一种核糖核酸酶及其抑制剂筛选的发光体系，制备方法及其应用与流程

发明涉及到一种特异性检测核糖核酸酶（如rnasea）及其抑制剂筛选的光化学方法，属于生物大分子酶活性检测及酶抑制剂筛选领域。

背景技术：

金纳米簇（auncs）是由几十到几百个金原子组成的新型纳米发光材料，近年来，金纳米簇因其独特的物理、化学性质获得了许多科研人员的青睐，在生物成像、化学传感等领域，表现出了较好的水溶性、低毒性、生物相容性、大的stocks位移等优势，具有广阔的应用前景。

早期，金纳米簇制备是在硫醇化合物、聚乙烯亚胺、聚酰氨-胺等保护或辅助下实现的，但是这些方法得到的金纳米簇发射蓝色荧光，在生物应用上的组织穿透能力远不如红色或者近红外发射的金纳米簇。为了得到发红色荧光的金纳米簇，在制备时通常会选用蛋白、多肽、dna等生物大分子等作为模板。生物大分子与金纳米簇的结合不仅为纳米簇提供了配体，更提高了系统的光稳定性和生物相容性。2009年xie等首次以bsa为配体成功合成了金纳米簇，其中bsa同时做为稳定剂与还原剂。这种bsa-auncs除了具备良好的生物相容性和环境/成本优势之外，还能促进功能配体的表面修饰。之后，bsa-auncs在各方面的应用在被广泛报道，如检测焦磷酸盐、多巴胺、孔雀石绿、碱性磷酸酶等。song和gu等以多肽为模板和还原剂合成了多肽-auncs，并运用于蛋白酶活性检测。但是以核酸为模板进行金纳米簇制备时，核酸并不能使au³⁺直接被还原，往往需要借助光、抗坏血酸等还原剂。tseng等以a30寡核苷酸单链为模板用紫外光辅助的方法制备了金纳米簇，qing等以单链dna为模板，hepes作为还原剂，得到了金纳米簇，并应用于hg²⁺检测。

到目前为止，以rna为模板制备的金纳米簇及其应用尚未有相关报道。

技术实现要素：

本发明的技术方案以rna为模板，抗坏血酸作为还原剂，mua为辅助剂制备了稳定的金纳米簇溶液。rna分子中大量的碱基与au³⁺有着较好的相互作用，能吸附并稳定溶液中的au³⁺，可作为制备金纳米簇的模板。这种rna-auncs溶液在315nm光激发下发很亮的红光。并且rnasea可以猝灭rna-auncs的荧光，因此实现rnasea活性检测。

本发明属于生物大分子探针领域，特别涉及测定生命体系核糖核酸剪切酶（如rnasea）活性及抑制剂筛选的荧光探针及方法。应用一种基于生物亲和性好的发红光的金纳米簇，这种金纳米簇是在温和条件下，以核糖核酸（rna）及巯基十一酸为微环境，以抗坏血酸作为温和的还原剂，由氯金酸（haucl4）制备得到的。

本发明所提供的条件温和，操作简单，灵敏度高和成本低廉的特异性检测核糖核酸酶（如rnasea）及其抑制剂筛选的亮红色发光体系，该体系是由核糖核酸（rna）为载体制备得到的金纳米簇来实现的，发光波长625-635nm，稳定保存期为10天以上。

本发明的技术方案是通过以下技术方案实现的：

在蒸馏水中加入氯金酸与核糖核酸，混合均匀，在30-40℃下水浴8-15分钟后，缓慢加入抗坏血酸，搅拌还原反应3-5h，得到混合溶液；

然后向该混合溶液中加入巯基十一酸，继续搅拌25-35min，离心，得到上清液即为金纳米簇。

所述的氯金酸、核糖核酸、抗坏血酸、巯基十一酸的体积比为0.8-1.2：6-10：8-15：0.8-1.2。

优选方案中氯金酸、核糖核酸、抗坏血酸、巯基十一酸的体积比为1：8：10：1

所述的核糖核酸溶液制备方法：称取rna，加入pb缓冲液，调节ph7.2-7.6，在3-4℃温度下密封避光放置10-12h后待用。

所述的巯基十一酸储备液制备方法：称取mua，溶于无水乙醇，配制成浓度为0.1-0.15m的储备液，将其密封好后，保存于3-4℃温度待用。

本发明的另一技术方案将所述的核糖核酸酶及其抑制剂筛选的发光体系在特异性检测核糖核酸酶rnasea的试剂上的应用。

定性识别核糖核酸酶（如rnasea）

在待测体系中实施金纳米簇的制备过程，根据得到的产品发光情况与无rnase存在时的金纳米簇发光强度对照，可以定性判断是否有rnase存在。

定量测试核糖核酸酶（如rnasea）

准确称取1.0mgrnasea，用5.0mlpb缓冲液（0.2mm，ph7.4）溶解，得到10u/ml的储备液，继续用pb缓冲液将其稀释到1u/ml,将配好的储备液在4℃温度下密封避光放置12h后待用。

将400μlrna（0.16mg/ml）与不同浓度的rnasea在37℃下共同培养1h，至rna完全被剪切，加入50μlhaucl4（1mm）搅拌10分钟后，缓慢加入500μl新鲜配置的aa溶液（1mm），剧烈搅拌4h。待还原4h后向混合溶液中加入50μlmua储备液（1mm），继续搅拌30分钟。将得到的溶液2000r离心20分钟，除掉游离的金原子，得到待测液。测试待测液荧光，绘制荧光强度（i/i0）与rnasea浓度关系的标准曲线。

在待测体系中实施金纳米簇的制备过程，根据测定的金纳米簇的发光强度，依据标准曲线计算得到待测体系中rnasea的浓度。

本发明的又一技术方案是将所述的核糖核酸酶及其抑制剂筛选的发光体系在筛选核糖核酸酶抑制剂的活性的试剂上的应用。

核糖核酸酶（如rnasea）抑制剂筛选

取2.5μl含有不同抑制剂的rnasea加入到400μlrna（0.16mg/ml）中，在37℃下共同培养1h，至rna与rnasea完全反应。加入50μlhaucl4（1mm）搅拌10分钟后，缓慢加入500μl新鲜配置的aa溶液（1mm），剧烈搅拌4h。待还原4h后向混合溶液中加入50μlmua储备液（1mm），继续搅拌30分钟。将得到的溶液2000r离心20分钟，除掉游离的金原子，得到待测液，测定发光强度（i）。同时按照同样的步骤做不含抑制剂的对照试验，根据得到的发光强度（im）。由下式计算抑制率：

(i-im)/(i0-im)×100%

根据抑制率大小判断rnasea抑制剂的抑制活性。

所述的体系是由核糖核酸（rna）为载体制备得到的金纳米簇体系发出亮红色荧光，发光波长630nm左右，且保存10天以上，发光强度没有明显减弱现象。

所述的荧光测定时溶液配制缓冲液所用水均为二次蒸馏水或更高纯度的水。

所述的中性缓冲液为由kh2po40.24g，na2hpo41.44g（如果是na2hpo4·12h2o，则3.63g）溶于1000ml水中配制而成。

所述的发光强度可以通过直接在紫外灯下观测或在荧光分光光度计上测试得到。

本发明将既可以用于特异性检测核糖核酸酶（如rnasea），也可以用于核糖核酸酶抑制剂活性筛选。在没有核糖核酸酶（如rnasea）存在的情况下，以rna为模板制备的金纳米簇发很亮的红色荧光，但是核糖核酸酶（如rnasea）的存在会破坏rna结构，如果存在核糖核酸剪切酶（如rnasea），核糖核酸结构被破坏，金纳米簇无法形成，或者发光强度弱，由此定性识别核糖核酸酶或定量测定核糖核酸酶的含量，此体系还可以用于核糖核酸酶抑制剂的筛选。

此体系中，金纳米簇的制备条件是在30-40℃下水浴，氯金酸、核糖核酸、抗坏血酸、巯基十一酸的体积比为0.8-1.2：6-10：8-15：0.8-1.2。由发光体系的发光强度可以定性定量检测核糖核酸酶，定量检测范围在0~2.5×10^-4u/ml。

此类鉴别方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等特点，值得推广。

附图说明

图1为以rna为模板制备的金纳米簇在310nm紫外灯照射下的荧光照片（红色荧光）。

图2为金纳米簇的吸收（左）与荧光发射（右）光谱。

图3为金纳米簇放置一周后的荧光光谱。

图4为ph对金纳米簇发光强度的影响。

图5加入rnasea前后金纳米簇的荧光光谱变化。插图：310nm紫外灯下加入rnasea前、后金纳米簇的荧光照片（左亮：加入前；右暗：加入后）。

图6为加入不同浓度rnasea时金纳米簇的荧光光谱。

图7为金纳米簇荧光强度（i/i0）与rnasea浓度的关系；插图：i/i0与rnasea浓度间的定量关系曲线。

图8为不同浓度抑制剂存在下金纳米簇的荧光光谱。

具体实施方式

下述试验和实例用于进一步说明但不限于本发明。

（1）以rna为模板制备金纳米簇

在4.0ml蒸馏水中加入50μl氯金酸（haucl4，1mm）与400μl核糖核酸（rna，0.16mg/ml），混合均匀，在37℃下水浴10分钟后，缓慢加入500μl新鲜配置的抗坏血酸（aa，1mm），剧烈搅拌4h。待还原4h后向混合溶液中加入50μl巯基十一酸（mua，1mm），继续搅拌30分钟。将得到的体系以2000转/分钟的速度离心20分钟，除掉溶液中游离的金原子，得到澄清透明的淡粉色溶液即为金纳米簇，在310nm紫外光照射下的照片如图1，测定吸收光谱和荧光发射光谱如图2，发光强度为i0。

（2）金纳米簇稳定性和适应性实验

将（1）得到的金纳米簇在暗处，4℃冷藏，选择不同时间测定发光强度，以判断体系发光稳定性。实施结果如图3。

将（1）得到的金纳米簇置于不同ph值的缓冲液中，测定其发光强度，判断其在不同生理环境下的发光适应性。实施结果如图4。

（3）定性识别核糖核酸酶（如rnasea）

在待测体系中按照以上（1）的方法实施金纳米簇的制备过程，根据得到的产品发光情况与（1）中得到的金纳米簇发光强度对照，如发光强度明显下降，或不发光，则定性判断有rnase存在。实施结果如图5。

（4）定量测试核糖核酸酶（如rnasea）：

准确称取1.0mgrnasea，用5.0mlpb缓冲液（0.2mm，ph7.4）溶解，得到10u/ml的储备液，继续用pb缓冲液将其稀释到1u/ml,将配好的储备液在4℃温度下密封避光放置12h后待用。

将400μlrna（0.16mg/ml）与不同浓度的rnasea在37℃下共同培养1h，至rna完全被剪切，加入50μlhaucl4（1mm）搅拌10分钟后，缓慢加入500μl新鲜配置的aa溶液（1mm），剧烈搅拌4h。待还原4h后向混合溶液中加入50μlmua储备液（1mm），继续搅拌30分钟。将得到的溶液2000r离心20分钟，除掉游离的金原子，得到待测液。测试待测液荧光，绘制荧光强度（i/i0）与rnasea浓度关系的标准曲线。实施结果如图6，图7。

根据权利要求3的方法在待测体系中实施金纳米簇的制备过程，根据测定的金纳米簇的发光强度，依据标准曲线计算得到待测体系中rnasea的浓度。

（5）核糖核酸酶（如rnasea）抑制剂筛选

取2.5μl含有不同抑制剂的rnasea加入到400μlrna（0.16mg/ml）中，在37℃下共同培养1h，至rna与rnasea完全反应。加入50μlhaucl4（1mm）搅拌10分钟后，缓慢加入500μl新鲜配置的aa溶液（1mm），剧烈搅拌4h。待还原4h后向混合溶液中加入50μlmua储备液（1mm），继续搅拌30分钟。将得到的溶液2000r离心20分钟，除掉游离的金原子，得到待测液，测定发光强度（i）。同时按照同样的步骤做不含抑制剂的对照试验，根据得到的发光强度（im）。由下式计算抑制率：

(i-im)/(i0-im)×100%

根据抑制率大小判断rnasea抑制剂的抑制活性。实施结果如图8。