本发明属于酶催化应用技术领域，特别涉及一种催化反应中酶循环使用的方法。
背景技术：
酶作为一种生物催化剂，具有反应条件温和、反应选择性好、催化转化率高、反应速率快等显著特点，被广泛应用于催化反应领域。但是，酶及其相关过程成本较高，约占总生产成本的50～70%，极大地限制了其工业应用。研究表明，酶循环使用可有效提高催化效率，从而降低生产成本。
目前，酶循环使用的方法主要有膜过滤分离法、重吸附法、固定化酶法等。膜过滤分离法是采用适当孔径的超滤、纳滤等膜组件，对游离酶或固定化酶进行选择性分离回收或继续循环至反应体系中使用，如酶膜反应器。该方法有效保持了酶活力，主要问题是膜污染严重、成本高，不便于工业化生产。重吸附法是采用新底物或吸附剂对游离酶进行特异性吸附分离，然后直接或解吸后循环使用，其中对纤维素酶的应用研究较为广泛。该方法简单、易于操作，存在酶回收不完全、酶活力易损失等缺点。固定化酶法是研究最为广泛的一种实现酶循环使用的传统方法，其通过吸附、共价结合、包埋、吸附交联等手段将游离酶固定于载体上，从而实现酶的重复使用。固定化酶具有热稳定性好、储存稳定性高、操作条件宽泛、可连续使用、便于分离等显著优点，但是，固定化及其相关过程通常会导致10～90%的酶活力损失。
现有酶循环使用的方法，如2016年08月31日授权公告的公告号为cn104498458b“一种抛光纤维素酶重复使用方法”的发明专利，该专利公开的方法是：先将常规纤维素酶抛光处理液降温，然后用氨水、醋酸调节ph值，经微孔过滤、超滤、补料、升温、纤维素酶补充等步骤，实现抛光纤维素酶的重复使用。该方法存在的主要缺点有：①工艺过程复杂，导致生产效率低，成本高，且不便于工业化生产；②使用氨水、醋酸等试剂，不仅对微孔滤膜、超滤膜造成不可逆的膜损伤，而且容易导致酶活力损失；③处理液成分复杂，极易造成膜污染，进一步提高生产成本；④过程中反复升温降温导致酶结构或微环境改变，造成酶活力进一步损失。
技术实现要素：
本发明的内容是针对现有催化反应中酶循环使用方法的不足之处，提供一种催化反应中酶循环使用的方法，该方法具有过程简单、稳定、易于放大，设备投资成本低，生产成本低，酶完全回收，催化转化率高等特点。采用本发明方法循环使用的酶具有酶活力高、性能稳定等特点。
本发明的机理是：透析是小分子可通过半透膜从高浓度一侧扩散到低浓度一侧直至膜两侧浓度达到平衡的简单扩散过程。由于多孔膜有选择性地允许小分子通过，而保留大分子，所以透析可以根据溶质大小起到分离作用。通过调控或选择透析膜的截留分子量，可以实现膜内外物质的截留与透过。透析袋具有截留分子量种类多、柔韧性好、材料成本低、操作简单等优势，在透析膜中应用最为广泛。酶作为一种生物大分子，其分子量范围一般为10～80kda。在催化反应中，将酶置于一定截留分子量的透析袋中，之后将装有酶的透析袋放入待反应的底物体系中，可进行透析反应。根据反应底物、酶的分子量大小进行透析袋截留分子量选择，使酶能够完全截留于透析袋内，而底物可以穿过膜进入透析袋内。由于底物分子量小于透析袋截留分子量，在浓度梯度下将不断扩散进入透析袋，并在袋内酶的催化作用下不断实现转化，生成的产物将不断扩散到透析袋外，从而实现透析反应。待反应完全后，将透析袋取出，经低速冷冻离心，透析袋内的液体不断透过，而酶由于分子量大于透析袋截留分子量保留在袋内，可继续置于新鲜的底物体系中使用，从而实现酶循环使用。该催化反应中使用游离酶，其可保持均相催化活性，因而催化转化效率高。此外，通过透析袋截留分子量的选择，可实现酶的完全截留，从而使该过程中酶完全回收。
本发明的目的是这样实现的：一种催化反应中酶循环使用的方法，经过透析袋预处理、透析反应器组装、底物体系制备、透析反应、离心等步骤实现酶循环使用。其具体的方法步骤如下：
（1）透析袋的处理
选择适宜截留分子量的市售透析袋，按照透析袋的容积︰质量分数为2～4%碳酸氢钠溶液的体积︰质量分数为0.5～1.5%edta溶液的体积之比为1︰5～10︰5～10的比例，将透析袋置于碳酸氢钠溶液与edta溶液的混合液中，在温度为60～80℃的条件下，预处理1～2h，分别收集预处理后的液体和预处理后的透析袋。对于收集的预处理后的液体，可继续用于透析袋预处理；对于收集的预处理后的透析袋，备用。然后再按照透析袋的容积︰纯化水的体积之比为1︰30～50的比例，将预处理后的透析袋置于纯化水中，在温度为60～80℃的条件下，清洗1～2h，分别收集清洗后的液体和清洗后的透析袋。对于收集的清洗后的液体，可继续用于预处理后的透析袋清洗；对于收集的清洗后的透析袋，即为处理后的透析袋，用于下一步处理。其中，透析袋截留分子量的选择标准为：底物分子量<透析袋截留分子量<0.1～0.8倍酶分子量。
（2）透析反应器的组装
第（1）步完成后，先按照市售酶的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰300～1500的比例，将酶分散于纯化水中，再放入超声波处理器中，控制温度为30～40℃，进行超声处理5～10min，用于对酶的活化与分散。超声完成后，收集分散液，即为酶液。再按照第（1）步收集的处理后的透析袋的容积︰酶液的体积之比为1︰0.2～0.5的比例，将酶液置于一端已用透析袋夹封闭的处理后的透析袋中，然后将另一端也用透析袋夹封闭，就组装出透析反应器，在温度为4～8℃下保存备用。
（3）底物体系的制备
以底物为原料，按照底物的质量（g）︰缓冲溶液的体积（ml）之比为1︰50～300的比例，将底物均匀分散于缓冲溶液中，收集溶液，即为底物体系，用于下一步处理。
（4）透析催化反应
第（3）步完成后，按照第（2）步组装的透析反应器︰第（3）步收集的底物体系的体积比为1︰30～200的比例，将透析反应器置于底物体系中，在温度为25～40℃，搅拌速度为100～250r/min下，进行透析催化反应2～10h，反应结束后，分别收集反应后的底物体系和反应后的透析反应器。对于收集的反应后的底物体系，用于反应产物的分离，液体主要为缓冲溶液，可继续用于底物体系的制备；对于收集的反应后的透析反应器，用于下一步处理。
（5）透析反应器的回收
第（4）步完成后，将第（4）步收集的反应后的透析反应器置于冷冻离心机中，在温度为4～8℃，转速为2000～3000r/min下，冷冻离心1.5～3h，分别收集离心后的液体和离心后的透析反应器。对于收集的离心后的液体，可与第（4）步中反应后的底物体系混合，用于产物和缓冲溶液的分离；对于收集的离心后的透析反应器，其中含有酶，可按照第（2）步补加纯化水后继续作为透析反应器使用，进而实现催化反应中酶的循环使用。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
1、本发明在生产过程中，方法步骤简单、可操作性强、设备投资成本低、无环境污染，非常便于工业化生产。
2、本发明在生产过程中，使用透析袋作为介质，采用冷冻离心回收反应器或酶，实现酶的完全回收，且循环使用后酶活力残留率高、性能稳定。
3、本发明在生产过程中，以成本低廉的透析袋实现酶的截留，使其循环使用；同时，酶处于均相体系中，催化活性高，可显著降低催化反应成本。
4、本发明在生产过程中，透析反应器的使用可减少生成物对酶催化反应的抑制作用，进一步提高底物的转化率。
5、本发明在生产过程中，可根据实际需求选择透析袋截留分子量及透析袋体积，操作简便，灵活性强，可实现柔性化生产。
本发明提供的方法，可广泛应用于医药、食品、化工、环境处理等行业的催化反应中。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种催化反应中酶循环使用的方法，具体方法步骤如下：
（1）透析袋的处理
选择截留分子量为30000da的市售透析袋，按照透析袋的容积︰质量分数为2%碳酸氢钠溶液的体积︰质量分数为0.5%edta溶液的体积之比为1︰5︰5的比例，将透析袋置于碳酸氢钠溶液与edta溶液的混合液中，在温度为60℃的条件下，预处理1h，分别收集预处理后的液体和预处理后的透析袋。对于收集的预处理后的液体，可继续用于透析袋预处理；对于收集的预处理后的透析袋，备用。然后再按照透析袋的容积︰纯化水的体积之比为1︰30的比例，将预处理后的透析袋置于纯化水中，在温度为60℃的条件下，清洗1h，分别收集清洗后的液体和清洗后的透析袋。对于收集的清洗后的液体，可继续用于预处理后的透析袋清洗；对于收集的清洗后的透析袋，即为处理后的透析袋，用于下一步处理。
（2）透析反应器的组装
第（1）步完成后，先按照市售漆酶的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰300的比例，将漆酶分散于纯化水中，再放入超声波处理器中，控制温度为30℃，进行超声处理5min，用于对漆酶的活化与分散。超声完成后，收集分散液，即为漆酶液。再按照第（1）步收集的处理后的透析袋的容积︰漆酶液的体积之比为1︰0.2的比例，将漆酶液置于一端已用透析袋夹封闭的处理后的透析袋中，然后将另一端也用透析袋夹封闭，就组装出透析反应器，在温度为4℃下保存备用。
（3）底物体系的制备
以2,4,5-三氯苯酚为原料，按照2,4,5-三氯苯酚的质量（g）︰ph5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的体积（ml）之比为1︰50的比例，将2,4,5-三氯苯酚均匀分散于缓冲溶液中，收集溶液，即为底物体系，用于下一步处理。
（4）透析催化反应
第（3）步完成后，按照第（2）步组装的透析反应器︰第（3）步收集的底物体系的体积比为1︰30的比例，将透析反应器置于底物体系中，在温度为25℃，搅拌速度为100r/min下，进行透析催化反应2h，反应结束后，分别收集反应后的底物体系和反应后的透析反应器。对于收集的反应后的底物体系，用于反应产物的分离，液体主要为缓冲溶液，可继续用于底物体系的制备；对于收集的反应后的透析反应器，用于下一步处理。
（5）透析反应器的回收
第（4）步完成后，将第（4）步收集的反应后的透析反应器置于冷冻离心机中，在温度为4℃，转速为2000r/min下，冷冻离心3h，分别收集离心后的液体和离心后的透析反应器。对于收集的离心后的液体，可与第（4）步中反应后的底物体系混合，用于产物和缓冲溶液的分离；对于收集的离心后的透析反应器，其中含有酶，可按照第（2）步补加纯化水后继续作为透析反应器使用，进而实现催化反应中酶的循环使用。该透析反应器连续使用10次后，底物总转化率为转化率95.7%，酶活力残留率为97.2%，酶回收率为100%。
实施例2
一种催化反应中酶循环使用的方法，具体方法步骤如下：
（1）透析袋的处理
选择截留分子量为15000da的市售透析袋，按照透析袋的容积︰质量分数为3%碳酸氢钠溶液的体积︰质量分数为1.0%edta溶液的体积之比为1︰8︰8的比例，将透析袋置于碳酸氢钠溶液与edta溶液的混合液中，在温度为70℃的条件下，预处理1.5h，分别收集预处理后的液体和预处理后的透析袋。对于收集的预处理后的液体，可继续用于透析袋预处理；对于收集的预处理后的透析袋，备用。然后再按照透析袋的容积︰纯化水的体积之比为1︰40的比例，将预处理后的透析袋置于纯化水中，在温度为70℃的条件下，清洗1.5h，分别收集清洗后的液体和清洗后的透析袋。对于收集的清洗后的液体，可继续用于预处理后的透析袋清洗；对于收集的清洗后的透析袋，即为处理后的透析袋，用于下一步处理。
（2）透析反应器的组装
第（1）步完成后，先按照市售黑芥子酶的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰900的比例，将黑芥子酶分散于纯化水中，再放入超声波处理器中，控制温度为35℃，进行超声处理7min，用于对黑芥子酶的活化与分散。超声完成后，收集分散液，即为黑芥子酶液。再按照第（1）步收集的处理后的透析袋的容积︰黑芥子酶液的体积之比为1︰0.3的比例，将黑芥子酶液置于一端已用透析袋夹封闭的处理后的透析袋中，然后将另一端也用透析袋夹封闭，就组装出透析反应器，在温度为6℃下保存备用。
（3）底物体系的制备
以萝卜苷为原料，按照萝卜苷的质量（g）︰ph6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积（ml）之比为1︰200的比例，将底物均匀分散于缓冲溶液中，收集溶液，即为底物体系，用于下一步处理。
（4）透析催化反应
第（3）步完成后，按照第（2）步组装的透析反应器︰第（3）步收集的底物体系的体积比为1︰100的比例，将透析反应器置于底物体系中，在温度为33℃，搅拌速度为150r/min下，进行透析催化反应6h，反应结束后，分别收集反应后的底物体系和反应后的透析反应器。对于收集的反应后的底物体系，用于反应产物的分离，液体主要为缓冲溶液，可继续用于底物体系的制备；对于收集的反应后的透析反应器，用于下一步处理。
（5）透析反应器的回收
第（4）步完成后，将第（4）步收集的反应后的透析反应器置于冷冻离心机中，在温度为6℃，转速为3000r/min下，冷冻离心1.5h，分别收集离心后的液体和离心后的透析反应器。对于收集的离心后的液体，可与第（4）步中反应后的底物体系混合，用于产物和缓冲溶液的分离；对于收集的离心后的透析反应器，其中含有酶，可按照第（2）步补加纯化水后继续作为透析反应器使用，进而实现催化反应中酶的循环使用。该透析反应器连续使用10次后，底物总转化率为转化率86.9%，酶活力残留率为88.5%，酶回收率为100%。
实施例3
一种催化反应中酶循环使用的方法，具体方法步骤如下：
（1）透析袋的处理
选择截留分子量为4000da的市售透析袋，按照透析袋的容积︰质量分数为4%碳酸氢钠溶液的体积︰质量分数为1.5%edta溶液的体积之比为1︰10︰10的比例，将透析袋置于碳酸氢钠溶液与edta溶液的混合液中，在温度为80℃的条件下，预处理2h，分别收集预处理后的液体和预处理后的透析袋。对于收集的预处理后的液体，可继续用于透析袋预处理；对于收集的预处理后的透析袋，备用。然后再按照透析袋的容积︰纯化水的体积之比为1︰50的比例，将预处理后的透析袋置于纯化水中，在温度为80℃的条件下，清洗2h，分别收集清洗后的液体和清洗后的透析袋。对于收集的清洗后的液体，可继续用于预处理后的透析袋清洗；对于收集的清洗后的透析袋，即为处理后的透析袋，用于下一步处理。
（2）透析反应器的组装
第（1）步完成后，先按照市售腈水解酶的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰1500的比例，将腈水解酶分散于纯化水中，再放入超声波处理器中，控制温度为40℃，进行超声处理10min，用于对腈水解酶的活化与分散。超声完成后，收集分散液，即为腈水解酶液。再按照第（1）步收集的处理后的透析袋的容积︰腈水解酶液的体积之比为1︰0.5的比例，将腈水解酶液置于一端已用透析袋夹封闭的处理后的透析袋中，然后将另一端也用透析袋夹封闭，就组装出透析反应器，在温度为8℃下保存备用。
（3）底物体系的制备
以扁桃腈为原料，按照扁桃腈的质量（g）︰ph6.0的磷酸钾缓冲溶液的体积（ml）之比为1︰300的比例，将底物均匀分散于缓冲溶液中，收集溶液，即为底物体系，用于下一步处理。
（4）透析催化反应
第（3）步完成后，按照第（2）步组装的透析反应器︰第（3）步收集的底物体系的体积比为1︰200的比例，将透析反应器置于底物体系中，在温度为40℃，搅拌速度为250r/min下，进行透析催化反应10h，反应结束后，分别收集反应后的底物体系和反应后的透析反应器。对于收集的反应后的底物体系，用于反应产物的分离，液体主要为缓冲溶液，可继续用于底物体系的制备；对于收集的反应后的透析反应器，用于下一步处理。
（5）透析反应器的回收
第（4）步完成后，将第（4）步收集的反应后的透析反应器置于冷冻离心机中，在温度为8℃，转速为2500r/min下，冷冻离心2h，分别收集离心后的液体和离心后的透析反应器。对于收集的离心后的液体，可与第（4）步中反应后的底物体系混合，用于产物和缓冲溶液的分离；对于收集的离心后的透析反应器，其中含有酶，可按照第（2）步补加纯化水后继续作为透析反应器使用，进而实现催化反应中酶的循环使用。该透析反应器连续使用10次后，底物总转化率为转化率72.4%，酶活力残留率为81.9%，酶回收率为100%。