一种检测JAK3基因内含子2基因突变的引物和方法与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测jak3基因内含子2基因突变的引物和检测方法，采用普通pcr技术，可用于快速检测jak3基因内含子2的突变情况。

背景技术：

jak3基因位于19号染色体p12.13.1，其开放读码框有3372个碱基，编码1124个氨基酸，共24个外显子。从羧基到氨基酸端分别为jh1、jh2、jh3、jh4、jh5、jh6、jh7。jh1为激酶域，对调节激酶活性有重要作用。jh2为伪激酶结构域，尽管缺乏催化活性，但却具有某些必需的调节作用，许多在此区域的病人或人为的突变将导致激酶活性尚失。jh3～jh5区域的功能目前尚未研究明确，考虑可能与jaks在体内的装配有关。jh6与jh7的n端是jaks与γc相结合所必需的，在信号传导中起重要作用。jh6、jh7又称之为ferm，共编码约300个氨基酸，介导部分细胞因子与细胞因子受体之间的相互作用，同时在调节细胞表面同源受体的表达中也起重要作用，并与激酶域共同促进、调节激酶催化活性。

jak3主要表达于造血干细胞，与il-2、il-4、il-7、il-9、il-15的共同受体共同γ链(γc)相结合，对信号从γc至转录激活家族(stats)的传导尤为重要，对细胞发育与活性具有重要调节作用。il-7所介导的信号通路对t细胞的发育起关键作用，il-2则促进外周t细胞的稳定以及抗原特异性t细胞的增殖，il-15是nk细胞发育所必需的，而il-4却只对终末b细胞的分化以及同型间的转换起作用。jak3缺陷的患儿临床表现为反复细菌或病毒感染，外周血t细胞及nk细胞严重减少，b细胞数量正常或稍减少但存在功能障碍。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测jak3基因内含子2突变热点的引物，采用pcr技术，可用于快速检测患者体内jak3基因内含子2突变位点的情况。所述检测jak3基因内含子2位点突变情况的引物，包括：

扩增jak3基因内含子2的引物，其碱基序列为：

jak3-int2-f：tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg

jak3-int2-r：aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测jak3基因内含子2的测序引物碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

进一步地，引物序列jak3-int2-f和jak3-int2-r是扩增jak3基因内含子2序列的引物。

本发明还提供了检测jak3基因内含子2突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提血液/中的dna；

2.用pcr扩增步骤1中提取的dna；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定jak3基因内含子2是否发生突变；

其中pcr扩增引物为：

扩增jak3基因内含子2的引物，其碱基序列为：

jak3-int2-f：tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg

jak3-int2-r：aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa。

进一步地，测序引物碱基序列为：

检测jak3基因内含子2的测序引物碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

本发明还提供了一种检测jak3基因内含子2位点突变的试剂盒，包括：

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中pcr扩增反应液引物为：

(扩增)jak3基因内含子2的引物，其碱基序列为：

jak3-int2-f：tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg

jak3-int2-r：aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa。

进一步地，测序引物碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

m13r：aacagctatgaccatg。

有益效果：本发明设计了扩增jak3基因内含子2的引物。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测jak3基因内含子2区域的方法，可以一次将jak3基因内含子2的突变检测出来，相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为引物jak3-int2-f/r的电泳图，m为markerdl2000，如图1所示，引物jak3-int2-f/r扩增有效，且条带单一。

图2、3、4分别为样本1、3、4的jak3基因内含子2突变型测序截图。

图5、6、7分别为样本2、5的jak3基因内含子2野生型测序截图

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测jak3基因内含子2基因位点突变的引物，该引物的设计是针对jak3基因内含子2设计的扩增引物，包括：

扩增jak3基因内含子2的引物，其碱基序列为：

jak3-int2-f：tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg

jak3-int2-r：aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa。

一种检测jak3基因内含子2位点突变的试剂盒，包括

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；jak3基因内含子2的上、下游引物引物jak3-int2-f/r引物浓度均为10μm。

测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测jak3基因内含子2的上、下游引物分别为m13-f(3.2μm)、m13-r(3.2μm),以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μldna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

jak3-int2-f：tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg

jak3-int2-r：aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa。

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即血液样本以jak3-int2-f/r为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为458bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物jak3-int2-f/r扩增有效，且条带单一。

(6)sanger测序：

取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与jak3基因内含子2野生型参考序列(genbank：ng_007273.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取5例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系pcr反应液中加入样本1μl。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物jak3-int2-f/r对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本的检测结果如图2、3、4、5、6、7所示：

图2显示是样本1、3、4的jak3基因内含子2突变型3821c＞t位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3821c＞t突变。

图3显示是样本1、3、4的jak3基因内含子2突变型3839g＞a和3841g＞a位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3839g＞a和3841g＞a突变。

图4显示是样本1、3、4的jak3基因内含子2突变型3895c＞t位点测序截图，说明样本1、3、4的内含子2发生3895c＞t突变。

图5显示是样本2、5的jak3基因内含子2野生型3821c＞t位点测序截图，说明样本2、5的jak3基因内含子2未发生3821c＞t突变。

图6显示是样本2、5的jak3基因内含子2野生型3839g＞a和3841g＞a位点测序截图，说明样本2、5的jak3基因内含子2未发生3839g＞a和3841g＞a突变。

图7显示是样本2、5的jak3基因内含子2野生型3895c＞t位点测序截图，说明样本2、5的jak3基因内含子2未发生3895c＞t突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩展出jak3基因内含子2序列，并且测序结果完全准确，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110>合肥艾迪康医学检验实验室有限公司

<120>一种检测jak3基因内含子2基因突变的引物和方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgtaaaacgacggccagtttacaggcataagccaccg37

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacagctatgaccatgacacccttctccattacaaaa37

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtaaaacgacggccagt18

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aacagctatgaccatg16