一种用于非洲猪瘟病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

非洲猪瘟(asf)病由非洲猪瘟病毒(asfv)引起，是一种严重威胁养猪业的猪病毒性传染病，被我国列为一类动物疫病，是我国重点防控疫病。asf的发病有特急性、急性、亚急性和慢性的形式。由于猪感染的病毒的毒力不同，死亡率从0％到100％不等。急性疾病的特征是潜伏期短，大约3～7天，伴随高烧(可达42℃)，并在5～10天内死亡。

非洲猪瘟病毒属于dna病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性dna病毒。非洲猪瘟病毒是由病毒基因组、完成基因早期转录所必须的酶以及一些dna结合蛋白组成，结构蛋白较多，其中p72是主要的结构蛋白之一，占病毒总蛋白量的1/3，而且该蛋白序列保守，抗原性佳，病毒感染后能够产生高滴度的抗p72抗体，因此常被用作非洲猪瘟的血清学诊断；另外，根据p72基因末端一段478bp的核酸序列，非洲猪瘟可分为23个基因型，如benin97/1为基因i型，malawili20/1为基因viii型，东非埃塞尔比亚分离株属于基因xxiii型。非洲猪瘟病毒基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性。非洲猪瘟病毒不能够诱导产生中和抗体，因此还没有对血清型进行分类。

在非洲猪瘟诊断方面，由于非洲猪瘟病毒不同毒株的毒力不同，患病猪临床症状及病理变化差别大，难以确诊。目前，对非洲猪瘟病毒检测主要通过以下四种实验室检测方法进行检测：病毒的分离鉴定；抗体免疫组化；酶联免疫吸附；反转录聚合酶链式反应。其中，病毒分离鉴定，体外扩增培养时间长，细胞培养对人员设备要求高，步骤繁琐；免疫组化，检测病料组织中的病毒，特异性较差，容易出现假阳性，操作过程复杂，对病料保存、处理等需要专业人员进行操作，操作过程中的差异对结果影响较大，需要检测者具有一定经验才能做出准确判断；酶联免疫吸附，结果较为准确，但对样品要求较高，要求新鲜病料才能检测准确，检测需要抗体，成本高，时间长，至少4～6小时才能有结果；反转录聚合酶链式反应，需要pcr仪等专业设备，需要在实验室进行操作。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用，所述试剂盒用于非洲猪瘟病毒lamp检测，检测效率高，灵敏度好，特异性强，并且阴阳性结果区别明显，可通过颜色变化判读结果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物f3、b3和内引物fip、bip；所述f3的核苷酸序列如seqidno：1所示；所述b3的核苷酸序列如seqidno：2所示；所述fip的核苷酸序列如seqidno：3所示；所述bip的核苷酸序列如seqidno：4所示。

本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

优选的，所述试剂盒还包括10×buffer、bstdna聚合酶、稳定剂、mncl2、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚和depc水。

优选的，所述稳定剂为甜菜碱溶液；所述甜菜碱溶液中甜菜碱的浓度为4～6m。

优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

优选的，所述阳性对照品为非洲猪瘟病毒基因组dna；所述阴性对照品为双蒸水。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的非洲猪瘟病毒lamp检测中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)提取待测非洲猪瘟病毒的基因组dna；

2)以待测非洲猪瘟病毒dna的基因组dna为模板，利用权利要求1所述引物组中的外引物f3、b3和内引物fip、bip，进行lamp扩增反应，获得lamp扩增产物；

3)观察反应液颜色，若反应液呈黄色，检测为非洲猪瘟病毒阳性；若反应液呈橙红色，检测结果为非洲猪瘟病毒阴性。

优选的，步骤2)中所述lamp扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：待测非洲猪瘟病毒的基因组dna2μl，引物组5μl，10×buffer2.5μl，8ubstdna聚合酶1μl，稳定剂1.5μl，mncl21.25μl，4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚1.25μl和depc水10.5μl；

所述10×buffer包括以下终浓度的成分：dntps14mm，mgso420mm，tris-hcl200mm，(nh4)2so4100mm，100mmkcl；以2.5μl计，所述10×buffer还包括0.025μl的tween20；

所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物f3和b3的浓度独立为0.2μm，内引物fip和bip浓度独立为1.6μm；

所述lamp扩增反应的程序为：55～60℃恒温45～55min。

优选的，所述lamp扩增反应的程序为：58℃恒温50min。

本发明的有益效果：本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用，该试剂盒操作简单，对设备要求低，在检测时，只需将检测样品和检测反应液放入58℃恒温水浴锅中孵育50min后即可完成扩增。并且，本发明的试剂盒具有灵敏度高和特异性强的优点。此外，本发明通过肉眼观察反应液颜色变化判读结果，若反应液呈黄色，检测为非洲猪瘟病毒阳性；若反应液呈橙红色，检测结果为非洲猪瘟病毒阴性。本发明的方法直观方便，且可有效避免反应后开盖造成的气溶胶污染。

附图说明：

图1表示实施例2中非洲猪瘟病毒的lamp检测方法的特异性检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物f3、b3和内引物fip、bip；所述f3的核苷酸序列如seqidno：1所示；所述b3的核苷酸序列如seqidno：2所示；所述fip的核苷酸序列如seqidno：3所示；所述bip的核苷酸序列如seqidno：4所示。

本发明中，所述引物组针对非洲猪瘟病毒pa104r基因片段的6个特异性位点设计；所述pa104r的序列如seqidno：5所示。

本发明中，所述引物组用以定性检测纯非洲猪瘟病毒、病猪的脏器研磨液及血液中的非洲猪瘟病毒。

本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组；优选的还包括10×buffer、bstdna聚合酶、稳定剂、mncl2、4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚和depc水。

本发明中，所述引物组中外引物f3和b3的浓度独立优选为0.2μm；所述引物组中内引物fip和bip浓度独立优选为1.6μm。在本发明的具体实施过程中，所述引物组中的引物均由生工生物工程股份有限公司公司合成。

本发明中，所述稳定剂优选为甜菜碱溶液；所述甜菜碱溶液中甜菜碱的浓度为优选为4～6m，更优选为5m。

本发明中，所述bstdna聚合酶的使用浓度优选为8～10u/μl；所述bstdna聚合酶优选的购自于河南佰柯生物科技有限公司。

本发明中，所述mncl2的浓度优选为0.1～0.3m，更优选为0.2m；所述mncl2的作用是与显色剂(4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚)结合，使显色剂显橙红色。

本发明中，所述4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚的浓度优选为8～12mm，更优选为10mm；所述4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚的作用是作为显色剂。

本发明中，所述10×buffer优选为与上述方案所述bstdna聚合酶配套使用的10×buffer；所述10×buffer优选的购自于河南佰柯生物科技有限公司。

本发明的具体实施过程中，所述10×buffer优选的包括以下终浓度的成分：dntps1.4mm，mgso420mm，tris-hcl200mm，(nh4)2so4100mm，100mmkcl；以2.5μl计，所述10×buffer还包括0.0025μl的tween20。

本发明中，所述试剂盒中优选的还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为非洲猪瘟病毒基因组dna；所述阴性对照品为双蒸水。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的非洲猪瘟病毒lamp检测中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)提取待测非洲猪瘟病毒的基因组dna；

2)以待测非洲猪瘟病毒dna的基因组dna为模板，利用权利要求1所述引物组中的外引物f3、b3和内引物fip、bip，进行lamp扩增反应，获得lamp扩增产物；

3)肉眼观察反应液颜色，若反应液呈黄色，检测为非洲猪瘟病毒阳性；若反应液呈橙红色，检测结果为非洲猪瘟病毒阴性。

在本发明中，首先提取待测非洲猪瘟病毒的基因组dna。本发明对所述待测非洲猪瘟病毒的病毒类型没有特殊要求，任何病毒类型的非洲猪瘟病毒均可；本发明对所述待测非洲猪瘟病毒的基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的病毒基因组dna提取方法即可。

本发明在提取待测非洲猪瘟病毒的基因组dna后，以待测非洲猪瘟病毒的基因组dna为模板，利用上述方案所述引物组中的外引物f3、b3和内引物fip、bip，进行lamp扩增反应，获得lamp扩增产物；所述lamp扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：待测非洲猪瘟病毒的基因组dna2μl，引物组5μl，10×buffer2.5μl，8ubstdna聚合酶1μl，稳定剂1.5μl，mncl21.25μl，4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚1.25μl和depc水10.5μl。本发明中，所述lamp的设备优选为恒温水浴锅。

本发明中，所述引物组由以下终浓度的成分组成：外引物f3和b3的浓度独立为0.2μm，内引物fip和bip浓度独立为1.6μm。

本发明中，所述lamp扩增反应的程序优选为：55～60℃恒温45～55min，更优选为58℃恒温50min。

本发明在获得lamp扩增产物后，肉眼观察反应液颜色，若反应液呈黄色，检测为非洲猪瘟病毒阳性；若反应液呈橙红色，检测结果为非洲猪瘟病毒阴性。本发明利用反应液颜色检测lamp扩增结果的4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚与mn²⁺结合时，显橙红色；当反应呈阳性时，反应过程中产生大量焦磷酸，使金属离子沉淀，无金属离子结合的指示剂呈浅黄色。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecμlarcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecμlarcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。

实施例1一种利用lamp技术检测非洲猪瘟病毒的方法

检测过程严格分区操作

一区：试剂准备区----准备所需试剂

二区：样本制备区----待测样品及对照样品处理

三区：反应区-----扩增及结果分析

1、实验材料

感染非洲猪瘟病毒的病猪的脏器研磨液上清

2、基因组dna提取(二区进行)

1)取200μl脏器研磨液上清，在750μl全血中加入等量裂解缓冲液a，混匀，12000r/min离心30s，弃上清液。

2)用1.5ml裂解缓冲液a悬起沉淀，再重复离心1次，弃上清液。

3)用117μl裂解缓冲液b溶解沉淀，70℃作用5min，待冷却至55℃时加入3μl蛋白酶k，并保温1h消化细胞，95℃10min灭活蛋白酶k。

4)加入2mol/l的kcl溶液30μl，冰溶5min。

5)12000r/min离心5min，弃上清液得到dna模板，即获得病毒dna。其中：裂解缓冲液a由320mmol/l蔗糖、10mmol/ltris-hcl(ph7.6)、5mmol/lmgcl2和1％triton-x-100组成；裂解缓冲液b由10mmol/ltris-hcl(ph7.6)、1％sds组成；蛋白酶k(25mg/ml)，ddh2o配制，-20℃保存。

3、lamp扩增引物组

用于对非洲猪瘟病毒进行lamp检测的引物序列如下：

外引物f3：5’-3’caaaatgctttaaagcacaatca，如seqidno：1所示；

外引物b3：5’-3’tcatgaacaggtttcaatgc，如seqidno：2所示；

内引物fip：5’-3’

gcgagcaggtttagctttcac-gaagttattataccacccggaat，如seqidno：3所示；

内引物：bip5’-3’

ccataaccccgcaacaggag-acggctttatgttcaggc，

如seqidno：4所示；

上述引物由生工生物工程股份有限公司公司合成。

4、lamp扩增

试剂盒内反应液、引物、显色剂等使用前室温融化混匀。

设所需lamp反应管数为n(n＝样品数+1阳性对照+1阴性对照)，每管反应体系参见表1：

表1lamp反应体系

按每管所需量×n计算好各试剂用量，加入一洁净1.5mlep管中，混合均匀，2000r/min离心10s，向pcr8连管中分别加入23μl上述混合液。(一区进行)

移至二区加样。

向上述各管中按顺序加入阴性对照、待检测模板、阳性对照各2μl，盖紧管盖做好标记，移至反应区。

58℃恒温反应50min(三区进行)。

结果判断

取出反应管，冷却至室温，2000r/min离心10s，观察颜色变化。在阴性对照反应管液体为橙红色，阳性对照反应管呈浅黄色条件下：

待检测样品呈黄色，该样品结果为非洲猪瘟病毒阳性；

待检测样品呈橙色，该样品结果为非洲猪瘟病毒阴性；

若阴阳性对照反应结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

实施例2非洲猪瘟病毒的lamp检测方法的特异性检测

使用本发明实施例1中的试剂盒对非洲猪瘟病毒样品、猪蓝耳病毒、猪细小病毒样本、健康猪样本进行检测。

1)对非洲猪瘟病毒、蓝耳病毒、猪细小病毒感染的猪样本进行取样，取0.1g组织，在750μl全血中加入等量裂解缓冲液a，混匀，12000r/min离心30s，弃上清液。

2)用1.5ml裂解缓冲液a悬起沉淀，再重复离心1次，弃上清液。

3)用117μl裂解缓冲液b溶解沉淀，70℃作用5min，待冷却至55℃时加入3μl蛋白酶k，并保温1h消化细胞，95℃10min灭活蛋白酶k。

4)加入2mol/l的kcl溶液30μl，冰溶5min。

5)12000r/min离心5min，弃上清液做dna模板。即获得病毒dna。

其中：裂解缓冲液a由320mmol/l蔗糖、10mmol/ltris-hcl(ph7.6)、5mmol/lmgcl2和1％triton-x-100组成；裂解缓冲液b由10mmol/ltris-hcl(ph7.6)、1％sds组成；蛋白酶k(25mg/ml)，ddh2o配制，-20℃保存。

核酸扩增

试剂盒内反应液、引物、显色剂等使用前室温融化混匀。设所需lamp反应管数为n(n＝样品数+1阳性对照+1阴性对照)，每管反应体系参见表1。按每管所需量×n计算好各试剂用量，加入一洁净1.5mlep管中，混合均匀，2000r/min离心10s，向pcr8连管中分别加入23μl上述混合液(一区进行)。移至样品处理区加样。向上述各管中按顺序加入阴性对照、待检测模板、阳性对照各2μl，盖紧管盖做好标记，移至反应区。

58℃恒温反应50min(三区进行)。

结果参见图1，其中1表示健康猪样本(阴性对照)；2表示猪蓝耳病毒；3表示猪细小病毒样本；4表示非洲猪瘟样本。结果显示：只有非洲猪瘟样本显示为阳性结果，由反应前的橙红色变为黄色，其他几种样本显示为阴性结果，即橙红色。可见，本发明的试剂盒具有很强的特异性。

实施例3非洲猪瘟病毒的lamp检测方法的灵敏度检测

将非洲猪瘟病毒pa104r基因进行人工合成，由上海生工生物工程有限公司合成，连接至载体pmd18t中，转化大肠杆菌dh5a，挑取单克隆到液体培养基中，利用质粒提取试剂盒提取质粒，利用核酸蛋白分析仪测定od260数值，根据公式换算质粒拷贝数。

(6.02×10²³⁾×(ng/μl×10^-9)/(dnalength×660)＝copies/μl.

测定质粒拷贝数为5x10⁶copys/μl，对质粒进行10倍梯度稀释，浓度分别为5x10⁵、5x10⁴、5x10³、5x10²、5x10¹、5copies/μl，运用实施例1lamp检测方法，相同反应条件和反应体系，进行lamp灵敏度测试和pcr灵敏度测试，其中lamp方法可检测10copys以下样本，pcr方法只能检测出5x10²以上样本。可见，本发明的试剂盒具有很高的灵敏度。

由以上实施例可知，本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用，本发明的技术方案可实现在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检出非洲猪瘟病毒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>许昌佰柯蛋白与基因工程研究院有限公司

<120>一种用于非洲猪瘟病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caaaatgctttaaagcacaatca23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcatgaacaggtttcaatgc20

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gcgagcaggtttagctttcacgaagttattataccacccggaat44

<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccataaccccgcaacaggagacggctttatgttcaggc38

<210>5

<211>315

<212>dna

<213>africanswinefevervirus

<400>5

atgtcgacaaaaaaaaagcccacaattaccaagcaagagctttactccttagtagcggca60

gatacccagttaaataaagcattgattgaaagaatctttacaagccagcaaaaaataatc120

caaaatgctttaaagcacaatcaagaagttattataccacccggaatcaagttcaccgtc180

gttacagtgaaagctaaacctgctcgccagggccataaccccgcaacaggagagcctatt240

caaattaaagccaagcctgaacataaagccgtaaagatacgagcattgaaacctgttcat300

gatatgttaaattaa315