1.相关申请的交叉引用本申请要求2017年9月18日提交的美国临时申请序列号62/560,029和2018年5月4日提交的美国临时申请序列号62/667,000的优先权，通过引用其全部内容将其纳入本文。2.联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明本发明得到darpa授予的hr0011-15-3-0001协议下由政府支持所完成。政府对本发明享有某些权利。3.发明领域本文所提供的方法和组合物通常涉及分子生物学和遗传工程改造领域。4.
背景技术：
：：遗传工程改造技术将靶向修饰引入宿主细胞基因组能够用于各种领域。根本地，确定基因型如何影响表型取决于引入靶向插入或缺失以削弱或废除天然基因功能的能力。在合成生物学领域，制造能够产生感兴趣的化合物或蛋白质的遗传修饰的微生物需要将定制的dna序列插入宿主细胞的染色体中；工业规模生产通常需要在宿主细胞基因组中引入多个基因。对于某些宿主细胞，特别是对于常规酵母细胞(例如，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))，充分开发了遗传工具以进行靶向的基因组基因缺失和整合。多种非常规酵母细胞对于工业应用(例如，小分子和蛋白质生产)是有吸引力的宿主。然而，用于工程改造这些物种的工具通常很差。例如，克鲁维酵母属(genuskluyveromyces)，特别是马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)，因其快速生长，高耐酸性和高温耐受性，对于生产工业产品和抗体是有吸引力的酵母宿主。然而，由于非同源末端连接(nhej)的高基础(basal)速率以及维持稳定质粒的困难，对马克斯克鲁维酵母进行靶向基因组改变历来很耗时。最近首次报道了基于crispr破坏马克斯克鲁维酵母中的基因，但是没有整合任何基因并且该破坏依赖于nhej。当前，尚未报道过马克斯克鲁维酵母中兆核酸酶介导的，靶向的，单基因组的整合或多重整合。这类整合将极大地减少遗传工程改造循环时间至少50％。因此，需要改善用于各种克鲁维酵母宿主细胞基因组修饰的已知方法。本发明解决了这些和其他需求。5.技术实现要素：本发明提供了修饰克鲁维酵母宿主细胞基因组中靶位点的方法。该方法包括使具有降低的非同源末端连接(nhej)活性的宿主细胞接触：第一线性核酸，其能够与其自身或与所述宿主细胞所接触的一种或多种其他线性核酸同源重组，从而所述宿主细胞中的同源重组导致环状染色体外核酸的形成，所述环状染色体外核酸包含选择性标志物的编码序列和来自马克斯克鲁维酵母的稳定元件。在一些实施方式中，稳定元件包含与seqidno：2至少95％相同的cen序列以及与seqidno：3至少90％相同的ars共有序列；能够切割靶位点的核酸酶；和能够在切割的靶位点处同源重组的供体dna分子，从而宿主细胞中的同源重组导致供体线性核酸在靶位点处整合。然后选择表达选择性标志物的转化宿主细胞。在一些实施方式中，该方法还包括回收其中供体dna分子已经同源重组于靶位点的宿主细胞。在一些实施方式中，稳定元件与长度小于750bp且包含seqidno:1残基202-876或残基537-1252的序列至少90％相同。在其他实施方式中，稳定元件与seqidno:1至少95％相同。宿主细胞可以是马克斯克鲁维酵母。在一些实施方式中，接触步骤包括使宿主细胞与能够和宿主细胞基因组中不同靶位点同源重组的两种或更多种供体dna分子接触，从而宿主细胞中的同源重组导致供体dna分子在不同的靶位点处整合。在一些实施方式中，环状染色体外核酸还包含核酸酶的编码序列。在一些情况中，核酸酶可以是rna引导的dna内切核酸酶，如cas9内切核酸酶。在一些实施方式中，环状染色体外核酸还包含编码crrna活性和tracrrna活性的序列，其能够通过rna引导的dna内切核酸酶实现靶位点的位点特异性识别和切割。crrna活性和tracrrna活性可以表达为单个连续rna分子。在一些实施方式中，在使宿主细胞与编码crrna活性和tracrrna活性的序列接触之前，将编码rna引导的dna内切核酸酶的核酸预整合到宿主细胞基因组中。通过在yku70或yku80基因座处整合编码rna引导的内切核酸酶的核酸来降低nhej。本发明还提供了用于修饰克鲁维酵母宿主细胞基因组中靶位点的方法，所述方法包括：使具有降低的非同源末端连接(nhej)活性的宿主细胞接触核酸分子，所述核酸分子包含稳定元件，所述稳定元件包含与seqidno：2至少95％相同的cen序列以及与seqidno：3至少90％相同的ars共有序列，和编码能够切割靶位点的核酸酶的核酸序列；和能够在切割的靶位点处同源重组的供体dna分子。然后选择其中供体dna分子被整合进入靶位点的转化宿主细胞。宿主细胞可以是马克斯克鲁维酵母。核酸酶可以是兆核酸酶，如f-cphi。在一些实施方式中，稳定元件与长度小于750bp且包含seqidno:1残基202-876的序列至少90％相同。在其他实施方式中，稳定元件与seqidno:1至少95％相同。本发明还提供了通过本发明的方法制备的宿主细胞。本发明还提供了重组核酸分子，其包含(1)编码核酸酶的核酸序列，或编码crrna活性和tracrrna活性的核酸序列，其能够通过rna引导的dna核酸酶实现靶位点的位点特异性识别和切割，和(2)稳定元件，其包含与seqidno:2至少95％相同的cen序列和与seqidno:3至少90％相同的ars共有序列。在一些实施方式中，稳定元件与长度小于750bp且包含seqidno:1残基202-876的序列至少90％相同。在其他实施方式中，稳定元件与seqidno:1至少95％相同。核酸酶可以是rna引导的dna内切核酸酶，如cas9内切核酸酶。核酸酶可以是兆核酸酶，如f-cphi。本发明还提供了重组核酸分子和宿主细胞，其包含seqidno:4、7或10中所示cen序列和/或ars共有序列的稳定元件。本发明还提供了包含稳定元件的重组核酸分子和宿主细胞，所述稳定元件包含与seqidno:4、7或10中所示cen序列和/或ars共有序列至少90％或95％相同的序列。本发明还提供了使用这些重组核酸分子和宿主细胞的本文所述的方法。定义本说明书和所附权利要求书中，单数形式“一”和“所述”包括复数含意，除非另有明确说明。如本文所用，术语“稳定元件”指这样的核酸序列，其为约200至约1300bp，通常为约400至约900bp，并且经常为约600至约750bp，包含自主复制序列(ars)共有序列和任选地着丝粒序列(cen)。稳定元件允许包含稳定元件的染色体外dna分子(线性或环状)在宿主细胞中保持稳定，用于在非选择性培养基中延长培养时间。本发明的稳定元件通常提供染色体外dna分子在非选择性培养基中至少约10代，通常为约20代，并且经常为约30或更多代的稳定性。ars和cen序列在酵母中已经进行了深入研究。ars是酵母染色体中dna复制的起点，并且是特别短的模块化dna序列，其包含称为ars共有序列(acs)的11-17bp的核心序列元件以及侧接序列。cen序列是染色体上复杂结构的部分，纺锤体纤维在减数分裂和有丝分裂期间会附着在该结构上。这类序列通常为约100至约200bp，并且可以细分为三个保守的dna元件：cdei、cdeii和cdeiii。本发明示例性的cen序列包括seqidno：2、5、8和11。本发明示例性的ars共有序列包括seqidno：3、6、9和12。本发明示例性的稳定元件源自马克斯克鲁维酵母并包括seqidno：1、4、7、10、13和14)。还包括这些序列的子序列，这包含ars共有序列，任选地cen序列，和任意间隔序列。该类型的示例性稳定元件包括seqidno:1的残基202-876或残基537-1252和seqidno:4的残基1-566或残基348-1043。本领域技术人员将意识到的是，上述示例性序列可以经修饰并且仍然为染色体外dna分子提供稳定性。例如，本发明考虑了与示例性序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的cen序列、ars共有序列或稳定元件。本领域技术人员容易理解如何确定两个核酸的相同性。例如，可以在比对两个序列之后计算相同性从而使相同性处于其最高水平。计算相同性的另一种方法可以通过公开的算法进行。例如，可以使用needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的算法进行序列的最佳比对用于比较。术语“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(batzer等，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等，mol.cell.probes8:91-98(1994))。术语“基因”可以表示参与产生或编码多肽链的dna区段。它可以包括编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。或者，术语“基因”可以表示涉及产生或编码非翻译的rna，如rrna、trna、grna或微小rna的dna区段。“启动子”定义为指导核酸转录的一种或多种核酸控制序列。如本文所用，启动子包括靠近转录起始位点的必需的核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。如本文所用，术语“无标志物(marker-less)”指在没有同时整合选择性标志物的情况下将供体dna整合到宿主细胞基因组内的靶位点中。在一些实施方式中，该术语还指在不利用依赖于将选择性标志物整合到宿主细胞基因组中的选择方案的情况下回收这类宿主细胞。例如，在某些实施方式中，附加型或染色体外选择标志物可以用于选择包含质粒的细胞，所述质粒包含grna。只要选择性标志物没有被整合到宿主细胞基因组中，这类应用就被认为是无标志物。如本文所用，术语“操作性连接”指核酸序列之间的功能性连接，从而使序列编码所需的功能。例如，当连接的启动子和/或调节区功能性地控制编码序列的表达时，感兴趣基因(例如选择性标志物)的编码序列与其启动子和/或调节序列操作性连接。它还指编码序列之间的连接，从而使它们可以被相同的连接的启动子和/或调节区所控制；编码序列之间的这种连接也可以称为在框内或相同编码框中连接。“操作性连接”还指功能性但非编码序列，如自主繁殖序列或复制起点的连接。当这类序列能够进行其正常功能时，例如，在宿主细胞中能够使携带该序列的载体复制、繁殖和/或分离，这类序列处于操作性连接。如本文所用，术语“转化”指因为将外源性遗传物质引入宿主细胞而导致的宿主细胞的遗传改变。如本文所用，术语“选择表达选择性标志物的宿主细胞”还包括由转化细胞群富集表达选择性标志物的宿主细胞。如本文所用，术语“选择性标志物”指用作选择包含如本文所述的标志物(例如，由宿主细胞中环状染色体外核酸所表达的标志物)的宿主细胞指导的基因。选择性标志物包括但不限于：荧光标志物，发光标志物和药物选择性标志物等。荧光标志物可以包括但不限于，编码荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(dsrfp)等的基因。发光标志物可以包括但不限于，编码发光蛋白诸如荧光素酶的基因。适用于本文所提供的方法和组合物的药物选择性标志物包括但不限于，对抗生素诸如氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、四环素、氯霉素和新霉素具有抗性的基因。在一些实施方式中，选择可以是阳性选择；也就是，由群体分离表达标志物的细胞，例如，以产生包含该选择性标志物的富集的细胞群。在其他情况中，选择可以是阴性选择；也就是，将群体与细胞分离，例如，以产生不包含选择性标志物的富集的细胞群。可以通过适用于所用选择性标志物的任何常规分离技术进行分离。例如，如果使用荧光标志物，那么可以通过荧光激活细胞分选来分离细胞，然而如果已经插入了细胞表面标志物，那么可以通过亲和分离技术，例如，磁性分离，亲和色谱，使用与固体基质连接的亲和试剂“淘选(panning)”，或其他常规技术将细胞从异质性群体分离。“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。本文中，这些术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键相连。本文中，“互补”或“互补性”指核苷酸之间或核酸之间特定的碱基配对。一些实施方式中，举例来说而非限定，描述了宿主细胞基因组中靶位点或区和grna之间的碱基配对。互补核苷酸通常是a和t(或a和u)以及g和c。本文所述的grna可以包含序列，例如，与宿主细胞中基因组序列完美互补或基本互补(例如，具有1-4个错配)的dna靶向序列。“crispr/cas”系统是指用于防御外来核酸的一类广泛的细菌系统。crispr/cas系统存在于广泛的真细菌和古细菌中。crispr/cas系统包括如下类型：i、ii和iii亚型。野生型ii型crispr/cas系统利用rna引导的内切核酸酶，cas9，与grna一起，识别和切割外来核酸。如本文所用，相对于归巢内切核酸酶，锌指核酸酶，tal效应物核酸酶或rna引导的内切核酸酶(例如，cas9)，术语“切割”，“裂开”和/或“裂解”指在特定核酸中产生断裂的行为。如本领域技术人员所理解的，该断裂可以留下钝性末端或粘性的末端(即5'或3'突出端)。该术语还包括单链dna断裂(“切口(nick)”)和双链dna断裂。如本文所用，术语“cas9”指rna引导的核酸酶(例如，来自细菌或古细菌来源，或由其衍生)。rna引导的核酸酶包括前述cas9蛋白质和其同源物，并且包括但不限于cpf1(参见例如，zetsche等,cell,第163卷,第3期,第759–771页,2015年10月22日)。cas9同源物存在于多种真细菌，包括但不限于，下述分类学组的细菌：放线菌(actinobacteria)、产水菌(aquificae)、拟杆菌-绿菌(bacteroidetes-chlorobi)、衣原体-疣微菌(chlamydiae-verrucomicrobia)、绿屈挠菌(chlroflexi)、蓝藻细菌(cyanobacteria)、厚壁菌(firmicutes)、变形菌(proteobacteria)、螺旋体(spirochaetes)、和热孢菌(thermotogae)。示例性的cas9蛋白是酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9蛋白。其他cas9蛋白和其同源物述于，例如，chylinksi,等,rnabiol.2013年5月1日；10(5):726–737；nat.rev.microbiol.2011年6月；9(6):467-477；hou,等,procnatlacadsciusa.2013年9月24日；110(39):15644-9；sampson等,nature.2013年5月9日；497(7448):254-7；和jinek,等,science.2012年8月17日；337(6096):816-21。可以为了在宿主细胞中具有高效活性或增强稳定性而优化本文所提供的任何cas9核酸酶的变体。因此，还考虑了用于在克鲁维酵母中表达的工程改造的cas9核酸酶，例如，密码子优化的cas9核酸酶。如本文所用，在修饰宿主细胞基因组中靶位点的上下文中，术语“修饰”或“改性”是指在靶位点中诱导核酸断裂。修饰可以用于编辑基因组。如本文所用，术语“编辑”指靶位点处基因组序列的结构变化。例如，可以通过使核苷酸序列缺失或将核苷酸序列插入细胞的基因组中来编辑宿主细胞基因组。核苷酸序列可以编码多肽或其片段。这类编辑可以这样进行，例如，通过诱导宿主细胞基因组中靶位点内的双链断裂，或相反链上的一对单链切口，并侧接宿主细胞基因组中的靶位点。用于在靶位点处或靶位点内诱导单链或双链断裂的方法包括使用核酸酶，如兆核酸酶，rna引导的dna内切核酸酶，或其衍生物。如本文所用，在将核酸或蛋白质引入宿主细胞的上下文中，短语“引入”或“接触”指导致宿主细胞内存在异源性核酸或多肽的任何过程。例如，该术语包括引入核酸分子(例如，质粒或线性核酸)，其编码感兴趣的核酸(例如，rna分子)或感兴趣的多肽并导致rna分子的转录和多肽的翻译。该术语还包括将编码rna分子或多肽的核酸整合到祖细胞的基因组中。然后将核酸通过后续世代传递至宿主细胞，从而(例如)将编码rna引导的内切核酸酶的核酸“预整合”到宿主细胞基因组中。在一些情况中，引入指核酸或多肽由宿主细胞外部至宿主细胞内部的易位。考虑了将核酸、多肽和其他生物分子引入宿主细胞的多种方法，包括但不限于，电穿孔，与纳米线或纳米管接触，原生质球化，peg1000介导的转化，基因枪，乙酸锂转化，氯化锂转化等。本文所用短语“异源性”指通常不天然存在的东西。术语“异源性核苷酸序列”指通常不天然存在于给定细胞的核苷酸序列。因此，异源性核苷酸序列可以是：(a)对其宿主细胞是外来的(即，对细胞为异源性的)；(b)天然存在于宿主细胞中(即，内源性)，但以不自然量存在于细胞中(即，比宿主细胞中天然存在的量大或少)；或(c)天然存在于宿主细胞中但位于其天然基因座外。如本文所用，术语“同源重组”指核苷酸序列在两个足够相同的dna分子之间交换的分子过程。如果两个序列在至少15个碱基对，至少20个碱基对，至少50个碱基对，至少100个碱基对，至少250个碱基对，至少500个碱基对，或超过500个碱基对的长度上的重组区域之间具有至少70％、至少75％>、至少80％>、至少85％>、至少90％>、至少95％>、至少99％>或100％相同性，那么两个dna分子具有“足够的”序列相同性。本领域技术人员容易理解如何确定两个核酸的相同性。例如，可以在比对两个序列从而使相同性处于其最高水平之后计算相同性。计算相同性的另一种方法可以通过公开的算法进行。例如，可以使用needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的算法进行序列的最佳比对用于比较。对于重组区域之间有效长度的同源性的讨论，参见hasty等(molcellbiol11:5586-91(1991))。本文所用术语“非同源性末端连接”或nhej指这样的细胞过程，其中dna链的切割或切口端在不需要同源性核酸模板的情况下直接连接。nhej可以导致修复位点处一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或其组合。本文所用术语同源介导的修复(hdr)指这样的细胞过程，其中dna链的切割或切口端通过同源模板核酸的聚合反应修复，例如，供体dna分子。因此，原始序列被模板的序列替代。同源性模板核酸可以通过基因组中其他部位的同源性序列(姐妹染色单体，同源性染色体或相同或不同染色体上的重复区域)提供。或者，可以引入外源性模板核酸，例如，供体dna分子，以在靶位点获得特定的hdr诱导的序列改变。以此方式，可以将特定序列引入切割位点。如本文所用，术语“ku70”与“yku70”可以互换使用，而术语“ku80”与“yku80”可以互换使用。非同源末端连接涉及由yku70(或ku70)和yku80(或ku80)基因座编码的蛋白质。ku以大约70kda(通常称之为yku70或ku70，取决于生物体)和80kda(通常称之为yku80或ku80，取决于生物体)的两个多肽的异二聚体存在。6.附图说明图1显示了示出集落生长的皮氏培养皿的示意图。图1显示了生成的新马克斯克鲁维酵母cen/ars质粒比具有pkd1元件而非马克斯克鲁维酵母特异性cen/ars序列的相同质粒更稳定。使用马克斯克鲁维酵母cen/ars质粒转化的集落比旧集落更大和更圆，其是由于集落扇状化(sectoring)和质粒丢失而导致的粗糙集落。此外，含有新质粒的集落在nat选择下在液体培养中生长过夜(不同于包含pkd1元件质粒的集落)，并由酵母小规模制备物(miniprep)中回收可转化质粒。图2显示了示出集落生长的皮氏培养皿的示意图。图2显示了yku70的缺失消除了nhej介导的线性质粒环化，并在相同背景下通过质粒缺口修复证明了同源重组。野生型马克斯克鲁维酵母(左)在重叠缺口修复片段存在或不存在的情况下使线性载体片段环化。yku70缺失菌株(右)仅在补充缺口修复片段时使质粒环化。图3显示了使用含有不同马克斯克鲁维酵母cen/ars元件的质粒转化马克斯克鲁维酵母野生型菌株。在每次转染中，使用100ng小规模制备的质粒。a.菌株1的转化；b.菌株2的转化。图4显示了使用含有不同cen/ars元件的grna载体进行马克斯克鲁维酵母转化的实验布局。两种菌株均作为转化的宿主。各转化包含50ng的含cen/ars_1至cen/ars_4的线性grna载体；200ng的grna和500ng的供体dna根据平板布局被添加到转化。图5显示了使用含有cen/ars_5的grna载体的马克斯克鲁维酵母转化。两种菌株均作为转化的宿主。各转化包含50ng的含cen/ars_5的线性grna载体；200ng的grna和500ng的供体dna根据平板布局被添加到转化。图6总结了来自马克斯克鲁维酵母菌株1转化的三个基因座gas2、ndt80和gal80的整合。使用序列特异性引物通过集落pcr筛选各基因座。测试12个集落的单整合和双整合；测试30个集落的三重整合。gas2:s；ndt80:n；gal80:l.a至e：cen/ars_1至cen/ars_5效率的总结。图7总结了来自马克斯克鲁维酵母菌株2转化的三个基因座gas2、ndt80和gal80的整合。使用序列特异性引物通过集落pcr筛选各基因座。测试12个集落的单整合和双整合；测试30个集落的三重整合。gas2:s；ndt80:n；gal80:l.a至e：cen/ars_1至cen/ars_5效率的总结。7.具体实施方式本发明提供了修饰克鲁维酵母宿主细胞基因组中一个或多个靶位点的方法。本发明的方法使用包含本发明稳定元件的dna分子，所述稳定元件允许dna在宿主细胞中保持稳定多个世代。7.1.缺口(gap)修复在一些实施方式中，靶位点的修饰包括使用crispr/cas系统以及经由缺口修复(如wo2015/095804中所述，其通过引用纳入本文)体内组装标志物和/或grna载体的方法。在这些方法中，使具有降低的非同源末端连接(nhej)活性的克鲁维酵母宿主细胞与包含本发明的稳定元件的线性核酸接触。线性核酸分子能够与其自身或与宿主细胞所接触的一种或多种其他线性核酸同源重组，从而宿主细胞中的同源重组导致环状染色体外核酸的形成，所述环状染色体外核酸包含稳定元件和选择性标志物的编码序列。该细胞还包含能够切割靶位点的核酸酶，并且任选地，能够在切割的位点处同源重组的供体dna分子，从而使宿主细胞中的同源重组导致供体线性核酸在靶位点处整合。通过环状染色体外核酸上选择性标志物的存在来鉴定转化细胞。供体dna对于宿主细胞而言通常是异源性的并且侧接核苷酸序列，所述核苷酸序列与侧接靶位点的基因组序列具有同源性。在一些实施方式中，供体dna分子在5'末端包含同源序列，其与选定基因组靶位点的5'区具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同源性。在一些实施方式中，供体dna分子在3'末端包含同源序列，其与选定基因组靶位点的3'区具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同源性。在一些情况中，侧接供体dna分子的同源序列各自包含约50-约1500个核苷酸。供体dna分子包含任何感兴趣的核酸。例如，供体dna分子包含可以被敲入宿主基因组的感兴趣的基因。在其他实施方式中，供体dna分子作为敲除构建体，其能够在将构建体整合至宿主细胞基因组靶位点时特异性地破坏靶基因，从而使得破坏的基因不具有功能性。感兴趣的核酸的示例包括但不限于，蛋白质编码序列，启动子，增强子，终止子，转录激活子，转录阻遏子，转录激活子结合位点，转录阻遏子结合位点，内含子，外显子，聚-a尾，多个克隆位点，核定位信号，mrna稳定信号，整合基因座，表位标签编码序列，降解信号或任何其他天然存在的或合成的dna分子。在特定的实施方式中，感兴趣的核酸不包含编码选择性标志物的核酸。宿主细胞中的nhej活性可以通过多种方式破坏。通常，破坏涉及细胞nhej活性的基因座。例如，可以破坏yku70基因座，因此降低细胞中的nhej活性。在一些情况中，通过在yku70基因座插入或整合编码rna引导的内切核酸酶的核酸来破坏yku70基因座。相较于在控制细胞中nhej的基因中不具有破坏的克鲁维酵母细胞，nhej活性降低可以是降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或减少这些百分比之间的任何百分比。在一些实施方式中，通过将编码内切核酸酶的核酸引入宿主细胞来提供rna引导的dna内切核酸酶。例如，可以将包含编码rna引导的dna内切核酸酶的核酸和本发明的稳定元件的质粒或载体引入细胞。在一些实施方式中，质粒可以还包含编码选择性标志物的核酸序列用于在宿主细胞中维持质粒。在一些实施方式中，编码内切核酸酶的核酸还包含启动子序列。在一些实施方式中，将编码rna引导的dna内切核酸酶的核酸整合到宿主细胞的基因组中。在某些实施方式中，将rna引导的dna内切核酸酶，例如，cas9，整合到克鲁维酵母宿主细胞的yku70基因中，从而降低酵母细胞中的nhej活性。在一些实施方式中，编码rna引导的dna内切核酸酶的核酸在组成型启动子的控制之下。在一些实施方式中，可以在引入第一和第二线性核酸之前，同时或之后将rna引导的dna内切核酸酶引入宿主细胞。在其他实施方式中，可以在引入第一线性核酸，第二线性核酸和供体dna分子之前，同时或之后将rna引导的dna内切核酸酶引入宿主细胞。在一些实施方式中，第一线性核酸包含能够彼此同源重组的两个内部同源序列，从而内部同源序列的同源重组导致环状染色体外核酸的形成，所述环状染色体外核酸包含本发明的稳定元件并表达选择性标志物。一旦经环化，染色体外核酸包括选择性标志物的编码序列，以及使能够在宿主细胞中表达标志物的合适的调节序列，诸如启动子和/或终止子。在环状染色体外核酸上提供选择性标志物可以无标志物整合一个或多个供体dna分子到宿主细胞基因组中，同时避免整合无关序列(即，选择性标志物)到基因组中以及与标志物表达延长相关的任何有害影响。在一些实施方式中，本发明的方法提供了无标志物回收包含成功整合的供体核酸的转化宿主细胞。这类细胞以每1000、900、800、700、600、500、400、300、200或100个经筛选的接触的宿主细胞或其克隆群体中约一个的频率出现。在具体实施方式中，无标志物回收包含成功整合的供体核酸的转化宿主细胞以每90、80、70、60、50、40、30、20或10个经筛选的接触的宿主细胞或其克隆群体中约一个的频率出现。在更具体实施方式中，无标志物回收包含成功整合的供体核酸的转化的细胞以每9、8、7、6、5、4、3或2个经筛选的接触的宿主细胞或其克隆群体中约一个的频率出现。有多种方法能够用于在不使用选择性标志物的情况下鉴定在靶位点处或附近具有基因组改变的细胞。在一些实施方式中，这类方法试图检测靶位点中的任何改变，并且包括但不限于，pcr方法，测序方法，核酸酶消化，例如，限制性作图，southern印迹及其任何组合。表型读数，例如，预测的功能获得或丧失，也可以用作实现预期基因组修饰的替代。在一些实施方式中，包含选择性标志物的第一线性核酸能够与编码例如一个或多个grna的第二线性核酸重组。在引入第一和第二线性核酸之后，第一和第二线性核酸经历同源重组以形成包含选择性标志物和一个或多个grna编码序列的环状，游离型或染色体外核酸。形成包含选择性标志物和grna编码序列的染色体外核酸后，由染色体外核酸转录出grna并将宿主细胞中表达的rna引导的dna内切核酸酶引导至宿主细胞基因组中的靶位点，其中内切核酸酶在靶位点处产生断裂。在一般实施方式中，本发明的方法可以用于将多种(即，两种或更多种)供体dna分子整合到宿主细胞基因组的多个靶位点。在这些实施方式中，克鲁维酵母宿主细胞与第一线性核酸和两种或更多种第二线性核酸分子接触，其中第二线性核酸分子各自包含编码不同grna的核酸，所述grna靶向宿主细胞基因组中的不同位点。不同的第二线性核酸可以各自与第一线性核酸重组以在宿主细胞中形成两种或更多种不同的环状染色体外核酸。应当理解的是，术语“第一线性核酸”和“第二线性核酸”包括相同核酸分子的多份拷贝。例如，宿主细胞可以与两种或更多种第二线性核酸分子接触，其中第二线性核酸分子各自包含编码不同grna的核酸以靶向宿主细胞基因组中2、3、4、5、6、7或更多个不同位点。在一些实施方式中，一旦grna将rna引导的内切核酸酶引导至两个或更多个靶位点，那么内切核酸酶在两个或多个靶位点处产生断裂并且两种或更多种供体dna分子经由同源重组整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，包含选择性标志物的第一线性核酸是包含同源侧接序列对的缺口载体，该同源侧接序列对与侧接第二线性核酸中grna盒的同源序列对重组以形成较大的环状载体，其中已经通过将第二线性核酸插入缺口载体中修复了缺口。在一些实施方式中，第一核酸中同源侧接序列对的同源侧接序列各自包含重组区域，该重组区域包含具有足够长度和序列相同性的核苷酸序列，其允许与第二线性核酸中同源侧接序列对进行同源重组，但是不与参与体内组装的第一或第二线性核酸的其他区域以及宿主细胞的任何基因组区域进行同源重组。对于经由缺口修复体内组装标志物/grna载体以及选择能够同源重组和缺口修复的细胞，参见，例如horwitz等(cellsystems1:88-96(2015))和wo2015/095804，其各自通过引用其全部内容纳入本文。在一些实施方式中，将grna在环状染色体外核酸(即，质粒)上引入细胞中，所述环状染色体外核酸不是通过线性核酸分子的同源重组形成。在这些实施方式中，质粒包含本发明的稳定元件。例如，这些实施方式用于需要整合单个供体dna分子时。相较于常规crispr/cas系统，使用本文所提供的方法可以惊人的高效率修饰宿主细胞基因组中的一个或多个靶位点。细胞群中改变的效率可以是至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％或更高或这些百分比之间的任何百分比。如通篇所用，向导rna(grna)序列是与rna引导的dna内切核酸酶相互作用并与细胞基因组内靶核酸特异性结合或杂交的序列，从而grna和靶向的核酸酶共同定位于细胞基因组中的靶核酸。grna各自包括长度约为10至50个核苷酸的dna靶向序列，其与基因组中靶dna序列特异性结合或杂交。例如，dna靶向序列的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。grna各自包含与rna引导的dna内切核酸酶结合的grna支架序列，所述rna引导的dna内切核酸酶不包含dna靶向序列。在一些实施方式中，grna包含crrna序列和反式激活crrna(tracrrna)序列。在一些实施方式中，grna不包含tracrrna序列。通常，将dna靶向序列设计为与靶dna序列互补(例如，完美互补)或基本上互补。在某些情况中，dna靶向序列可以纳入摆动或简并碱基以结合多个遗传元件。在一些情况中，结合区3'或5'端的19个核苷酸与一个或多个靶遗传元件完美互补。在一些情况中，可以改变结合区以增加稳定性。例如，可以纳入非天然核苷酸以增加rna对降解的抗性。在一些情况中，可以改变或设计结合区，以避免或减少结合区中二级结构的形成。在一些情况中，可以设计结合区以优化g-c含量。在一些情况中，g-c含量以约40％至约60％(例如40％、45％、50％、55％、60％)为佳。本文提供的方法可以使用任何rna引导的dna内切核酸酶。在一些实施方式中，rna引导的dna内切核酸酶是激活的cas9内切核酸酶，从而在与靶核酸结合作为与grna的复合物的部分时将双链断裂引入靶核酸中。在一些实施方式中，双链断裂通过hdr修复以将供体dna分子插入宿主细胞的基因组中。本文所述方法可以使用多种cas9内切核酸酶。例如，可以利用这样的cas9核酸酶，所述cas9核酸酶需要紧邻grna靶向的区域3'的ngg原型间隔子邻近基序(protospaceradjacentmotif，pam)。又例如，具有正交pam基序需求的cas9蛋白可以用于靶向不具有邻近nggpam序列的序列。具有正交pam序列特异性的示例性cas9蛋白包括但不限于在esvelt等(naturemethods10:1116–1121(2013))中所述的那些。在一些情况中，cas9蛋白是切口酶，因此在与靶核酸结合作为与grna的复合物的部分时将单链断裂或切口引入靶核酸。各自结合不同grna的一对cas9切口酶可以靶向靶基因组区域的2个近端位点，并因此将一对近端单链断裂引入靶基因组区域。切口酶对可以提供增强的特异性，因为脱靶作用有可能导致单一切口，这通常通过碱基切除修复机制在无损伤的情况下修复。示例性cas9切口酶包含具有d10a或h840a突变的cas9核酸酶(参见例如，ran等“通过rna引导的crisprcas9的双切口用于增强基因组编辑特异性(doublenickingbyrna-guidedcrisprcas9forenhancedgenomeeditingspecificity),”cell154(6):1380-1389(2013))。7.2.位点特异性核酸酶在一些实施方式中，修饰靶位点包括使用染色体外dna分子的方法，所述染色体外dna分子包含本发明的稳定元件以及一种或多种编码核酸酶的核酸序列，如wo2012/149470中所述，其通过引用纳入本文。在这些方法中，将供体dna分子引入克鲁维酵母宿主细胞中，其中供体dna包含第一同源区和第二同源区侧接的感兴趣的核酸。第一和第二同源区分别与基因组靶位点的5'和3'区享有同源性。还将染色体外dna引入宿主细胞，所述染色体外dna包含本发明的稳定元件以及编码位点特异性核酸酶的核酸序列。核酸酶能够识别和切割靶位点内的独特识别序列(也称之为着陆坪(landingpad))。通过位点特异性核酸酶诱导靶位点内的双链断裂后，相较于不包含双链断裂的靶位点，内源性同源重组机制以更高的频率在切割的靶位点整合感兴趣的核酸。整合频率的这种增加消除了对于共整合选择性标志物以选择经历重组事件的转化体的需要。有多种方法能够用于在不使用选择性标志物的情况下鉴定在靶位点处或附近具有基因组改变的细胞。在一些实施方式中，这类方法试图检测靶位点中的任何改变，并且包括但不限于，pcr方法，测序方法，核酸酶消化，例如，限制性作图，southern印迹及其任何组合。本发明的方法可以用于使用多种位点特异性核酸酶同时基因组整合多个感兴趣的外源性核酸。例如，这些方法允许在单个酶促途径中同时整合多个基因。如在上述关于缺口修复实施方式的情况中，供体dna分子可以包含任何感兴趣的核酸。例如，供体dna分子可包含可以被敲入宿主基因组的感兴趣的基因。在其他实施方式中，供体dna分子作为敲除构建体，其能够在将构建体整合至宿主细胞基因组靶位点时特异性地破坏靶基因，从而使得破坏的基因不具有功能性。感兴趣的核酸的示例包括但不限于，蛋白质编码序列，启动子，增强子，终止子，转录激活子，转录阻遏子，转录激活子结合位点，转录阻遏子结合位点，内含子，外显子，聚-a尾，多个克隆位点，核定位信号，mrna稳定信号，整合基因座，表位标签编码序列，降解信号或任何其他天然存在的或合成的dna分子。在特定的实施方式中，感兴趣的核酸不包含编码选择性标志物的核酸。如上所述，选定靶位点处的双链断裂由位点特异性内切核酸酶诱导，例如，位点特异性重组酶，转座酶，拓扑异构酶和锌指核酸酶，并且包括其修饰的衍生物，变体和片段。核酸酶切割双链断裂诱导剂特异性识别和/或结合的识别序列处的靶位点。识别序列的长度可以变化并且包括例如长度为至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多个核苷酸的序列。在一些实施方式中，识别序列是回文序列，即一条链上的序列与在互补链上以相反方向读取的序列相同。在一些实施方式中，切口/切割位点在识别序列内。在其他实施方式中，切口/切割位点在识别序列外。在一些实施方式中，切割产生钝端末端。在其他实施方式中，切割产生单链突出端，即“粘性端”，其可以是5'突出端或3'突出端。所选靶位点内的识别序列对于宿主细胞基因组可以是内源的或外源的。当识别位点对于宿主细胞基因组是外源时，可以通过本领域技术人员已知的任何方式将其引入宿主细胞基因组中。例如，可以使用上述的缺口修复方法引入识别序列。识别序列通常通过天然产生的双链断裂诱导剂识别。或者，识别位点可以被修饰的或工程改造的双链断裂诱导剂识别和/或结合，所述修饰的或工程改造的双链断裂诱导剂被设计成或被选择为特异性识别识别序列以产生双链断裂。在一些实施方式中，修饰的双链断裂诱导剂衍生自原始天然存在的双链断裂诱导剂。在其他实施方式中，修饰的双链断裂诱导剂是人工产生或合成的。用于选择这类修饰的或工程改造的双链断裂诱导剂的方法为本领域已知。例如，可以通过dna中的突变来制备一种或多种蛋白质的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法包括，例如，kunkel,(1985)procnatlacadsciusa82:488-92；kunkel,等,(1987)methenzymol154:367-82；美国专利号4,873,192；walker和gaastra,编著(1983)《分子生物学技术》(techniquesinmolecularbiology)(麦克米兰出版公司(macmillanpublishingcompany),纽约)以及其中引用的参考文献。有关不太可能影响蛋白质生物学活性的氨基酸取代的指南存在于例如dayhoff,等,(1978)《蛋白质序列和结构图册》(atlasofproteinsequenceandstructure)(国家生物医学研究基金会(natlbiomedresfound),华盛顿特区华盛顿)的模型中。可以优选保守取代，如用具有相似特性的另一氨基酸替换一种氨基酸。保守缺失、插入和氨基酸取代预期将不会对蛋白质特性产生根本性改变，并且任何取代、缺失、插入或其组合的作用都可以通过常规筛选试验进行评估。用于双链断裂诱导活性的试验是已知的，并且通常测量试剂对包含识别位点的dna底物的总体活性和特异性。能够用于本发明的内切核酸酶包括归巢内切核酸酶，其与限制性内切核酸酶类似，在特定识别序列处结合和切割。然而，用于归巢内切核酸酶的识别位点通常更长，例如，约18bp或更多。归巢内切核酸酶，也称为兆核酸酶，是本领域技术人员众所周知的，并且基于保守的序列基序已被分为以下家族：laglidadg归巢内切核酸酶，hnh归巢内切核酸酶，his-cys盒归巢内切核酸酶，giy-yig归巢内切核酸酶和蓝细菌归巢内切核酸酶。能够用于本发明的归巢内切核酸酶的示例包括但不限于：h-drel，i-seel，i-sceii，i-sceiii，i-sceiv，i-scev，i-seevi，iscevii，i-ceul，i-ceuaiip，i-crel，i-crepsbip，i-crepsbiip，i-crepsbiiip，i-crepsbivp，i-tlil，i-ppol，pi-pspl，f-scel，f-sceii，f-suvl，f-cphl，f-tevl，f-tevii，i-amal，i-anil，i-chul，icmoel，i-cpai，i-cpaii，i-csml，i-cvul，i-cvuaip，i-ddil，i-ddiii，i-dirl，i-dmol，i-hmul，ihmuii，i-hsnip，i-llai，i-msol，i-naal，i-nanl，i-nclip，i-ngrip，i-niti，i-njai，i-nsp236ip，ipakl，i-pboip，i-pcuip，i-pcuai，i-pcuvi，i-pgrip，i-pobip，i-porl，i-poriip，i-pbpip，ispbetaip，i-seal，i-sexip，i-sneip，i-spoml，i-spomcp，i-spomip，i-spomiip，i-squip，issp68031，i-sthphijp，i-sthphist3p，i-sthphiste3bp，i-tdeip，i-tevl，i-tevii，i-teviii，iuarap，i-uarhgpaip，i-uarhgpa13p，i-vinip，i-zbiip，pi-mgai，pi-mtul，pi-mtuhip，pimtuhiip，pi-pfui，pi-pfuii，pi-pkoi，pi-pkoii，pi-rma43812ip，pi-spbetaip，pi-seel，pi-tful，pi-tfuii，pi-thyi，pi-tlil或pi-tliii，或其任何变体或衍生物。在一些实施方式中，核酸酶是tal-效应物dna结合结构域-核酸酶融合体(talen)。黄单胞菌属(genusxanthomonas)中植物病原菌的tal效应物通过结合宿主dna并激活效应物特异性宿主基因在疾病或触发防御机制中发挥重要作用。tal-效应物dna结合结构域可以经工程改造以结合所需靶序列，并融合核酸酶结构域，例如，来自ii型限制性内切核酸酶，通常是来自ii型限制性内切核酸酶如foki，hhai，hindiii，nod，bbvci，ecori，bgli和alwi的非特异性切割结构域。因此，在优选实施方式中，talen包含tal效应物结构域，其包含多个tal效应物重复序列，这些序列组合在一起结合靶dna序列中的特定核苷酸序列，从而使talen切割特定核苷酸序列内或邻近的靶dna。能够用于本文所提供的方法的talens包括述于wo10/079430和美国专利申请公开号2011/0145940中的那些。在一些实施方式中，核酸酶是位点特异性重组酶。位点特异性重组酶，也称为重组酶，是催化相容重组位点之间保守性位点特异性重组的多肽，并且包括天然多肽和保持活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。在一些实施方式中，重组酶是丝氨酸重组酶或酪氨酸重组酶。在一些实施方式中，重组酶来自整合酶或解离酶家族。在一些实施方式中，重组酶是选自下组的整合酶：flp、cre、λ整合酶和r。在一些实施方式中，核酸酶是转座酶。转座酶是介导转座子从基因组中一个位置转移到另一位置的多肽。转座酶通常诱导双链断裂以切除转座子，识别亚末端重复序列，并将切除的转座子末端聚集在一起，在一些系统中，还需要其他蛋白质将转座过程中的末端聚集在一起。转座子和转座酶的实例包括但不限于，来自玉米的ac/ds、dt/rdt、mu-m1/mn和spm(en)/dspm元件，来自金鱼草的tam元件，来自噬菌体的mu转座子，细菌转座子(tn)和插入序列(is)，酵母的ty元件(逆转录转座子)，来自拟南芥(arabidopsis)的ta1元件(逆转录转座子)，来自果蝇(drosophila)的p元件转座子，来自果蝇的copia、mariner和minos元件，来自家蝇的hermes元件，来自粉纹夜蛾(trichplusiani)的piggyback元件，来自秀丽隐杆线虫(c.elegans)的tc1元件和来自小鼠的iap元件(逆转录转座子)。在一些实施方式中，核酸酶是锌指核酸酶(zfn)。zfn是经过工程改造的双链断裂诱导剂，其包含锌指dna结合结构域和双链断裂诱导剂结构域。工程改造的zfn由两个锌指阵列(zfa)组成，其各自与非特异性内切核酸酶的单个亚基融合，诸如来自foki酶的核酸酶结构域，其在二聚化时变得有活性。7.3.细胞培养使用本领域技术人员所熟知的方法培养克鲁维酵母宿主细胞。如果使用选择性标志物，将细胞培养足以由环化染色体外载体表达选择性标志物的一段时间段。在选择性标志物是抗药性标志物的一些实施方式中，进行足以产生一定量的标志物蛋白质的一段时间段培养，所述一定量标志物蛋白质可以支持表达标志物的细胞在可选择养基中的存活。在某些实施方式中，这些条件还针对不表达选择性标志物的细胞的存活进行选择。可以使用本领域技术人员已知的多种化合物或处理将选择性压力施加于细胞。例如，可以通过将宿主细胞暴露于对于生长，细胞周期的进展或活力而言次优或有害的条件下来施加选择性压力，从而选择对这些条件耐受或具有抗性的细胞，用于比较对于这些条件不耐受或不具有抗性的细胞。可用于运用或施加选择性压力的条件包括但不限于，抗生素，药物，诱变剂，减缓或停止细胞生长或生物构建区块(buildingblock)合成的化合物，破坏rna、dna或蛋白质合成的化合物，从细胞生长或培养基剥夺或限制对于细胞生长和活力所需的营养物、氨基酸、碳水化合物或化合物，在对细胞生长次优的条件下，例如在次优温度，大气条件(例如，二氧化碳、氧气或氮气％或湿度)或缺乏型培养基条件下进行的处理，诸如细胞的生长或维持。所用选择性压力的水平可以通过本领域技术人员确定。例如，这可以通过进行杀伤曲线实验来完成，其中对照细胞和包含抗性标志物或基因的细胞用增加水平、剂量、浓度或处理的选择性压力检测，而针对阴性细胞选择的范围仅或优先在所需的时间范围内(例如，1至24小时，1至3天，3至5天，4至7天，5至14天，1至3周，2至6周)。可以使用的选择性压力的确切水平、浓度、剂量或处理取决于所用细胞，所需特性本身，赋予对选择性压力的抗性或耐受性的标志物、因子或基因，以及所选细胞中所需要的所需特性的水平，并且本领域技术人员将容易理解如何基于这些考虑因素来确定合适的范围。培养可以在合适容器，包括但不限于细胞培养板、培养瓶或发酵罐中合适的培养基中进行。在一些实施方式中，培养基是包含可同化的碳、氮和磷酸盐/酯源的水性培养基。这类培养基还可以包括适当的盐，矿物质，金属和其他营养物。在一些实施方式中，除了选择试剂，合适的培养基还补充有一种或多种其他试剂，例如，诱导剂(例如，当编码基因产物的一种或多种核苷酸序列处于诱导型启动子的控制下)，阻遏剂(例如，当编码基因产物的一种或多种核苷酸序列处于阻抑型启动子的控制之下)。用于细胞培养物维持或生长的材料和方法为微生物学或发酵学领域的技术人员所熟知(参见，例如，bailey等,《生物化学工程基础》(biochemicalengineeringfundamentals),第二版,mcgrawhill出版社,纽约,1986)。取决于宿主细胞、发酵和工艺的具体要求，必须要考虑合适的培养基，ph，温度以及对有氧、微氧或厌氧条件的需求。在一些实施方式中，培养进行足以使转化的群体经历多次倍增的一段时间，直到达到所需的细胞密度。在一些实施方式中，培养进行一段时间，所述一段时间足以使宿主细胞群在进行培养的发酵罐或容器中达到0.01至400之间的细胞密度(od600)。在其他实施方式中，培养进行至少12、24、36、48、60、72、84、96或大于96小时的一段时间。在一些实施方式中，培养进行3至20天之间的一段时间。在一些实施方式中，培养进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或超过20天的一段时间。在本文所述方法的一些实施方式中，例如，一旦已经将选定的宿主细胞鉴定为包含所需基因组整合，所述方法还包括由宿主细胞消除环化的染色体外载体的步骤。基于质粒的系统通常需要对质粒施加选择性压力以将外来dna维持在细胞中。在一些实施方式中，通过使选定的细胞经历足够的有丝分裂分裂，从而使质粒有效地由群体稀释，可以实现由选定的细胞中消除编码选择性标志物的质粒。或者，可以通过选择质粒的不存在来选择无质粒的细胞，例如，通过针对计数器可选择(counter-selectable)标志物(例如，ura3)进行选择或通过将相同的集落在选择性培养基和非选择性培养基上来进行铺板，然后选择在选择性培养基上不生长但在非选择性培养基上生长的集落。7.4.宿主细胞本发明的方法可以用于修饰克鲁维酵母宿主细胞基因组中的一个或多个靶位点。宿主细胞可以是克鲁维酵母属中任何成员，包括例如，马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)，乳酸克鲁维酵母(klactis)，海泥克鲁维酵母(k.aestuarii)，阿氏克鲁维酵母(k.africanus)，杆孢克鲁维酵母(k.bacillisporus)，蟑螂克鲁维酵母(k.blattae)，多勃赞斯基克鲁维酵母(k.dobzhanskii)，湖北克鲁维酵母(k.hubeiensis)，罗德瑞克鲁维酵母(k.lodderae)，非发酵克鲁维酵母(k.nonfermentans)，云杉克鲁维酵母(k.piceae)，虫草克鲁维酵母(k.sinensis)，耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)，瓦特克鲁维酵母(k.waltii)，魏氏克鲁维酵母(k.wickerhamii)和耶氏克鲁维酵母(k.yarrowii)。7.5.产生感兴趣的产物的方法如上所述，供体dna可以用于将任何所需的核酸序列整合到克鲁维酵母宿主细胞的基因组中。因此，本发明的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养包含一种或多种感兴趣的整合供体dna分子的宿主细胞，所述整合供体dna分子编码一种或多种感兴趣的蛋白质，和回收通过宿主细胞产生的蛋白质。用于由细胞培养物制备纯化的蛋白质的方法为本领域技术人员所熟知。在一些实施方式中，感兴趣的蛋白质是选自下组的蛋白质：抗体，酶，激素，生长因子，抗凝血剂，血液因子，工程改造的蛋白，干扰素，白介素，溶解血栓剂，病毒蛋白或细菌蛋白。在一些实施方式中，一种或多种分泌信号序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种分泌信号序列)可以插入供体dna分子。分泌信号序列编码宿主细胞分子机制所识别的分泌信号肽，然后由细胞中分泌蛋白质。分泌信号肽的选择可能取决于宿主细胞的类型。在一些实施方式中，可以根据宿主细胞的密码子频率对编码感兴趣多肽的一种或多种核酸序列进行密码子优化。使用在宿主细胞中具有最高出现频率的密码子可以减少不需要的突变并提高翻译效率。供体dna分子也可包括本领域已知合适的表达控制元件，包括本领域技术人员所熟知的启动子、增强子、选择性标志物和转录终止子。用于表达治疗性蛋白质的方法为本领域所知。参见例如，paulinabalbas,argelialorence(编著)《重组基因表达：综述和方案(分子生物学方法)》(recombinantgeneexpression:reviewsandprotocols(methodsinmolecularbiology)),胡马纳出版社(humanapress)；第二版2004版(2004年7月20日)；vladimirvoynov和justina.caravella(编著)《疗性蛋白质：方法和方案(分子生物学中的方法)》(therapeuticproteins:methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology))胡马纳出版社；第二版2012版本(2012年6月28日)。本文所述的方法和组合物还能够用于在宿主细胞基因组中引入多种修饰，并因此为构建包含优化的生物合成途径的重组生物体提供了特别的优势，例如，针对生物质向生物燃料、药物或生物材料的转化。已在微生物宿主中成功构建了功能性非天然生物途径，以生产许多有价值的产物，包括抗疟疾药物青蒿素的前体，脂肪酸衍生的燃料和化学制品(例如，脂肪族酯，脂肪醇和蜡)，卤代甲烷衍生的燃料和化学制品，制备降低胆固醇的药物的聚酮化合物合酶，和聚酮化合物。在此公开了可用于在此公开的方法和组合物、可与在此公开的方法和组合物联用、可用于制备在此公开的方法和组合物，或者是在此公开的方法和组合物的产物的材料、组合物以及组分。本文公开了以上及其他材料，应理解的是，在公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，既便没有明确具体指向这些化合物的多种个体或各别组合和集合性组合以及排列组合中的每一种，这每一种都是本文所具体涵盖和具体描述的。例如，如果公开和论述了一种方法，并且论述了可对该方法中一个或多个分子实施的多种改变，则于是具体涵盖了所述改变的和所述方法的每一种和所有可能的组合与排列，除非特别说明并非如此。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。这一概念适用于本申请所有方面的内容，包括但不限于采用本文所述组合物的方法的步骤。这样，如果有多种可执行的其他步骤，则应认为，这些其他步骤中的每一个都可与本文所述方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合联合执行，并且就此具体涵盖并视为公开了此类组合或组合子集中的每一个。8.实施例18.1.材料和方法8.1.1.制备马克斯克鲁维酵母宿主菌株用于crispr-cas使用野生型马克斯克鲁维酵母菌株。酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9基因的酿酒酵母(s.cerevisiae)密码子优化形式与sv40核定位序列融合，其经设计并克隆进入克隆进入整合盒(在酿酒酵母tef1启动子表达下，带cyc1终止子)(horwitz等,2015,cellsystems(1):88-96；dicarlo等2013,nucleicacidsres201341(7)4336-43)；参见序列表)。用hpha(潮霉素抗性)盒标记的构建体稳定地整合到野生型马克斯克鲁维酵母菌株的yyku70基因座处。该整合构建体含有核酸序列seqidno:23。yyku70基因座处的正确整合通过集落pcr反应验证。8.1.2.构建用于克鲁维酵母的稳定质粒制备用于复制和/或表达grna或核酸酶的新稳定质粒。新稳定质粒包含马克斯克鲁维酵母特异性稳定元件，其包含着丝粒序列(cen)和自主复制共有序列(ars)。质粒pam028包含seqidno:1中所示cen/ars序列。质粒pam029包含seqidno:4中所示cen/ars序列。图1所示“旧pkd1元件质粒”含有来自pkd1质粒的pkd1稳定元件(chen,wesolowski-louvel等,jbasicmicrobiol28(4):211-220,1988)，而非seqidno:1或4中所示cen/ars序列。使用同源重组，将稳定元件(包含seqidno：1中所示的ars/cen序列)克隆到线性化载体中，该线性化载体包含驱动rna表达的启动子，终止子，嵌合grna序列，复制起点，细菌和酵母抗生素选择标志物。该质粒称为马克斯克鲁维酵母grna进入载体(序列示于seqidno：21)。一旦创建并验证了该质粒，就将其用于生成稳定质粒用于兆核酸酶表达(序列示于seqidno：22)。使用马克斯克鲁维酵母cen/ars，复制起点，细菌和酵母抗生素选择标志物通过pcr生成质粒的线性形式。还将含有f-cphi开放阅读框，启动子和终止子的pcr产物扩增并克隆到上述线性片段中。8.1.3.向导rna表达盒cas9蛋白通过与通用结构rna和特异性靶向rna结合而靶向切割位点。采用标准“嵌合”构型，其中靶向rna和结构rna融合，以产生单个grna。grna构建体的表达通过snr52聚合酶iii启动子驱动，具有sup4终止子。使用马克斯克鲁维酵母染色体vcen/ars元件通过缺口修复直接进入表达cas9的宿主菌株将grna盒克隆到低拷贝稳定载体中(orr-weaver等，1983)。用于grna进入的低拷贝稳定载体具有示于seqidno:21中的序列。为了将一种或多种grna盒直接缺口修复到宿主菌株的表达载体中，我们首先生成了全长grna盒(具有对于线性化载体的500bp侧翼同源性)。在某些实施方式中，我们使用包含grna盒的单一或多种dna片段共转化宿主细胞(用于多重化)，所述grna盒对线性质粒具有侧翼同源性。8.1.4.选择靶位点和供体dna的生成基于pam序列n(19)ngg的存在，鉴定靶向的开放阅读框(orf)内部的候选crispr靶位点。将下述基因组基因座选为靶位点：ndt80、yku80、gas2、gal80和leu2。这些靶位点的grna序列以seqidno:15-20示出。使用用于组装的标准化接头生成了具有500bp侧翼同源性的供体dna构建体，如美国专利号8,110,360中所述，通过引用其全部内容纳入本文。还参见，horwitz等2015。8.1.5.无标志物dna的基因组整合和马克斯克鲁维酵母转化方案我们所开发的马克斯克鲁维酵母转化方案是针对这些菌株所改进的gietz等2007(natprotoc2:31-34)的变体。琼脂平板上生长1-2天后，采集单个集落并用于接种3ml富含液体的培养基(例如，ypd)。该液体培养物在摇动下生长过夜，然后第二天早晨稀释到新鲜培养基中，od为0.05-0.2。摇动孵育下使稀释的培养物生长直到od达到0.6-0.9，经历至少两次倍增。各转化收获5ml培养物，离心以沉淀细胞(7000xg，2分钟)，然后重悬于等体积的无菌水中。重复离心，并将细胞重悬于100mm乙酸锂中。重复离心最后一次，并将细胞重悬于100mm乙酸锂中，以比原始体积低250倍的体积(例如，对于5ml的原始体积为20μl)。向各转化添加240μl的50％peg溶液，36μl的1.5m乙酸锂，10μl煮沸的鲑鱼精子dna，54μl与水混合的转化dna和20μl细胞混合物。将转化混合物短暂地涡旋以均匀分布细胞和试剂，然后在30℃孵育30分钟，然后在42℃孵育40分钟。热激后，将转化混合物以较低速度(3000xg，2分钟)再次离心，然后吸取peg悬浮液并将细胞沉淀重悬于2ml富含液体的培养基中。然后将该培养物在摇动下孵育过夜，然后铺板到选择培养基上。使用集落pcr确认各无标志物整合。8.2.结果和讨论8.2.1.使用crispr-cas在克鲁维酵母中建立高效率高通量整合能够用于马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus，km)遗传工程改造的分子生物学工具并不如能够用于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae，sc)的那些那样稳健。目前，文献中仅公开了一篇关于依赖于随机突变的在马克斯克鲁维酵母中使用crispr进行敲除的报道。(参见等crispr-cas9激活的遗传破坏用于了解马克斯克鲁维酵母中乙醇和乙酸乙酯的生物合成(crispr-cas9-enabledgeneticdisruptionsforunderstandingethanolandethylacetatebiosynthesisinkluyveromycesmarxianus).2017.biotechnologyforbiofuels)。如果要在马克斯克鲁维酵母中实现无标志物多重工程改造，高通量方法将需要更高的无标志物敲除/整合率。如本文所用，术语“无标志物(marker-less)”指在没有同时整合选择性标志物的情况下将供体dna整合到宿主细胞基因组内的靶位点中。在一些实施方式中，该术语还指在不利用依赖于将选择性标志物整合到宿主细胞基因组中的选择方案的情况下回收这类宿主细胞。例如，在某些实施方式中，可以利用附加型或染色体外选择标志物选择包含质粒的细胞，所述质粒编码能够切割基因组靶位点的核酸酶。只要选择性标志物没有被整合到宿主细胞基因组中，这类应用就被认为是“无标志物”。获得更高转化效率的第一步骤是构建更稳定的质粒。之前，在马克斯克鲁维酵母中使用了含有来自乳酸克鲁维酵母(k.lactis)的pkd1元件的质粒，并获得了转化体，但该质粒不稳定(图1，右上)。使用该质粒转化的集落显示出集落扇状化的迹象，因为当质粒以高频丢失时会形成带有粗糙边缘的小集落。制备两种新质粒pam028和pam029，其含有马克斯克鲁维酵母特异性cen/ars序列(分别为seqidno：1和seqidno：4)(图1，左上和右下)。将cen/ars序列纳入以生成稳定的质粒。使用这些质粒转化的集落大、圆且光滑，这表明抗生素抗性盒的稳定表达。另外，可以由这些集落中回收质粒，这表明新质粒得以保留且不被整合。通过经由nhej减少或消除基因组双链断裂修复，实现了高基因组整合效率的第二步骤。nhej依赖于yku复合物(yku70和yku80蛋白的异二聚体)和dna连接酶。通过使yku70缺失，nhej的水平大大降低。通过同源重组实现了质粒的“缺口修复”。(参见图2)。当多个重叠的线性片段生成完整的，可选择的环状载体时，质粒缺口修复发生(参见wo2015/095804，通过引用将其纳入本文)。稳定的质粒和nhej的消除共同在马克斯克鲁维酵母中导致使用crispr-cas的首次高效无标志物整合。在这个实施例中，将三个组分用于使用crispr-cas的高效靶向整合或缺失：表达的cas9蛋白，对靶基因座具有特异性的grna和用于修复诱导的双链断裂的供体dna。将用于cas9表达的构建体在先整合到马克斯克鲁维酵母菌株中，破坏yku70基因座。使用酿酒酵母psnr52启动子和sup4终止子，由nat标记的马克斯克鲁维酵母质粒表达嵌合grna。(参见horwitz等,2015,cellsystems,(1)88-96)。供体dna以线性mssi消化的片段提供，其具有，侧接gfp表达构建体的500bp的gal80上游和下游同源性。当不提供供体dna时，没有回收集落。当提供供体dna时，生长许多集落。(数据未示出)。该表型指示单个位置(gal80)处的grna表达诱导的双链断裂通过使用提供的供体dna构建体的同源重组修复。gal80处无标志物整合的24个集落的cpcr显示，在24个集落中，有22个集落在靶位点正确地整合了供体dna。换言之，通过cpcr测试的集落中有92％在gal80开放阅读框(orf)处成功整合了gfp序列。8.2.2.马克斯克鲁维酵母宿主细胞中crispr介导的多重无标记同时基因组整合鉴定了在马克斯克鲁维酵母中使用crispr-cas系统实现高效，无标志物整合的几个新基因座的grna：ndt80、yku80、gas2、leu2和gal80。使用与上述相同的基本方案进行了96孔转化。将pcr生成的线性grna盒与pcr生成的线性选择性标志物标记的马克斯克鲁维酵母载体共转化。通过集落pcr(cpcr)验证了各种类型的1基因座和2基因座整合的24个集落和各种类型的3基因座整合的32个集落。所有尝试的基因座的成功整合率在一个基因座为94％，在两个基因座为34％，在三个基因座为7％。通过集落pcr筛选368个集落。在筛选的这些集落中，小部分的情况(约5％)中，在凝胶上未观测到pcr片段条带，并且未将这些集落包括在整合效率的计算中。表1：8.2.3.使用兆核酸酶在克鲁维酵母中高效多重整合crispr-cas系统可为基因的多重插入或缺失提供高效方法。然而，各基因座都需要独特的grna，随着靶基因座数量的增加，各次转化所需的组件的数量也随之增加。f-cphi是切割特定24bp识别序列(“着陆坪”)的兆核酸酶。该序列可以插入基因组中的多个位置。然后对表达f-cphi的单个质粒的转化和选择会导致所有识别位点处的双链断裂，然后通过含有同源末端的供体dna修复这些断裂。构建表达f-cphi的马克斯克鲁维酵母质粒，并在多种马克斯克鲁维酵母菌株中进行测试。该质粒已经显示出有助于切除具有序列重复的切割位点所侧接的抗生素抗性盒并在预先构建的菌株的1、2和3个基因座处整合基因。在所有情况中，都以高效率获得了所需的基因型，并且随着同时工程改造更多的基因座，集落数量减少。对于抗生素抗性盒的切除，100％测试的集落成功地去除了盒。相似地，100％测试的单着陆坪集落，96％双着陆坪集落和20％三着陆坪集落整合了所需的dna。三着陆坪菌株产生的集落很少(<15/转化)，并且整合效率的变化更大(16-100％，取决于转化)。表2：8.2.4.克鲁维酵母中sc密码子优化的基因和启动子的相容性sc密码子优化的基因和启动子的相容性在克鲁维酵母中测试。使用sc密码子优化的核酸转化马克斯克鲁维酵母，所述sc密码子优化的核酸编码scpgal1/10双向启动子操作性连接的荧光蛋白。制备两种马克斯克鲁维酵母菌株，一种菌株具有scpgal1/10启动子驱动的gfp和rfp表达，而另一种菌株具有马克斯克鲁维酵母pgal1/10启动子驱动的gfp和rfp表达。将这些构建体整合到gal80基因座(使gal80orf缺失)，并在对数生长期间在tecan酶标仪中测量荧光。gfp和rfp以相似的水平存在，这表明在这种情况下，酿酒酵母密码子优化和pgal1/10启动子表达起作用。(数据未示出)。实施例部分中显示的结果说明克鲁维酵母是高度可工程化的，允许同时多重化基因组整合异源性核酸。相较于cho细胞约为19-24小时的倍增时间和约为3个月的总基因工程改造循环时间(从一次转化到下一次转化)，使用在本发明中所提供的新稳定质粒的克鲁维酵母的细胞群倍增时间约为2小时且总循环时间约为两周。本文所提供的组合物和方法使我们工程改造克鲁维酵母以生产新的生物分子的能力向前迈出了一大步。9.实施例2该实施例提供了使用表3中稳定元件的实验结果。使用实施例1中所用相同的菌株(称为菌株1)和第二野生型马克斯克鲁维酵母菌株(称为菌株2)，大体上如实施例1中所述进行实验。结果显示了使用三种cen/ars序列(cen/ars_2、3和5)成功的无标志物三重整合。使用cen/ars_2、3和5的三重整合率分别为3％、13％和3％(n＝30个测试集落中)。菌株1中的比率与实施例1中的比率相差无几。菌株2具有相似的三重整合率，但是并未概括cen/ars_1的原始数据。表39.1.材料和方法9.1.1.计算搜索其他cen/ars序列我们搜索了马克斯克鲁维酵母菌株基因组彼此之间4000bp之内的三个序列元件(cde1，cde2，ars)。允许各个序列错配，并且总同源性低至5bp。a/t核苷酸的百分比需要大于或等于60％。我们用该方法鉴定了4种染色体序列(cen/ars_1(seqidno:1)，cen/ars_2(seqidno:4)，cen/ars_3(seqidno:7)，和cen/ars_6(seqidno:10))。cen/ars_5发表在cernak和estrela，biorxivdoi:10.1101/353680。9.1.2.菌株、基因基因座，grna和供体dna使用含有cen/ars元件的grna载体转化野生型菌株1和2以证实cen/ars在维持质粒中的活性。对于crispr-cas工程改造，我们使用了与整合cas9的菌株进行单、双和三重整合。选择了三个马克斯克鲁维酵母基因座gas2、gal80和ndt80来测试crispr-cas工程改造的效率。它们对应的供体dna片段包含各基因的上游和下游序列，如果成功整合，将会导致基因敲除。各基因座的grna序列如下所示：gas2(seqidno:16)、gal80(seqidno:20)和ndt80(seqidno:19)。9.1.3.核酸的制备和转化由通过小规模制备的大肠杆菌培养物提取含有grna或供体dna的质粒。使用小规模制备的质粒作为模板，进行高保真pcr(phusion聚合酶，neb)以使用引物seqidno:24和seqidno:25(表4)扩增grna，并如上述8.1.4部分制备供体dna片段。通过pcr生成线性grna载体(表4中的引物seqidno:26和seqidno:27)，然后进行凝胶提取。如上述8.1.5部分所述进行转化。表49.2.结果9.2.1.具有新cen/ars元件的grna载体稳定性为了测试含有不同cen/ars元件的质粒的稳定性。我们用各自携带cen/ars的质粒转化了菌株1和菌株2。如上所述，我们还测试了携带pkd-1元件的质粒。具有cen/ars_1、cen/ars_2和cen/ars_5的质粒产生了大且圆的集落，并具有光滑边缘(图3)。另一方面，具有cen/ars_3，cen/ars_5和pkd1元件的质粒产生小且扇状化的集落，这表明维持质粒稳定性的活性较弱。此外，使用含有cen/ars_6的质粒转化并未在平板上显示出集落。这表明该计算预测的cen/ars序列可能没有实际活性。在两个菌株中都观测到了关于集落形状和大小的相似表型。9.2.2.马克斯克鲁维酵母中的crispr-cas无标志物多重转化选择了三个基因座gas2、ndt80和gal80用于crispr-cas介导的整合。96孔转化设置如图4和5所示。如图所示，菌株对照(无dna构建体)和质粒对照(仅载体骨架)显示了相对低的背景集落数，以及使用grna的转化，而非供体dna。随着同时整合的基因座数量增加，观测到更少的集落。此外，使用cen/ars_3转化会产生小且扇状化的集落，这与稳定性实验相符(图3)。与cen/ars_3相似，使用cen/ars_5载体的转化也显示出小且扇状化的集落(图5)。进行集落pcr以筛选各基因座处成功的整合。对于单一和双重整合，筛选了12个集落。由于整合率低，测试了30个集落的三重整合。cpcr筛选的结果示于图6和7。通常，观测到高比率成功的单一整合，范围在75％～100％之间，并且绝大多数单基因座整合率在90％以上。双重整合的阳性率通常为25％～58％。cen/ars_1、cen/ars_2、cen/ars_3、cen/ars_5都展示出成功的三重整合。cen/ars_3显示出最高的三重整合率，约为13％。根据稳定性测试(图3)和crispr-cas多重化的结果，认为cen/ars_3是在维持质粒稳定性中的弱元件。此处的结果表明，转化效率与质粒稳定性之间的关系可能更为复杂。除菌株1外，对于cen/ars_2，cen/ars_3和cen/ars_5，菌株2在所有三个基因座处的整合率为3％-7％。总之，我们已经证明，使用新cen/ars元件，我们能够在马克斯克鲁维酵母中实现同时多重整合。在不脱离本发明范围的情况下，可以将本文或附图中所述任何实施方式的一个或多个特征与本文或附图中所述任何其他实施方式的一个或多个特征组合。本说明书引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。非正式序列表:seqidno:1(cen/ars1)着丝粒dna元件(cde)用下划线标出。着丝粒序列(cen)以粗体显示。(seqidno:2)ars共有序列用标出。(seqidno:3)seqidno:4(cen/ars2)着丝粒dna元件(cde)用下划线标出。着丝粒序列(cen)以粗体显示。(seqidno:5)ars共有序列用标出。(seqidno:6)seqidno:7(cen/ars3)着丝粒dna元件(cde)用下划线标出。着丝粒序列(cen)以粗体显示。(seqidno:8)ars共有序列用标出。(seqidno:9)seqidno:10(cen/ars6着丝粒dna元件(cde)用下划线标出。着丝粒序列(cen)以粗体显示。(seqidno:11)ars共有序列用标出。(seqidno:12)seqidno:13(cen/ars4)gagctcctttcatttctgataaaagtaaggtttctctatttatcttttcacccacattatccttcgaagtacgtatacaatattagttcaacgtaaaaacaaaactt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