过预先鉴定，并且可以使用简单的血液测试容易地测量靶cfrna而无需活检。这种在存在微转移的情况下或在肿瘤或转移位于妨碍活检的位置的情况下是特别有利的。此外，还应理解，所设想的组合物和方法与关于导致癌症或与癌症相关联的已知突变的先验知识无关。更进一步地，所设想的方法还允许监测克隆肿瘤细胞群体以及预测利用免疫调控疗法(例如，检查点抑制剂或细胞因子)、并且尤其是利用基于新表位的治疗(例如，使用表达新表位或多表位的dna质粒疫苗和/或病毒或酵母表达系统)的治疗成功性。
关于预防性(preventative和/或prophylactic)用途，设想对已知cfdna和/或cfrna的鉴定和/或定量可以用于评估癌症(或其他疾病或病原体)的存在或其发作风险。根据检测的特定cfrna，还可以设想，cfdna和/或cfrna可以提供有关使用特定药物或方案(例如，手术、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、饮食疗法、行为改变等)的可能治疗结局的指导。类似地，定量cfrna结果可以用于判断肿瘤健康、修改患者中癌症的免疫疗法治疗(例如，定量序列并相应地改变治疗靶标)、或评估治疗功效。还可以为患者安排治疗后诊断测试计划表，以监测患者疾病和/或免疫状态的复发或变化。
因此，本发明人进一步设想，基于检测、分析、和/或定量的cfdna和/或cfrna，可以生成和推荐新的治疗计划或者可以更新先前使用的治疗计划。例如，可以基于以下提供使用免疫疗法靶向由基因a编码的新表位的治疗推荐：检测到ctdna和/或ctrna(来源于基因a)，以及具有基因a中患者和肿瘤特异性突变的ctrna的表达水平增加，该ctrna获自患者的第一血液样品。在使用靶向由基因a编码的新表位的抗体治疗1个月之后，抽取第二血液样品，并且确定ctrna水平。在第二血液样品中，基因a的ctrna表达水平降低而基因b的ctrna表达水平增加。基于这种更新的结果，可以将治疗推荐更新为靶向由基因b编码的新表位。另外，可以更新患者记录：靶向由基因a编码的新表位的治疗有效减少表达由基因a编码的新表位的肿瘤细胞的数目。
实例
基于通过除放射学测试以外的方法评价肿瘤应答的未满足需求，本发明人设想了测量患者血浆中以下项的变化：基因表达、突变的等位基因分数、pdl-1表达和/或无细胞dna[ctdna]和/或rna[ctrna]的数量，以监测疾病状态并预测抗肿瘤疗法的结局。
从全血中分离ctdna/ctrna：通过静脉穿刺获得全血，并且将10ml收集到分别含有rna或dna稳定剂的无细胞rna
在一个实例中，本发明人测量了经历第一线治疗、患有非小细胞肺癌(nsclc)和乳腺癌的转移性患者中血浆ctdna/ctrna的连续水平并将其与通过ct扫描所见的应答(完全应答(cr)/部分应答(pr)/稳定疾病(sd)/进展性疾病(pd))相关联。本发明人还监测了用免疫疗法治疗的nsclc患者中的pd-l1表达。从血浆中提取ctdna和ctrna，用随机引物将ctrna逆转录为cdna。然后通过rt-qpcr确定ctdna和ctrna的数量。
更具体地讲，将52名患者(28名乳腺癌/24名nsclc)招募于此实验中的两个独立患者组中：乳腺癌组中28名患者并且nsclc组中24名患者。在乳腺癌组中，39％(11/28)是高加索人(nhw)并且36％(10/28)是西班牙人(h)，并且52名患者中的20名患者完成了疗法。2名患者具有pr并且未显示出ctdna/ctrna水平的未变化(nc)或减少(dec)。11名患者实现sd，9名具有ctdna/ctrna的nc水平。在具有pd的患者之中，5名患者中的5名经历ctdna/ctrna水平的显著增加(inc)。总而言之，在乳腺癌患者之中，应答与ctdna/ctrna水平之间存在84％(16/19)的一致性。这些相互关联(r＝0.7002，p<0.0001)。在nsclc组中，71％(16/24)是nhw并且25％(6/24)是h。在所有患者中，87％(21/24)的患者患有非鳞状细胞癌(sqcc)。在进行ct扫描的20名患者中，一名患者具有pr伴有ctdna/ctrna的dec水平，10名患者实现了sd，都显示出ctdna/ctrna的dec或nc水平。8名患者具有pd，其中6名甚至在pd前7周就具有ctdna/ctrna的inc水平。在nsclc患者中，应答与ctdna/ctrna水平之间存在90％(17/19)的一致性。这些相互关联(r＝0.6231，p<0.0001)。在5名患者中，当ct扫描显示sd或pr时pd-l1表达保持稳定。
如表4可见，在临床应答与患有nsclc(90％)和乳腺癌(84％)的患者中的ctdna/ctrna的血浆水平的变化存在强关联。可以在进行成像前几周记录这些中的一些。因此，ctrna可以与ctdna一样有效地作为预测工具。
为了进一步确认ctrna和ctdna结果的有效性，本发明人进行了一致性测定，其中在双盲测试中比较了两种癌症类型的组织活检值和液体活检结果。值得注意的是，并且如在下表中所示，数据相关性很好，并确立了ctrna和ctdna作为预后和诊断标记物的效用。
表4
在又另一实例中，folfoxiri加贝伐单抗(bevacizumab)一直用作转移性结肠直肠癌(mcrc)的标准初始疗法并且应是具有ras突变的肿瘤中的优选方案之一。然而，在接受folfoxiri加贝伐单抗的日本患者中报道有频繁的发热性中性粒细胞减少(fn)。本发明人进行了ii期试验以评估第一线m-folfoxiri加贝伐单抗针对mcrc中的ras突变的安全性和活性，该试验伴随有液体活检(lb)研究(umin000015152)。
具体地讲，对患有无法切除/可测量的肿瘤、患有ras突变肿瘤的患者给予贝伐单抗和m-folfoxiri(伊立替康150mg/m2、奥沙利铂85mg/m2、和左亚叶酯[lv]
200mg/m2和氟尿嘧啶2400mg/m2，并且每两周重复一次)的组合。在最多12个周期的诱导疗法后，施用使用氟尿嘧啶/亚叶酸加贝伐单抗的维持疗法。主要终点为客观应答率(orr)。无进展生存期(pfs)、总生存期、早期肿瘤缩小(ets)、应答深度(dpr)、和安全性是次要终点。在治疗期间的3个时间点(治疗前、8周、和进展)收集血浆样品。使用对kras、nras、braf、和pik3ca变体具有特异性的竞争性等位基因特异性
64名参与者中的六十二名可评估folfoxiri加贝伐单抗的功效。参与者组的中间年龄为63岁(36-75岁)。55％的参与者是男性，并且45％是女性。92％的参与者处于有利的pso阶段，而27％的参与者患有右侧肿瘤。平均随访时间为7.9个月。客观应答率(orr)和疾病控制率分别为74.2％和96.8％。在参与者中，74％的参与者显示ets并且中位dpr为48％。未达到中位pfs。常见的3或4级不良事件是中性粒细胞减少症(49％)、高血压(22％)、腹泻(13％)和fn(4.8％)。未发生治疗相关的死亡。液体活检研究显示，在治疗前，在72％(38/53)的患者中观察到任何突变。不论治疗前突变状态如何，第8周的突变的存在都与orr相关联[无突变；80％(32/40)，任何突变；45％(5/11)，p＝0.05]。此外，在治疗前具有pik3ca突变的患者具有不良应答(43％，3/7)。
观察到，m-folfoxiri加贝伐单抗是有活性的，但未产生对ras突变型mcrc的功效，并且可能对于日本患者更可行。kras、nras、pik3ca突变的状态可以潜在地预测对三联方案加贝伐单抗的最佳应答。
除了癌症之外，所设想的系统和方法还可用于依赖于特异性标记物的存在和/或数量的各种其他测试系统。因此，本文呈现的方法可以用于背景/药物滥用测试、筛查移民、旅行、或大流行病控制、以及筛查保险风险鉴定。其他考虑和实施例在具有序列号pct/us18/22747的共同未决的pct申请和wo2016/077709中提供，这些专利通过援引并入本文。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的范围中之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他性的方式指代要素、部件或步骤，从而指示所提及的要素、部件或步骤可以与未明确提及的其他要素、部件或步骤一起存在、或使用、或组合。当说明书权利要求涉及选自由a、b、c……和n组成的组中的至少一种时，该文字应解释为只需要该组中的一个要素，而不是a加n、或b加n等。