本发明涉及壳多糖分解酶组合物、壳多糖分解反应液以及糖的制造方法。
背景技术：
壳多糖在生物界中包含于昆虫、甲壳类的外骨架、菌类的细胞壁等中，推定其年生产量仅次于作为在地球上丰富存在的生物质的纤维素。因此，壳多糖作为仅次于纤维素的生物质资源而关注增加。
壳多糖是作为单糖的n-乙酰-d-葡糖胺结合而成的不溶性多糖，通过使用了作为壳多糖的分解酶(也称为“壳多糖分解酶”)的壳多糖酶的酶反应，水解为被低分子化了的壳多糖多糖(低分子化壳多糖多糖)、来源于壳多糖多糖的壳多糖寡糖、单糖(n-乙酰-d-葡糖胺)等。另外，这些水解物为壳多糖的酶反应中的生产物。
壳多糖的酶反应中的生产物具有优异的抗菌性、保湿性、生物适应性、安全性、螯合性等。因此，在医用材料、医药、化妆品、纤维、农业、水处理、食品等各领域中的利用受到期待，研究开发正在进行。
例如，在非专利文献1中记载了与使用了二氧化硅纳米粒子(snp)的壳多糖酶的酶活性有关的技术。具体而言，公开了在snp的表面将来源于苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的壳多糖酶(chi9602)通过静电吸附而固定化，制备纳米级壳多糖酶(snpc1)，使用制备出的snpc1测定了壳多糖酶的酶活性。另外，制备出的snpc1中的二氧化硅的固定化率为55％左右。
然而，snpc1的壳多糖酶活性相对于chi9602的壳多糖酶活性100％为43％左右，因此明确了通过二氧化硅的固定化而活性降低57％左右。即，表明在将壳多糖酶固定化于二氧化硅的反应体系中，虽然能够制造糖，但抑制酶活性而糖化反应效率降低，在使用该反应体系时，需要解决这样的问题。此外，从成本性的观点考虑，不期望复杂的反应体系。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：x.qinetal.，internationaljournalofbiologicalmacromolecules，vol.82，2016，p.13-p.21
技术实现要素：
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述情况而提出的，其目的是提供在使用了壳多糖分解酶的反应体系中应用了二氧化硅的情况下，能够通过简便的工序使采用壳多糖分解酶的糖化反应效率提高，并且实现生产物的高收率化的壳多糖分解酶组合物、壳多糖分解反应液以及糖的制造方法。
用于解决课题的方法
达成上述目的的本发明的第1方案是一种壳多糖分解酶组合物，其特征在于，含有：作为将壳多糖水解的壳多糖分解酶的壳多糖酶；二氧化硅或含有二氧化硅的物质；以及作为包含氮的杂环式化合物的含氮杂环式化合物。
本发明的第2方案是第1方案的壳多糖分解酶组合物，其特征在于，上述壳多糖酶至少含有壳多糖酶a。
本发明的第3方案是第1方案或第2方案的壳多糖分解酶组合物，其特征在于，上述含氮杂环式化合物为含氮五元杂环式化合物。
本发明的第4方案是第3方案的壳多糖分解酶组合物，其特征在于，上述含氮五元杂环式化合物为选自咪唑和2-甲基咪唑中的任1种。
达成上述目的的本发明的第5方案是一种壳多糖分解反应液，其特征在于，含有：壳多糖；以及第1方案～第4方案中的任一壳多糖分解酶组合物。
达成上述目的的本发明的第6方案是一种糖的制造方法，其特征在于，通过使用第5方案的壳多糖分解反应液将壳多糖水解来制造糖。
本发明的第7方案是第6方案的糖的制造方法，其特征在于，通过在搅拌下使用上述壳多糖分解反应液将壳多糖水解来制造糖。
发明的效果
根据本发明，可以提供在使用了壳多糖分解酶的反应体系中应用了二氧化硅的情况下，可以通过简便的工序使采用壳多糖分解酶的糖化反应效率提高，并且实现生产物的高收率化的壳多糖分解酶组合物、壳多糖分解反应液以及糖的制造方法。
具体实施方式
(壳多糖分解酶组合物)
本发明的壳多糖分解酶组合物在使用了作为壳多糖分解酶的壳多糖酶的酶反应中，使糖化反应效率提高而实现作为生产物的寡糖、n-乙酰-d-葡糖胺等的高收率化。以下，对本发明的壳多糖分解酶组合物进行详细说明。
本发明的壳多糖分解酶组合物为可以将作为底物的壳多糖水解的组合物，含有：壳多糖分解酶；二氧化硅或含有二氧化硅的物质；以及含氮杂环式化合物。
这里，作为底物的壳多糖，是多个n-乙酰-d-葡糖胺残基以β-1,4键结合而成的直线状的高分子氨基糖，是具有牢固的晶体结构的不溶性多糖。壳多糖具有下述式(1)所示的化学结构。
此外，壳多糖的脱乙酰化物被称为壳聚糖(chitosan，脱乙酰壳多糖)，具有下述式(2)所示的化学结构。
一般的壳多糖具有部分地失去了乙酰基的壳聚糖结构，另一方面，壳聚糖具有部分地具有乙酰基的壳多糖结构。因此，本发明中的壳多糖是也包含上述具有壳聚糖结构的壳多糖、具有壳多糖结构的壳聚糖的概念。此外，这样的壳多糖可以是以酶反应中的生产物能够回收的程度含有壳多糖的含有壳多糖的物质。
作为上述壳多糖的原料，没有特别限制，可以使用来源于壳多糖系生物质的原料。作为这样的原料，可举出例如虾、蟹等的甲壳、乌贼等的软甲、或昆虫等的甲壳或外骨架、真菌类的细胞壁等。此外，作为原料，可以使用来源于天然物的物质，也可以使用市售品。在原料来源于天然物的情况下，可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上。
作为来源于天然物的原料，可以使用例如红雪蟹。在使用红雪蟹的情况下，可以通过将干燥了的红雪蟹的壳，以及去除了躯干的腿、其关节部分粉碎成3cm～5cm，在高温的稀氢氧化钠水溶液与室温的稀盐酸水溶液中，分别浸泡2小时～3小时，将蛋白质、碳酸钙除去，来获得壳多糖。另外，将所得的壳多糖在高温的浓氢氧化钠水溶液中经8小时～20小时进行脱乙酰化，从而可以获得壳聚糖。在脱乙酰化所需要的时间短的情况下，所得的壳聚糖成为脱乙酰化度低的物质，即具有壳多糖结构的壳聚糖。这样操作而获得的壳多糖、或根据需要具有壳多糖结构的壳聚糖可以使用本发明的壳多糖分解酶组合物通过后述步骤而供于酶反应。
此外，已知在存在于自然界的壳多糖中，存在α-壳多糖与β-壳多糖的2种晶体结构。
本发明的壳多糖分解酶组合物为α-壳多糖和β-壳多糖的任一结构都可以水解，或者，为混合包含这些结构的壳多糖也可以水解。另外，可以认为与壳多糖同样地，在壳聚糖中也存在α、β的两结构的物质，无论为任一结构的壳聚糖，只要具有壳多糖结构，就可以水解。
在本发明中，作为壳多糖分解酶，使用了以壳多糖酶作为主体的物质。这样的壳多糖酶是指在酶反应中作为酶起作用，将壳多糖水解而获得低分子化了的壳多糖多糖(低分子化壳多糖多糖)、来源于壳多糖多糖的壳多糖寡糖、单糖(n-乙酰-d-葡糖胺)等这样的生产物的物质。
上述壳多糖酶的来源没有特别限定，可以为例如微生物来源、植物来源、昆虫来源等，它们之中优选为来源于微生物的壳多糖酶。作为生产壳多糖酶的微生物，没有特别限定，可举出例如，沙雷氏菌(serratia)属、芽孢杆菌(bacillus)属、链霉菌(streptomyces)属、交替单胞菌(alteromonas)属、球孢子菌(coccidioides)属、弧菌(vibrio)属等的细菌；曲霉(aspergillus)属、木霉(trichoderma)属等的真菌类。
此外，作为生产壳多糖酶的植物，没有特别限定，可举出例如，帕拉橡胶树(pararubbertree、heveabrisiliennsis)、大豆(glycinemax)、烟草(nicotianatabacum)等。
此外，作为生产壳多糖酶的昆虫，没有特别限定，可举出例如，蚕(bombyxmori)、斜纹夜蛾(spodopteralitura)等。
它们之中，优选为分别来源于粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的壳多糖酶。
另外，这些壳多糖酶可以被人工地改变(例如后述实施例的克隆化)。此外，这些壳多糖酶可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上。此外，壳多糖酶可以为一系列的酶群。作为这样的酶群，可举出壳多糖酶(ec3.2.1.14)等。此外，壳多糖酶可以混合使用不同来源的壳多糖酶。
此外，已知在壳多糖酶中存在多个立体结构，但在作为壳多糖分解酶使用时立体结构没有特别限定，可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上。作为具有这样的立体结构的壳多糖酶，可举出例如来源于粘质沙雷氏菌的壳多糖酶a或壳多糖酶b、来源于环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)wl-12的壳多糖酶a1、来源于病原性丝状菌粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)的壳多糖酶、来源于帕拉橡胶树的ヘバミン、来源于超高热菌激烈热球菌(pyrococcusfuriosus)的壳多糖酶、来源于放线菌灰色链霉菌的壳多糖酶c等。
它们之中，优选为壳多糖酶a，特别优选为至少含有壳多糖酶a的物质。另外，微生物来源、植物来源的壳多糖酶处于多个结构混合了的状态。在该情况下，可以使用例如尺寸排阻色谱(sizeexclusionchromatography)等分离方法将壳多糖酶精制。为了将被精制了的壳多糖酶按各结构进行分离，可以通过例如将尺寸排阻色谱的取样的时机根据壳多糖酶的分子量而变更来实现。
一般壳多糖酶大多数是在ph3～ph8的范围具有最适的酶活性的酶，但可以是在ph8～ph10以上的范围具有最适的酶活性的被称为碱性壳多糖酶的酶。此外，壳多糖酶大多数多为在反应温度为25℃～50℃的范围具有最适的酶活性的酶，但可以为在70℃～100℃的范围具有最适的酶活性的被称为耐热性壳多糖酶的酶。
在本发明中，作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质，可以使用二氧化硅、硅藻土、硅砂、石英、玻璃等。含有二氧化硅的物质之中，硅藻土和硅砂为二氧化硅为主成分的天然物。二氧化硅为至少含有二氧化硅的化合物的总称，一般在表面的一部分存在硅烷醇基。该二氧化硅的粒子形状可以为球状也可以为非球状，粒子结构可以为实心结构也可以为多孔质结构，结晶性可以为非晶质也可以为结晶质，可以以粉末状、悬浮液、分散液等的任一状态使用。二氧化硅表面的一部分可以被除硅烷醇基以外的其它官能团修饰。此外，可以为用硅烷偶联剂、硅醇盐、或硅酸离子等与除二氧化硅以外的化合物的表面反应而存在二氧化硅的层的形式。其中特别优选应用胶态二氧化硅、硅藻土和硅砂。
胶态二氧化硅的平均一次粒径为1nm～400nm，优选为5nm～350nm，使其在后述壳多糖分解反应液中存在而使用。平均一次粒径是由通过氮吸附法(bet法)测定的比表面积s(m2/g)通过换算式(d(nm)＝2720/s)算出的。另外，胶态二氧化硅作为分散于水、甲醇、乙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙二醇等分散介质中的分散液而使用，分散液被称为胶体液、溶胶等。在本发明中，可以在不抑制酶的活性的范围选择分散介质，但优选应用水、乙醇等分散介质。
作为胶态二氧化硅的制造方法，有以水玻璃作为原料的水玻璃法、以金属醇盐作为原料的醇盐法、以氯化硅化合物作为原料的气相法等。可以使用通过任何制造法获得的胶态二氧化硅，但优选应用通过水玻璃法获得的胶态二氧化硅。
在本发明中，含氮杂环式化合物为包含氮的杂环式化合物。作为这样的含氮杂环式化合物，可举出氮丙啶-2-甲酸甲酯、1-(2-羟基乙基)吖丙啶等三元杂环式化合物(含氮三元杂环式化合物)；吡咯烷、1h-吡咯、2h-吡咯、3h-吡咯、咪唑、l-组氨酸、2-甲基咪唑、2-乙基咪唑、苯并咪唑、吡唑、3,5-二甲基吡唑、1h-1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、1h-四唑等五元杂环式化合物(含氮五元杂环式化合物)；哌啶、2-甲基哌啶、4-甲基哌啶、4-羟基-1-甲基哌啶、吡啶、2-氨基吡啶、2-氨基-6-甲基吡啶等六元杂环式化合物(含氮六元杂环式化合物)；ε-己内酰胺、ε-硫代己内酰胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯等七元杂环式化合物(含氮七元杂环式化合物)。
它们之中，从廉价且易于获得考虑，优选为吡咯烷、咪唑、l-组氨酸、2-甲基咪唑、吡唑、3,5-二甲基吡唑、1,2,4-三唑、2-甲基哌啶、4-甲基哌啶、2-氨基吡啶、2-氨基-6-甲基吡啶、1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯，特别优选为咪唑、2-甲基咪唑。
(壳多糖分解反应液和糖的制造方法)
在本发明中，在将壳多糖水解时制备壳多糖分解反应液而使用。本发明的壳多糖分解反应液含有作为原料的壳多糖、和本发明的壳多糖分解酶组合物。详细内容后述，但从享有糖化反应效率的提高效果的观点考虑，在本发明的壳多糖分解反应液中，联合使用二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物。
一般而言，在酶反应中，如果底物浓度变高则观察到反应速度饱和的现象，该反应速度描绘出达到饱和最大速度的双曲线。这是因为，酶分子与底物相比为巨大的情况多，活性中心的范围窄，因此可以认为与金属催化剂等相比，底物与催化剂(酶)即使碰撞(适合于活性中心)发生反应的频率也小是原因。而且，如果底物浓度提高，则底物互相争夺较少的酶的活性中心，因此发生饱和现象。
因此，在本发明的壳多糖分解反应液中，只要根据壳多糖的含量而适当确定壳多糖分解酶的浓度即可。然而，如果壳多糖分解反应液中的壳多糖分解酶的浓度过低，则壳多糖分解酶的糖化反应效率降低而不优选。另一方面，如果壳多糖分解酶的浓度过高，则不仅发生饱和现象，而且壳多糖分解酶难以溶解于壳多糖分解反应液，经济上是不合适的。
此外，在本发明的壳多糖分解反应液中，二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的浓度为0.1mg/ml～400mg/ml，优选为0.5mg/ml～100mg/ml。如果二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的浓度低于0.1mg/ml，则壳多糖分解酶的糖化反应效率降低而不优选。另一方面，如果这些二氧化硅的浓度高于400mg/ml，则不仅壳多糖分解反应液的分散性恶化，而且在经济上是不合适的。
此外，在壳多糖分解反应液中，壳多糖分解酶与二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅的质量比率(壳多糖分解酶/二氧化硅)为0.0002～300，优选为0.002～30。如果两者的质量比率超出上述范围，则壳多糖分解酶的糖化反应效率的提高不显著。
此外，在壳多糖分解反应液中，含氮杂环式化合物的浓度为0.005mg/ml～100mg/ml，优选为0.05mg/ml～50mg/ml。进一步优选为0.68mg/ml～34mg/ml。最优选为6.8mg/ml～34mg/ml。如果含氮杂环式化合物的浓度低于0.005mg/ml则壳多糖分解酶的糖化反应效率降低而不优选，另一方面，如果高于100mg/ml则不仅壳多糖分解反应液的分散性恶化，而且在经济上是不合适的。
此外，在壳多糖分解反应液中，二氧化硅或含有二氧化硅的物质中的二氧化硅与含氮杂环式化合物的质量比率(含氮杂环式化合物/二氧化硅)为0.0001～100，优选为0.001～10。如果两者的质量比率超出上述范围，则壳多糖分解酶的糖化反应效率的提高不显著。
此外，壳多糖分解反应液的ph为4～8，优选为5～7。如果ph低于4则发生二氧化硅或含有二氧化硅的物质的凝集而壳多糖分解酶的糖化反应效率降低，另一方面，如果ph高于8则二氧化硅或含有二氧化硅的物质易于溶解于壳多糖分解反应液，因此是不优选的。另外，在壳多糖分解反应液中使用碱性壳多糖酶的情况下，调整二氧化硅或含有二氧化硅的物质在壳多糖分解反应液中的溶解性。由此，可以作为ph高于8的壳多糖分解反应液使用。
作为壳多糖分解反应液的ph调节剂，可举出硫酸、盐酸、硝酸等无机酸；乙酸、草酸等羧酸；柠檬酸、酒石酸、苹果酸等羟基酸；磷酸；氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化物盐；氨、脲等含氮化合物等。只要在不损害本发明的效果的范围，就对其种类、浓度没有特别限制地使用。此外，这些ph调节剂可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上，或者，可以以具有缓冲作用的缓冲液的状态使用。
此外，壳多糖分解反应液的反应温度优选根据壳多糖分解酶的最适温度而设定反应温度，优选为例如10℃～50℃，特别优选为25℃～40℃以下。一般而言，如果反应温度低于10℃则壳多糖分解酶的糖化反应效率显著降低，如果高于50℃则壳多糖分解酶可能失活因此不优选。然而，在使用耐热性壳多糖酶的情况下，即使为70℃～100℃也不失活。
另外，来源于壳多糖系生物质的原料的前处理只要通过应用公知的处理方法进行即可。例如，只要在通过切碎机等进行了物理粉碎后，进行酸处理和/或碱处理从而将蛋白质、碳酸钙除去，将其作为壳多糖的原料即可。
此外，壳多糖分解反应液的制备步骤没有特别限制，可以在分散了壳多糖分解酶的分散液中添加二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物而制成壳多糖分解反应液。或者，可以在分散了二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物的分散液中添加壳多糖分解酶而制成壳多糖分解反应液。在这些制备步骤中，如果壳多糖分解酶的糖化反应效率不降低则无论添加顺序如何均可。例如，可以将二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物同时添加，也可以分开添加。此时，可以将含氮杂环式化合物以粉末状态添加，也可以以溶液状态添加。另外，ph调节剂等其它添加剂只要为不损害本发明的效果的范围，就可以以任意顺序添加。
如以上说明的那样，在使用本发明的壳多糖分解酶组合物而制备壳多糖分解反应液时，虽然机制不清楚，但通过联合使用二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物，能够使壳多糖的水解进一步促进而使采用壳多糖分解酶的糖化反应效率提高。此外，通过壳多糖分解酶的糖化反应效率提高，能够使作为生产物的糖的收率提高而实现高收率化。此外，该壳多糖分解反应液通过二氧化硅或含有二氧化硅的物质和含氮杂环式化合物的联合使用，能够使壳多糖分解酶的使用量减少，因此为简便的反应体系，成本性也优异。
可以通过使用利用本发明的壳多糖分解酶组合物制备出的壳多糖分解反应液将壳多糖水解来制造糖。在制造糖时，可以在搅拌下使用壳多糖分解反应液将壳多糖水解。具体的糖的制造方法在后述实施例中说明。
实施例
以下，基于实施例进一步详述，但本发明不受该实施例任何限定。
(1.实施例1)
(1-1.壳多糖酶a的制备)
作为壳多糖分解酶使用的壳多糖酶a按照以下步骤制备。
将由粘质沙雷氏菌克隆化的壳多糖酶a(以下称为“smchia”)(参照t.watanabeetal.，journalofbacteriol，vol.179，no.22，1997，p.7111-p.7117)，向利用了t7启动子的蛋白大量表达体系构建用质粒载体pet27b(ノバジェン社制)克隆化。在克隆化时，以在smchia的羧基末端侧附带6次重复组氨酸标签的方式构建。
通过以下步骤进行了以smchia的大肠杆菌(escherichiacoli；e.coli)作为宿主的大量表达。
将保持上述质粒载体的e.colibl21(de3)，用加入了50μg/ml的卡那霉素的lb培养基，在37℃下振荡培养一晚而获得了培养液。次日，以该培养液作为种菌，向加入了50μg/ml的卡那霉素的オーバーナイトエクスプレス(overnightexpress(注册商标))lb培养基(ノバジェン社制)接种，在30℃下振荡培养一晚。次日，使用离心分离器集菌而制作菌的颗粒，将该颗粒向加入了ベンゾナーゼ(benzonase(注册商标))(ノバジェン社制)的バグバスター(bugbuster(注册商标))(ノバジェン社制)悬浮而获得了悬浮液。接着，将该悬浮液在室温下放置30分钟后，再次离心，回收其上清级分。
接下来，为了从上述上清级分精制/回收smchia，将该上清级分向5×5ml的histraphp柱(geヘルスケア社制)添加。然后，用洗涤用缓冲液洗涤上述hp柱。另外，洗涤用缓冲液将20mm的磷酸钠缓冲液(ph7.4)，0.5m的氯化钠、和25mm的咪唑混合而制作。
接下来，一边以浓度成为25mm～250mm(终浓度)的方式形成浓度梯度，一边将咪唑向柱添加，使smchia溶出，回收smchia溶出级分。将该smchia溶出级分使用ビバスピン(vivaspin(注册商标))20进行离心渗析，将上述洗涤用缓冲液置换为50mm的磷酸钠缓冲液(ph6.0)，获得了精制酶(smchia)。所得的精制酶的定量通过测定280nm的吸光度而进行。另外，smchia的摩尔吸光系数由预测氨基酸序列使用“theproteomicsprotocolshandbook”(参照j.m.walker，humanapress，2005，p.571-p.607)算出。
(1-2.壳多糖分解酶组合物的壳多糖酶活性的测定)
除了作为在上述(1-1.)中精制而获得的精制酶的smchia以外，使用二氧化硅作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质、和使用咪唑作为含氮杂环式化合物而制备壳多糖分解酶组合物，测定了酶活性(壳多糖酶活性)。该反应体系的壳多糖酶活性的测定通过以下步骤进行。另外，关于制备出的壳多糖分解酶组合物的组成，示于下述表1中。
首先，在玻璃管形瓶中加入一个转子，在其中分别加入终浓度12.5mg/ml的结晶性壳多糖(纯正化学株式会社制)、20mm的磷酸钠缓冲液(ph6.0)、0.125mg/ml的smchia、终浓度100mm的咪唑、和终浓度50mg/ml的二氧化硅溶胶(日产化学工业株式会社制，品名：st-ol，酸性溶胶)而获得了壳多糖分解反应液。将加入了该壳多糖分解反应液的玻璃管形瓶，摆放到管形瓶搅拌器(vaialstirrer)hs-10va(アズワン株式会社制)中，在25℃、22小时、和最大输出的条件下搅拌。在反应结束后立即通过以下步骤测定了壳多糖酶活性。
壳多糖酶活性的测定通过使用phbah(p-hydroxybenzoicacidhydrazide，对羟基苯甲酸肼)法(参照m.lever，analyticalbiochemistry，vol.47，no.1，1972，p.273-p.279)，求出作为生产物的壳多糖寡糖和n-乙酰-d-葡糖胺的还原糖量而进行。具体而言，将上述壳多糖分解反应液进行离心分离(4℃，最大离心加速度15780×g，5分钟)，回收该上清液。接下来，在回收的上清液中加入该上清液的2倍量的phbah溶液、和与上述上清液等量的2m的氢氧化钠，充分悬浮而获得了悬浮液。另外，phbah溶液是通过将0.1m的phbah、0.2m的酒石酸钾钠、和0.5m的氢氧化钠混合而获得的。
使所得的悬浮液在98℃下反应10分钟后，以10分钟骤冷到2℃。然后，测定波长405nm的od值(od：opticaldensity；光学浓度，光学密度)，使用该od值求出与空白的吸光度之差。此外，标准曲线使用n-乙酰-d-葡糖胺制成，由上述上清液中的吸光度的上升量求出还原糖量，示于下述表1中。另外，下述表1所示的还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(2.实施例2～4)
在实施例2～4中，作为二氧化硅或含有二氧化硅的物质，分别应用了二氧化硅溶胶(日产化学工业株式会社制，品名：st-ozl-35，酸性溶胶)、二氧化硅溶胶(日产化学工业株式会社制，品名：mp-4540m，na稳定型碱性溶胶)、和气相法二氧化硅(エボニック社制，品名：aerosil(注册商标)ox50，亲水性气相法二氧化硅)，除此以外，与实施例1同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了它们的壳多糖酶活性。各二氧化硅的终浓度与实施例1同样地为50mg/ml。另外，关于各壳多糖分解酶组合物的组成、求出的各还原糖量，与实施例1同样地操作而示于下述表1中。此外，下述表1所示的各还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(3.实施例5)
在实施例5中，进一步加入终浓度100mm的氯化钠，除此以外，与实施例2同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了它们的壳多糖酶活性。另外，关于壳多糖分解酶组合物的组成、求出的还原糖量，与实施例1同样地操作而示于下述表1中。此外，下述表1所示的还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(4.实施例6)
在实施例6中，将咪唑的终浓度变更为500mm，除此以外，与实施例2同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了它们的壳多糖酶活性。另外，关于壳多糖分解酶组合物的组成、求出的还原糖量，与实施例1同样地操作而示于下述表1中。此外，下述表1所示的还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(5.实施例7)
在实施例7中，将作为含氮杂环式化合物的咪唑变更为2-甲基咪唑，除此以外，与实施例2同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了它们的壳多糖酶活性。另外，关于壳多糖分解酶组合物的组成、求出的还原糖量，与实施例1同样地操作而示于下述表1中。此外，下述表1所示的还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(6.比较例1～10)
在比较例1中，不添加二氧化硅、咪唑和氯化钠，除此以外，与实施例5同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例2中，不添加二氧化硅和氯化钠，除此以外，与实施例5同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例3中，不添加二氧化硅，除此以外，与实施例5同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例4中，不添加二氧化硅和咪唑，除此以外，与实施例5同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例5～8中，分别不添加咪唑，除此以外，与实施例1～4同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例9中，不添加咪唑，除此以外，与实施例5同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
在比较例10中，在反应时，不进行使用了转子的搅拌而直接在25℃下静置22小时，除此以外，与比较例3同样地操作，制备壳多糖分解酶组合物，测定了该壳多糖酶活性。
另外，在比较例1～10中，关于各壳多糖分解酶组合物的组成、求出的各还原糖量，与实施例1同样地操作而示于下述表1中。此外，下述表1所示的各还原糖量设为n＝3时的还原糖量的范围。
(7.壳多糖酶活性的评价)
(7-1.由咪唑或氯化钠的添加带来的壳多糖酶活性的提高效果)
将比较例1与比较例2～4的壳多糖酶活性进行比较，对由咪唑或氯化钠的添加带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察比较例1与比较例2～4的还原糖量，则相对于比较例1，比较例2～4都还原糖量微增。这表示在比较例2～4中壳多糖的水解反应顺利进行而糖化反应效率稍微提高了，明确了通过咪唑或氯化钠的添加而壳多糖酶活性稍微提高了。
(7-2.由二氧化硅的添加带来的壳多糖酶活性的提高效果)
将比较例1与比较例5～8的壳多糖酶活性进行比较，对由二氧化硅的添加带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察比较例1与比较例5～8的还原糖量，则虽然相对于比较例1，比较例5～8根据二氧化硅的形态而观察到若干差异，但还原糖量都减少了。这表示在比较例5～8中壳多糖的水解反应未顺利进行，明确了通过二氧化硅的添加而抑制壳多糖酶活性。因此，这里评价为比较例5～8相对于比较例1的壳多糖酶活性被抑制，将壳多糖酶活性提高效果作为“抑制”而示于下述表1中。
作为二氧化硅成为壳多糖酶活性的抑制因素的理由，与非专利文献1的图5(snpc1)的结果一致，因此可以认为在壳多糖酶与二氧化硅共存的状态下，壳多糖酶物理吸附而被固定化于二氧化硅表面，从而壳多糖酶活性被抑制。
(7-3.由二氧化硅和咪唑的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果)
按照上述(7-1.)和上述(7-2.)的结果，将实施例1～4、实施例6与比较例2、比较例5～8的壳多糖酶活性进行比较，对于由二氧化硅和咪唑的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察实施例1～4与比较例5～8的还原糖量，则虽然相对于比较例5～8，实施例1～4根据二氧化硅的形态而观察到若干差异，但还原糖量都增加了。进一步，如果观察实施例1～4、6与比较例2的还原糖量，则相对于比较例2，实施例1～4、6都还原糖量增加了。理由不清楚，但这表示在实施例1～4、6中壳多糖的水解反应顺利进行而糖化反应效率提高了，明确了通过二氧化硅和咪唑的联合使用而壳多糖酶活性提高了。因此，这里评价为实施例1～4、6相对于比较例5～8的壳多糖酶活性提高了，将壳多糖酶活性提高效果作为“有”而示于下述表1中。
(7-4.由二氧化硅与氯化钠的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果)
按照上述(7-1.)～上述(7-3.)的结果，将实施例2、5与比较例3、9的壳多糖酶活性进行比较，对由二氧化硅和氯化钠的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察实施例2、5的还原糖量，则两者的还原糖量几乎没有变化。接下来，如果观察实施例5与比较例3的还原糖量，则相对于比较例3，实施例5的还原糖量增加了。接下来，如果观察实施例5与比较例9的还原糖量，则相对于比较例9，实施例5的还原糖量增加了。由此，明确了在实施例5中壳多糖酶活性提高了的原因是二氧化硅与咪唑的联合使用，不是二氧化硅与氯化钠的联合使用。因此，这里评价为实施例5相对于比较例9的壳多糖酶活性提高了，将壳多糖酶活性提高效果作为“有”而示于下述表1中。
(7-5.由二氧化硅和2-甲基咪唑的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果)
根据上述(7-1.)～上述(7-4.)的结果，将实施例7与比较例2、6的壳多糖酶活性进行比较，对由二氧化硅和2-甲基咪唑的联合使用带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察实施例2、7与比较例2、6的还原糖量，则相对于比较例2、6，实施例2、7都还原糖量增加了。这显示，与使用了咪唑的实施例2同样地，在使用了2-甲基咪唑的实施例7中，也壳多糖的水解反应顺利进行而糖化反应效率提高了，明确了通过二氧化硅和2-甲基咪唑的联合使用而壳多糖酶活性提高了。因此，这里评价为实施例7相对于比较例6的壳多糖酶活性提高了，将壳多糖酶活性提高效果作为“有”而示于下述表1中。另外，由该结果，对于除咪唑、2-甲基咪唑以外的含氮杂环式化合物，也提示了通过与二氧化硅的联合使用而壳多糖酶活性提高的可能性。
(7-6.由搅拌的有无带来的壳多糖酶活性的提高效果)
根据上述(7-1.)～上述(7-5.)的结果，将比较例3与比较例10的壳多糖酶活性进行比较，对由搅拌的有无带来的壳多糖酶活性的提高效果进行了研究。
如果观察比较例3与比较例10的还原糖量，则相对于比较例3，比较例10的还原糖量减少，壳多糖酶活性降低了。通过搅拌的有无而酶活性变化是一般的酶反应体系可能发生的现象。这里评价为比较例10相对于比较例3的壳多糖酶活性被抑制，将壳多糖酶活性提高效果作为“抑制”而示于下述表1中。
表1
另外，上述表1中的含氮杂环式化合物的种类a、b如以下所示。
a：咪唑(分子量68.08)
b：2-甲基咪唑(分子量82.11)
通过以上各实施例和各比较例，明确了在使用壳多糖分解酶组合物而制备壳多糖分解反应液时，通过二氧化硅、与咪唑或2-甲基咪唑联合使用，从而使由壳多糖酶a带来的糖化反应效率提高，使作为生产物的糖的收率提高而能够实现高收率化。
产业可利用性
本发明可以在应用包含从蟹、虾等甲壳类、昆虫、菌类等所包含的壳多糖的壳多糖系生物质分解成低分子化壳多糖多糖、来源于壳多糖多糖的壳多糖寡糖、单糖等这样的糖的技术的产业领域，例如医用材料、医药、化妆品、纤维、农业、水处理、食品等中利用。