水稻品种IR36抗黑条矮缩病位点qRBSDV-1及其分子标记方法和应用与流程

本发明涉及水稻品种ir36中抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1鉴定及其分子标记方法和应用，属于水稻分子育种科学技术领域。

背景技术：

水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(riceblack-streakeddwarfvirus,rbsdv)引起的病毒病，主要由灰飞虱以持久性不经卵的方式进行传播。水稻黑条矮缩病的典型症状是病株矮缩，叶色浓绿僵硬，叶背、叶鞘和茎杆有早期蜡白色、后期为黑褐色的短条状不规则突起，通常发病植株不抽穗或者极少结实，被喻为水稻“癌症”。上世纪60年代，水稻黑条矮缩病在我国华东诸省市大爆发，随后20年，由于麦田翻耕和早稻移栽等耕作方式的兴起，杀灭了第一代灰飞虱若虫，病害的初侵染受阻，致使发病面积逐年下降。80年代后，由于扩种小麦，又给本病初侵染创造了有利的寄主条件，致使本病在90年代于浙江、上海、江苏、安徽、江西和福建省北部等长江中下游地区再次大爆发。进入本世纪以来，随着耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、河南等省大规模发生。

目前，主要使用农药杀灭传毒媒介灰飞虱来防治水稻黑条矮缩病。但是由于灰飞虱数量大、具有迁徙性及耐药性高等因素，导致防治效果不佳，且存在环境污染。选育抗病品种是防治各类病害最为经济、有效的手段。但黑条矮缩病的发病规律以及发病地点较难掌控，且田间鉴定缺少稳定性，靠人工接种病毒又需大量的人工投入，这些均是研究黑条矮缩病所需面对的困难。迄今为止，在生产上还没有发现对rbsdv免疫的品种，rbsdv的抗性受多个数量性状位点控制，多个抗性基因/qtl聚合是抗黑条矮缩病品种选育的重要途径。因此，筛选水稻黑条矮缩病抗性种质，开展开水稻黑条矮缩病抗性qtl定位及连锁标记的开发显得尤为重要。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明对常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点，提供了水稻品种ir36中抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1及其分子标记方法，该方法可以预测植株对水稻黑条矮缩病的抗性，简化了选择方法，进而加快抗病品种的育种进程。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：水稻品种ir36抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1位于第1染色体上分子标记ap-39.6和rm104之间。

用分子标记ap-39.6引物seqidno.1/seqidno.2和分子标记rm104引物seqidno.3/seqidno.4扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料，以验证品种或育种材料是否存在抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1；

当水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料扩增出与ir36(亲本)同样的条带，表明水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料内存在抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1。

水稻品种抗黑条矮缩病位点的标记方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)构建l5494/ir36重组自交系群体；

(2)对l5494/ir36重组自交系群体进行水稻抗黑条矮缩病田间自然鉴定；

(3)混取亲本及群体中各家系3张叶片，采用ctab法提取水稻全基因组dna；

(4)利用均匀分布在水稻12条染色体上的多态性标记对各家系基因型进行检测；

(5)根据标记检测结果，用qtlicimapping4.0软件map模板进行遗传连锁图谱的构建；

(6)结合抗性表型参数，用qtlicimapping4.0软件复合区间作图法检测水稻黑条矮缩病的抗性qtl，lod值的阈值定为2.5，检测抗性qtl的数目及其在染色体上的位置；

(7)获得水稻黑条矮缩病抗性品种ir36的1个抗黑条矮缩病基因位点qrbsdv-1，位于第1染色体上分子标记引物ap-39.6：seqidno.1/seqidno.2和rm104：seqidno.3/seqidno.4之间。

所述的水稻黑条矮缩病田间自然鉴定方法和分子标记检测技术为常规方法。

相对于现有技术，本发明的分子标记定位的抗性基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测qrbsdv-1两侧的分子标记即可预测水稻植株的黑条矮缩病抗性水平，提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。

附图说明

图1：水稻品种ir36抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1在染色体上的位置；

图2：染色体片段代换系n9的重测序图谱；

图3：qrbsdv-1两端分子标记的电泳图谱。

具体实施方式

为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

1、l5494/ir36重组自交系群体的构建

2010年正季在扬州用感病亲本l5494与抗病亲本ir36杂交配制杂种f1，经连续自交，构建包含222个家系的重组自交系群体，至2015年为f8代，2016年为f10代。

2、l5494/ir36重组自交系群体黑条矮缩病抗性表型鉴定

由于近年来扬州黑条矮缩病发病较轻，难以反映不同材料的抗感差异，故2015-2016年将l5494/ir36重组自交系群体播种于河南开封重病区进行感病处理。播种田块靠近麦田，麦田不施用抗灰飞虱农药。由于水稻叶龄2时最易感黑条矮缩病毒，在幼苗期每天人工驱赶灰飞虱，以使群体充分感病。秧龄30天左右，将稻苗移栽至扬州大学试验基地种植，单苗栽插，株行距13.3㎝×25㎝，随机排列，重复两次，每次重复每个家系种植54株，常规水肥管理。

表型鉴定时，发现植株较家系内正常株明显矮缩、叶色浓绿僵硬，则判定为受黑条矮缩病侵染。在水稻分蘖初期，对各家系进行一次鉴定，并用竹签对发病植株进行标记；在水稻分蘖盛期，进行第二次鉴定，统计各个家系的黑条矮缩病发病率。

3、分子标记分析

(1)采用ctab法提取l5494/ir36重组自交系群体各家系及双亲dna。

(2)分子标记选取本实验室已有的134对均匀分布于12条染色体上的在lr36与l5494之间具有良好多态性的ssr标记(来源于http://www.gramene.org/)及sts标记(实验室使用premier6.0软件自行合成)。

(3)pcr扩增的反应体系为：模板dna2μl，0.3μm引物2μl，2×estaqmastermix8μl(2×estaqmastermix为dntp，mg²⁺，buffer，taq酶的混合液)，加dd水补足至20μl。

(4)pcr扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性40s，53-58℃退火40s，72℃延伸30-50s，由变性至延伸的过程一般需要30个循环，最后72℃保温10min。

(5)扩增产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

4、遗传图谱构建及qtl分析

根据定位群体各家系分子标记检测结果，用qtlicimapping4.0软件map模板进行遗传连锁图谱的构建；结合表型数据利用软件qtlicimapping4.0的复合区间作图法检测水稻黑条矮缩病的抗性qtl，lod值的阈值定为2.5，检测抗性qtl的数目及其在染色体上的位置。

5、抗性qtl的获取

2015在第1染色体上检测到一处来源于ir36的水稻黑条矮缩病抗性qtl，lod值为2.96，表型贡献率为8.95％，命名为qrbsdv-1，位于第1染色体上分子标记ap-39.6：seqidno.1/seqidno.2和rm104：seqidno.3/seqidno.4之间。2016年再次重复到该处qtl，lod值为4.44，表型贡献率为12.64％(图1)。

6、qrbsdv-1的验证

2003-2010年，本实验构建了一套以9311为供体，日本晴为受体的的染色体片段代换系群体，并通过重测序技术明确了各系背景中的导入片段。选择仅在qrbsdv-1所在染色体区段含有93-11导入片段的代换系(编号n9)(图2)及代换系双亲进行分子标记检测及黑条矮缩病抗性鉴定，用以验证qrbsdv-1的真实性及标记可靠性。

2017-2018年，将n9、日本晴及93-11以同样的方式送至开封感病，移栽扬州大学试验基地仍采取单苗栽插，株行距不变，重复三次，每次重复100株。2017年，日本晴三次重复的发病率分别为31.20％，32.73％及29.63％，n9三次重复的发病率分别为25.65％，29.17％及24.32％，93-11三次重复发病率分别为18.33％，10.19％及18.35％，n9发病率较对照日本晴显著降低(p＝0.0474<0.05)。2018年，日本晴三次重复发病率分别为8.00％，18.00％及13.00％，n9三次重复发病率分别为4.00％，1.00％及1.02％，93-11三次重复发病率分别为0.00％，3.00％及3.00％，n9发病率较对照日本晴显著降低(p＝0.0228<0.05)。据此两年结果表明，n9的抗性水平要明显优于日本晴，验证了qrbsdv-1的真实性(表1)。

表1：n9、日本晴及93-11发病情况

7、通过检测qrbsdv-1的存在预测水稻材料对黑条矮缩病的抗性水平

分子标记检测结果表明，n9在标记ap-39.6与rm104处检测为ir36带型，日本晴在该对应标记处检测为l5494带型。用分子标记ap-39.6引物seqidno.1/seqidno.2和分子标记rm104引物seqidno.3/seqidno.4扩增水稻抗黑条矮缩病鉴定材料，如果能扩增出与ir36同样的条带则标志着水稻材料内存在抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1(图3)。

本说明书中涉及的序列(5’-3’)如下所示：

seqidno.1：gcattggtccttggtctg

seqidno.2：tcgggcacacaacaacac

seqidno.3：ggaagaggagagaaagatgtgtgtcg

seqidno.4：tcaacagacacaccgccaccgc

本发明以水稻抗黑条矮缩病品种ir36与感黑条矮缩病品系l5494杂交构建的重组自交系群体为定位群体，通过田间自然鉴定的方法进行黑条矮缩病抗病性鉴定，获得1个来自于抗黑条矮缩病品种ir36的抗性基因位点，命名为qrbsdv-1，位于标记ap-39.6与rm104之间。随后利用日本晴背景仅在qrbsdv-1所在染色体区段含有93-11导入片段的代换系(编号n9)及双亲进行分子检测及黑条矮缩病发病率鉴定，对qrbsdv-1进行验证。本发明可以通过检测标记ap-39.6与rm104分子标记处的带型来预测被检测材料对水稻黑条矮缩病的抗性，提高了抗黑条矮缩病水稻品种的育种效率。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>扬州大学

<120>水稻品种ir36抗黑条矮缩病位点qrbsdv-1及其分子标记方法和应用

<130>xhx2018010801

<141>2019-01-08

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcattggtccttggtctg18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcgggcacacaacaacac18

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggaagaggagagaaagatgtgtgtcg26

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcaacagacacaccgccaccgc22