一种蓝莓花青素及其制备方法和应用与流程

本发明属于农产品深加工技术领域，提供了一种蓝莓花青素及其制备方法以及改善糖尿病患者多饮多尿、降血糖及降尿糖中的应用。

背景技术：

糖尿病是一种世界范围内高发的慢性疾病，目前我国已成为全球糖尿病患者第一大国。糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而引起机体糖、脂肪、水、蛋白质及电解质等一系列代谢紊乱的综合症，临床上以高血糖为主要特征，典型病例可出现多食、多饮、多尿及体型消瘦等表现，如不及时控制会导致肾、眼、神经及心血管等部位的慢性进行性病变，最终引起机体多系统功能缺陷及衰竭。糖尿病的发病机制十分复杂，大量研究表明，糖尿病的发生是机体糖、脂代谢异常的直接体现。

目前糖尿病主要通过药物治疗，糖尿病用药已经跃居全球药品销售第二位，仅次于肿瘤用药。据统计，在美国约85.3％的糖尿病患者采用胰岛素或者口服降糖药进行治疗。治疗糖尿病的药物除了胰岛素产品外，主要还包括glp-1受体激动剂、dpp-4抑制剂、sglt-2抑制剂类药物等，如专利(公开号cn106177958a，公开日2016年12月07日)公开了一种“包含dpp-4抑制剂(利拉列汀)任选地组合其它抗糖尿病药的抗糖尿病药物”，专利(公开号cn104906582a，公开日2015年9月16日)公开了一种“包含sglt2抑制剂、dpp-iv抑制剂和任选的另一种抗糖尿病药的药物组合物及其用途”，专利(公开号cn106492008a，公开日2017年3月15日)公开了“一种用于制备抗糖尿病肾病产品的中药组方及其制备方法和用途”。这类合成药物不仅会产生较强的依赖性，且多数都有着不同程度的副作用。因此寻找高效、安全的天然活性成分进行糖尿病防治已成为当前人们关注的焦点。

饮食也是控制糖尿病的途径之一。蓝莓是糖尿病患者能食用的少数水果之一。蓝莓(vacciniumspp.)，属于杜鹃花科越橘属，是一种具有极高经济价值的小浆果，被联合国粮农组织(fao)列为人类五大健康食品之一。蓝莓的保健作用主要源于其中的花青素类活性物质。研究证明蓝莓花青素是当今发现的最有效的纯天然抗氧化剂，有助于预防多种慢性疾病，具有较强的降血压、降血脂、抗突变、抗氧化、抗肿瘤等生理活性，并有助于改善糖尿病患者前期对胰岛素的敏感度。作为一种安全天然的多功能活性物质，蓝莓花青素在食品、保健品、医药等方面具有很大的开发潜力。通过简单高效的方法对蓝莓花青素进行提取纯化，并用于改善糖尿病症状的尝试，在营养与保健领域具有重要的理论价值和现实意义。

目前，蓝莓花青素的提取主要采用热回流提取法，这种方法不但效率低、耗时，而且提取得率低，溶剂消耗量大，提取时加热温度也较高，会引起热敏感性成分花青素的大量降解；微波辅助提取等新技术可有效改善蓝莓花青素的提取效率和纯度，但是也会由于局部温度过高导致花青素结构的破坏，且这些技术成本较高，不适合工业上大量生产。

现阶段市场上的蓝莓产品主要以原料的直接应用为主，蓝莓花青素的产品纯度往往比较低，杂质的存在会影响蓝莓花青素自身的稳定性及生理活性，因此，提高蓝莓花青素的纯度将有利于花青素的深入研究和开发应用。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述不足之处，使用酸化醇类萃取蓝莓中的花青素，采用树脂吸附法进行纯化，处理温度在60℃以下，有效保护花青素的稳定性，该方法简单易行，成本低，效率高，适合大量生产。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种蓝莓花青素，该蓝莓花青素是通过以下方法制备得到的：采用酸性乙醇溶液提取得到蓝莓花青素粗提物，再采用大孔树脂柱进行洗脱纯化，最后将纯化后的产品进行冷冻干燥。

上述采用酸性乙醇溶液提取蓝莓花青素的具体步骤如下：取兔眼蓝莓，破碎，加入体积浓度为50～95％的酸性乙醇溶液搅拌均匀，20～60℃条件下浸提，提取次数为1～3次，每次0.5～24小时，合并提取液后，过滤，滤液再真空浓缩得到蓝莓花青素粗提物；其中，兔眼蓝莓和体积浓度为50～95％的酸性乙醇溶液的比例为50～250g/l。

上述体积浓度为50～95％的酸性乙醇溶液中含有0.02～0.5％(v/v)的盐酸。

上述真空浓缩采用的温度为40-60℃。

上述采用大孔树脂柱进行洗脱纯化的具体步骤如下：将蓝莓花青素粗提物采用大孔树脂柱进行洗脱，上样量为0.1～0.5倍树脂柱体积，上样结束后，吸附0.5～24小时；然后用蒸馏水冲柱，弃洗脱液，再用体积浓度为50～95％的乙醇溶液洗脱3倍树脂体积，收集洗脱液，减压浓缩。

优选上样流速为0.5-1倍柱体积/小时，蒸馏水冲柱流速为0.5-1倍柱体积/小时，体积浓度为50～95％的乙醇溶液洗脱流速为0.5-1倍柱体积/小时。

优选上述大孔树脂柱采用的树脂型号为ab-8。由于蓝莓花青素的极性与ab-8大孔树脂的极性相似，在吸附过程中，蓝莓花青素的羟基易与ab-8大孔树脂形成氢键，使蓝莓花青素分子与ab-8大孔树脂紧密结合；此外，ab-8大孔树脂有较大的比表面积，使填料上具有较多的吸附位点，有利于蓝莓花青素的吸附。

上述蓝莓花青素的制备方法包括以下步骤：采用酸性乙醇溶液提取得到蓝莓花青素粗提物，再采用大孔树脂柱进行洗脱纯化，最后将纯化后的产品进行冷冻干燥。

上述蓝莓花青素的制备方法具体包括以下步骤：

(1)取兔眼蓝莓，粉碎，加入体积浓度为50～95％的酸性乙醇溶液搅拌均匀，20-60℃条件下浸提，提取次数为1-3次，每次0.5-24小时，合并提取液后，过滤，滤液在真空浓缩得到蓝莓花青素粗提物；其中，兔眼蓝莓和体积浓度为50～95％的酸性乙醇溶液的比例为50-250g/l；

(2)将蓝莓花青素粗提物采用大孔树脂柱进行洗脱，上样量为0.1～0.5倍树脂柱体积，上样结束后，吸附0.5～24小时；然后用蒸馏水冲柱，弃洗脱液，再用体积浓度为50～95％的乙醇溶液洗脱3倍树脂体积，收集洗脱液，减压浓缩；

(3)将采用大孔树脂柱纯化后的产品进行冷冻干燥。

上述蓝莓花青素在改善糖尿病患者多饮多尿症状方面应用具有显著的效果。

上述蓝莓花青素也可以应用于制备降血糖和降尿糖的药物。

与现有技术比较本发明的有益效果：

1)采用本发明提取方法得到的蓝莓花青素纯度高达76％以上，可作为改善糖尿病患者多饮多尿症状的药物原料，也可根据要求的不同应用于其它领域。

2)本发明采用柱层析方法和价格低廉的填料，成本低，适合大量生产，工业化前景好。特别是本发明创新性使用填料ab-8大孔树脂，不仅价格低廉，对花青素的吸附率和吸附量较高，能在短时间内达到解吸平衡，且解吸量也相对较大。

3)本发明方法制备蓝莓花青素，安全可靠，产品稳定，复溶性极佳，且易于保存。

附图说明

图1为真空冷冻干燥后的蓝莓花青素粉末照片；

图2为蓝莓花青素的高效液相色谱图；

图3为不同小鼠尿糖含量的变化；

图4为不同小鼠总胆固醇(t-cho)和甘油三酯(tg)含量的变化；

图5为不同小鼠血糖含量的变化；

图6为不同小鼠糖耐量的变化。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明。

实施例1

称取2500g兔眼蓝莓，放入搅拌机破碎后，加入10l体积浓度为95％的酸性乙醇溶液(盐酸浓度0.02％，v/v)搅拌均匀，常温条件下浸提24小时，该提取过程重复2次，合并两次提取液后真空抽滤并且收集滤液，在45℃下真空浓缩至500ml，得到的紫红色浓缩液即为蓝莓花青素粗提物。

将预处理好的ab-8大孔树脂填入层析柱中，用蒸馏水灌柱，液面高于填料1cm，采用逆流灌注的方法除去层析柱内的气泡。使用胶头滴管吸取500ml上述蓝莓花青素粗提物，上样量为0.5倍树脂柱体积，缓缓沿柱壁加入层析柱中，同时用玻璃棒引流，遵循缓滴慢流的原则，防止因流速过高、冲击力过大导致柱材松散。至上样结束后，吸附24h，用3倍树脂体积的蒸馏水冲柱洗脱果胶、蛋白质等杂质，再用3倍树脂体积的体积分数为95％的乙醇溶液洗脱吸附在树脂上的蓝莓花青素，收集洗脱液，再在45.0℃下减压浓缩，最后经冷冻干燥得到蓝莓花青素粉末，冷阱温度-40℃，冷冻干燥24h。

实施例2

将500g兔眼蓝莓冻果洗净匀浆后，加入5l体积分数为80％的酸性乙醇溶液(含0.1％盐酸，v/v)，于30℃水浴条件下进行超声辅助浸提，提取1次，提取时间为40分钟。提取液经200目滤布过滤，滤液真空浓缩至250ml得到蓝莓花青素粗提物。

将蓝莓花青素粗提物上500mm×50mm大孔树脂柱，树脂型号为ab-8，蓝莓花青素粗提物上样量为0.1倍树脂柱体积，上样结束后，吸附时间12小时。然后用蒸馏水冲柱，洗脱3倍树脂体积，当流出液澄清后，弃洗脱液，以3倍树脂体积，体积分数为80％的乙醇溶液为洗脱剂洗脱树脂柱，流速为1l/小时，收集洗脱液，真空浓缩后经冷冻干燥得到纯化的蓝莓花青素粉末，冷阱温度-40℃，冷冻干燥24h。

试验例1以下通过药效试验对本发明进行进一步说明：

选择雄性c57bl/6j小鼠用于造模，腹腔注射stz(链脲佐菌素)130mg/kg。给药前空腹12h，自由饮水。给药后72h测空腹血糖，高于11.0mmol/l即造模成功。选取稳定成模的小鼠，舍弃不稳定及不成功的小鼠。

方法：将糖尿病小鼠随机分为三组，分别为正常组、糖尿病模型组和蓝莓花青素组。蓝莓花青素组小鼠以400mg/kg蓝莓花青素的剂量灌胃给药，每周连续灌胃6天，第7天测定小鼠血糖含量的变化，连续灌胃5周。连续灌胃5周后，测定小鼠尿糖含量、总胆固醇(t-cho)和甘油三酯(tg)含量及糖耐量的变化。正常组和糖尿病模型组以相同体积的溶剂灌胃给药。具体结果见表1-4，图3-6。

表1不同小鼠尿糖含量的变化

表2不同小鼠总胆固醇(t-cho)和甘油三酯(tg)含量的变化

表3不同小鼠血糖含量的变化[血糖(mmol/l)]

表4不同小鼠糖耐量的变化[糖耐量(mmol/l)]

结果：采用本发明方法制备的蓝莓花青素进行灌胃，可明显减少糖尿病小鼠尿量，减轻多尿症状，并降低糖尿病小鼠尿糖、血糖、糖耐量、总胆固醇及甘油三酯等糖脂代谢相关指标的水平.。

试验例2检测花青素粉末的溶解性

粉末溶解性测定方法：准确称取按照实施例1方法制备得到的0.1g蓝莓花青素粉末样品，溶解到10ml去离子水中，室温下搅拌30min。8000r/min离心10min，测定干燥后的不溶性杂质质量，计算蓝莓花青素粉末溶解性。将实施例1方法制备得到的蓝莓花青素粉末复溶于水中，溶解性>95％，产品见图1。

试验例3检测花青素粉末中矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量

将按照试验例2方法溶解的蓝莓花青素过0.45微米微孔滤膜，经高效液相色谱测定，以主要成分矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品定量。

高效液相色谱条件：

色谱柱：zorbaxsb-c18反相柱(250mm×4.6mm,5μm)

柱温：20℃

进样量：10μl

检测波长：280nm，320nm，360nm，520nm

流动相a：1％磷酸溶液

流动相b：100％乙腈

流速：0.8ml/min

梯度洗脱程序：

结果：测得蓝莓花青素的纯度为76.76％(详见图2)。