金针菇多糖FVP的制备方法及其应用与流程

本发明涉及多糖活性的技术领域，更具体地说，本发明涉及一种金针菇多糖fvp的制备方法及其应用。

背景技术：

多糖是构成生命的重要物质之一，普遍存在于植物体中，大部分多糖具有生物活性，可以通过多个方向对免疫系统发挥调节作用。金针菇(flammulinavelutiper)又名构菌、冻菌、智力菇，富含蛋白质、碳水化合物、矿物质元素、纤维素和粗纤维，含脂肪较低，是一种不可多得的高营养食品。在我国分布十分广泛，其产量位于食用菌产量第4位，工厂化比例已达33％，具有极高的水准。而金针菇多糖是金针菇的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、保肝、抗氧化、辅助改善记忆、抗感染、抗疲劳以及保湿等作用。

炎症性肠病(inflammatoryboweldisease：ibd)是一种慢性、复发性疾病状态，该病的患病率在国内外均有逐年增加的趋势。ibd的传统治疗药物主要包括类固醇类和水杨酸类药物，这些药物具有极大的副作用，特别是类固醇类，它可以引起不育和发育性迟缓等严重不良反应。因此，积极寻找无毒副作用的药物成为现在研究的热点。有研究表明，ibd发生时，肠道内短链脂肪酸的合成减少，肠道菌群失调，益生菌数量减少，有害菌数量增加。燕麦多糖和香菇多糖能够减轻ibd的病理损伤、减少促炎因子的生成。对金针菇菇脚(fvs)的研究发现，在肉鸡日粮中添加fvs可显著提高肉鸡盲肠内容物中菌群多样性，益生菌(乳酸菌、双歧杆菌)数量明显增加，病原微生物(沙门菌、大肠杆菌)数量显著下降。同时，fvs能够显著增加肉鸡盲肠内容物中短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量。目前，有关金针菇多糖fvp在减轻ibd的病理损伤方面尚未见到相关报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种金针菇多糖fvp的制备方法，通过水提、醇沉及纯化获得金针菇多糖fvp，并且可减少浸提时间以及提高多糖的收率。

本发明还有一个目的是提供一种金针菇多糖fvp的应用，可应用于制备防治结肠炎的药物和/食品、提高肠道内短链脂肪酸含量的制剂以及调节肠道内菌群结构的制剂中。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种金针菇多糖fvp的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将金针菇子实体干燥粉碎后与30-40倍体积水混合，再按质量浓度为0.1-0.3％添加果胶酶，于40-50℃下酶解1-2h后，采用高温和冷冻交替处理方式浸提多糖，获得粗多糖水提液；

步骤2：所得粗多糖水提液与质量分数为95％的乙醇混合均匀，在0-10℃下静置20-32h后，离心，收集沉淀物并干燥，获得第一多糖干品；

步骤3：将所得第一多糖干品依次进行deae-琼脂糖凝胶ff层析和g-100葡聚糖凝胶层析，获得金针菇多糖fvp。

优选的是，步骤1中所述金针菇子实体干燥粉碎，其为新鲜的金针菇子实体清洗后，在40-60℃烘干至恒重，再粉碎过80-120目筛子；

所述高温和冷冻交替处理方式，具体包括以下步骤：金针菇子实体酶解后，在95-100℃条件下处理30-60min，过滤分离滤渣和上清液，立即将滤渣放入-20--10℃条件下冷冻1-2h；取出冷冻后的滤渣与30-40倍体积的水混合，在95-100℃条件浸提30-60min，过滤收集上清液，将两次过滤得到的上清液合并，即得粗多糖水提液。

优选的是，所述步骤1之后和步骤2之前还包括脱蛋白，所述脱蛋白具体包括以下步骤：

将所得粗多糖水提液按体积比1:1-3与sevag试剂混合，剧烈震荡20-30min，再于3000-5000r/min下离心20-50min，弃沉淀得上清液，再重复5-10次，多次所得的上清液合并，获得脱蛋白的粗多糖水提液；其中，所述sevag溶剂由体积比为3-5:1的氯仿：正丁醇构成。

优选的是，步骤2中离心条件为：3000-3500r/min下离心20-30min；干燥条件为：所述沉淀物在30-50℃下干燥至恒重。

优选的是，步骤3中所述deae-琼脂糖凝胶ff层析具体包含以下方法步骤：将所述第一多糖干品配置成5-15mg/ml的溶液，上样于deae-琼脂糖凝胶ff离子柱，用0-2mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱的多糖组分，将所收集的多糖组分用3000-5000da的透析袋透析40-50h后，真空冷冻干燥，获得第二多糖干品；

所述g-100葡聚糖凝胶柱层析具体包括以下方法步骤：将所述第二多糖干品上样于g-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，将所收集的多糖组分用3000-5000da的透析袋透析40-50h后，浓缩，再真空冷冻干燥，即得金针菇多糖fvp。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp的制备方法制得的金针菇多糖fvp。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备防治结肠炎的药物和/或食品中的应用。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备提高肠道内短链脂肪酸含量的制剂中的应用。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备调节肠道内菌群结构的制剂中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明将金针菇子实体干燥粉碎后先用果胶酶酶解，初步破坏组织间质中的胞间交联结构，有利于促进组织内的化学物质释放出来，可减少了多糖的沉淀增加多糖的得率，再结合高温和低温交替的方式，对多糖得以充分浸提，浸提后的多糖经醇沉后，通过deae-琼脂糖凝胶ff层析及g-100葡聚糖凝胶柱层析纯化可以将其中杂质成分去除并脱色，此制备方法经水提、醇沉以及离子交换纯化制得金针菇多糖fvp，所用原料容易获得，工艺流程简单，产品质量容易得到有效控制，有利于进行大批量的生产，并且通过酶解结合高温和冷冻交替处理酶解液的方式浸提多糖，最后使得多糖的收率从14.53％提高到26.38％。

本发明制备得到的金针菇多糖fvp具有较强的生理活性，在提高肠道内短链脂肪酸含量以及调节肠道内菌群结构方面表现出相关性，进而通过调节肠道内短链脂肪酸的含量以及菌群的多样性和丰富度可缓解结肠炎，因此，金针菇多糖fvp应用于制备防治结肠炎的药物和/或食品中具有可行性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的金针菇多糖fvp对大鼠肠道菌群在门水平的影响；

图2为本发明所述的金针菇多糖fvp对大鼠结肠组织的影响；

图3为本发明所述的金针菇多糖fvp中剂量组及高剂量组同模型组样本的lefse分析结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种金针菇多糖fvp的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将金针菇子实体干燥粉碎后与30-40倍体积水混合，再按质量浓度为0.1-0.3％添加果胶酶，于40-50℃下酶解1-2h后，采用高温和冷冻交替处理方式浸提多糖，获得粗多糖水提液；

步骤2：所得粗多糖水提液与质量分数为95％的乙醇混合均匀，在0-10℃下静置20-32h后，离心，收集沉淀物并干燥，获得第一多糖干品；

步骤3：将所得第一多糖干品依次进行deae-琼脂糖凝胶ff层析和g-100葡聚糖凝胶层析，获得金针菇多糖fvp。

在上述方案中，本发明将金针菇子实体干燥粉碎后与30-40倍体积水混合会先用果胶酶酶解，初步破坏组织间质中的胞间交联结构，有利于促进组织内的化学物质释放出来，可减少多糖的沉淀增加多糖的得率，再结合高温和低温交替的方式，对多糖得以充分浸提，浸提后的多糖经醇沉后，得到的沉淀物经处理后再经deae-琼脂糖凝胶ff层析及g-100葡聚糖凝胶柱层析纯化可以将其中杂质成分去除并脱色。此制备方法将金针菇子实体经水提、醇沉以及离子交换纯化制得金针菇多糖fvp，所用的原料容易获得，工艺流程简单，产品质量容易得到有效控制，有利于进行大批量的生产，并且通过酶解结合高温和冷冻交替处理酶解液的方式浸提多糖，再经纯化最后得到的多糖收率从14.53％提高到26.38％。

一个优选方案中，步骤1中所述金针菇子实体干燥粉碎，其为新鲜的金针菇子实体清洗后，在40-60℃烘干至恒重，再粉碎过80-120目筛子；

所述高温和冷冻交替处理方式，具体包括以下步骤：金针菇子实体酶解后，在95-100℃条件下处理30-60min，过滤分离滤渣和上清液，立即将滤渣放入-20--10℃条件下冷冻1-2h；取出冷冻后的滤渣与30-40倍体积的水混合，在95-100℃条件浸提30-60min，过滤收集上清液，将两次过滤得到的上清液合并，即得粗多糖水提液。

在上述方案中，金针菇子实体酶解后，破坏了组织间质中的胞间交联结构，使得组织内的化学物质得以的释放，然后通过沸水浸提可以使细胞得到进一步破坏继续释放多糖及蛋白质等化学物质，浸提30-60min后过滤，将滤渣快速放进入-20--10℃，优选在-20℃条件下冷冻1-2h，可以是部分破坏或者未破坏的细胞利用冰碴刺破，冷冻后与水混合再于沸水中浸提，以使金针菇子实体的细胞得到充分的破坏，以使多糖得到充分的浸提，此方式比常规的单纯高温浸提相比缩短了浸提时间，还增加多糖的得率。

一个优选方案中，所述步骤1之后和步骤2之前还包括脱蛋白，所述脱蛋白具体包括以下步骤：

将所得粗多糖水提液按体积比1:1-3与sevag试剂混合，剧烈震荡20-30min，再于3000-5000r/min下离心20-50min，弃沉淀得上清液，再重复5-10次，多次所得的上清液合并，获得脱蛋白的粗多糖水提液；其中，所述sevag溶剂由体积比为3-5:1的氯仿：正丁醇构成。

在上述方案中，用sevag溶剂脱蛋白，优选氯仿：正丁醇为4:1，可以去除金针菇子实体内的蛋白质以及多余的果胶酶。

一个优选方案中，步骤2中离心条件为：3000-3500r/min下离心20-30min；干燥条件为：所述沉淀物在30-50℃下干燥至恒重。

在上述方案中，脱蛋白并经醇沉后，离心收集沉淀物，并将沉淀物在30-50℃下干燥至恒重，以便计算收率，收率＝第一多糖干品重量(g)/金针菇子实体重量(g)*100％，(金针菇子实体重量指经干燥粉碎后的重量)。

一个优选方案中，步骤3中所述deae-琼脂糖凝胶ff层析具体包含以下方法步骤：将所述第一多糖干品配置成5-15mg/ml的溶液，上样于deae-琼脂糖凝胶ff离子柱，用0-2mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱的多糖组分，将所收集的多糖组分用3000-5000da的透析袋透析40-50h后，真空冷冻干燥，获得第二多糖干品；

所述g-100葡聚糖凝胶柱层析具体包括以下方法步骤：将所述第二多糖干品上样于g-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，将所收集的多糖组分用3000-5000da的透析袋透析40-50h后，浓缩，再真空冷冻干燥，即得金针菇多糖fvp。

以下将以具体实施例对金针菇多糖fvp的制备方法加以说明。

实施例1

现有技术金针菇fvp的制备方法，包括：金针菇干燥粉碎后与20倍体积水混合，在100℃下回流提取3次，每次2h，过滤，合并多次得到的上清液浓缩至100ml；用体积比为5:1的氯仿：丁醇脱蛋白5次，获得脱蛋白的多糖溶液，再将所得脱蛋白的多糖溶液用体积分数为95％的乙醇混合，4℃下过夜，离心收集沉淀物，再将所得沉淀物进行真空冷冻干燥，获得多糖干品；所得多糖干品用deae-琼脂糖凝胶ff层析，用蒸馏水和nacl溶液(0.05m、0.1m、0.2m、0.3m和0.5m)作为洗脱液进行梯度洗脱，收集蒸馏水洗脱部分的多糖，即得金针菇多糖fvp，其中用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。

现有技术中多糖收率为14.53％。

本发明金针菇多糖fvp的制备方法，包括：

1)取新鲜的金针菇子实体清洗，在45℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过100目筛子，按重量份数计，取50份粉碎的金针菇子实体与30倍体积水混合，按质量浓度为0.1％添加果胶酶，在40℃下酶解1h，获得酶解液；

2)所得酶解液在95℃条件下处理30min过滤，立即将滤渣放入-20℃条件下冷冻1h；取出冷冻后的滤渣与30倍体积的水混合，在95℃条件浸提30min，过滤，将两次过滤得到的上清液合并，获得粗糖水提液；

3)所得粗多糖水提液按体积比1:1与体积比为3:1的氯仿：正丁醇混合，剧烈震荡30min，再于4000r/min下离心30min，弃沉淀得上清液，再重复5次，多次所得的上清液合并即得脱蛋白的粗多糖水提液；

4)所得脱蛋白的粗多糖水提液与4倍体积的体积分数为90％无水乙醇混合，在4℃下静置24h后，在3200r/min下离心20min，收集沉淀物，将所得沉淀物在45℃下干燥至恒重，获得第一多糖干品。

5)将所得第一多糖干品配置成10mg/ml的溶液，上样于deae-琼脂糖凝胶ff离子柱，用1mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱的多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，真空冷冻干燥，即得第二多糖干品；

所述g-100葡聚糖凝胶柱层析具体包括以下方法步骤：将所述第二多糖干品上样于g-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，浓缩，再真空冷冻干燥，即得到金针菇多糖fvp。

此实施例中收率为18.72％。

实施例2

金针菇多糖fvp的制备方法，包括：

1)取新鲜的金针菇子实体清洗，在45℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过100目筛子，按重量份数计，取50份粉碎的金针菇子实体与40倍体积水混合，按质量浓度为0.3％添加果胶酶，在50℃下酶解2h，获得酶解液；

2)所得酶解液在100℃条件下处理60min过滤，立即将滤渣放入-20℃条件下冷冻1h；取出冷冻后的滤渣与40倍体积的水混合，在100℃条件浸提60min，过滤，将两次过滤得到的上清液混合，获得粗糖水提液；

3)所得粗多糖水提液按体积比1:3与体积比为5:1的氯仿：正丁醇混合，剧烈震荡30min，再于4000r/min下离心30min，弃沉淀得上清液，再重复10次，多次所得的上清液合并，获得脱蛋白的粗多糖水提液；

4)所得脱蛋白的粗多糖水提液与4倍体积的体积分数为95％无水乙醇混合，在4℃下静置24h后，在3200r/min下离心20min，收集沉淀物，将所得沉淀物在45℃下干燥至恒重，即得第一多糖干品。

5)将所得第一多糖干品配置成10mg/ml的溶液，上样于deae-琼脂糖凝胶ff离子柱，用1mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱的多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，真空冷冻干燥，即得第二多糖干品；

所述g-100葡聚糖凝胶柱层析具体包括以下方法步骤：将所述第二多糖干品上样于g-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，浓缩，再真空冷冻干燥，即得到金针菇多糖fvp。

此实施例中收率为20.78％。

实施例3

金针菇多糖fvp的制备方法，包括：

1)取新鲜的金针菇子实体清洗，在45℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过100目筛子，按重量份数计，取50份粉碎的金针菇子实体与35倍体积水混合，按质量浓度为0.2％添加果胶酶，在45℃下酶解2h，获得酶解液；

2)所得酶解液在100℃条件下处理40min过滤，立即将滤渣放入-20℃条件下冷冻1h；取出冷冻后的滤渣与35倍体积的水混合，在100℃条件浸提40min，过滤，将两次过滤得到的上清液混合，获得粗糖水提液；

3)所得粗多糖水提液按体积比1:2与体积比为4:1的氯仿：正丁醇混合，剧烈震荡30min，再于4000r/min下离心30min，弃沉淀得上清液，再重复6次，多次所得的上清液合并即得脱蛋白的粗糖水提液；

4)所得脱蛋白的粗糖水提液与4倍体积的体积分数为95％无水乙醇混合，在4℃下静置24h后，在3200r/min下离心20min，收集沉淀物，将所得沉淀物在45℃下干燥至恒重，即得第一多糖干品。

5)将所得第一多糖干品配置成10mg/ml的溶液，上样于deae-琼脂糖凝胶ff离子柱，用1mol/lnacl溶液洗脱，收集洗脱的多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，真空冷冻干燥，即得第二多糖干品；

所述g-100葡聚糖凝胶柱层析具体包括以下方法步骤：将所述第二多糖干品上样于g-100葡聚糖凝胶柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖组分，将所收集的多糖组分用3000da的透析袋透析48h后，浓缩，再真空冷冻干燥，即得到金针菇多糖fvp。

此实施例中收率为26.38％。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp的制备方法制得的金针菇多糖fvp。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备防治结肠炎的药物和/或食品中的应用。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备提高肠道内短链脂肪酸含量的制剂中的应用。

本发明还提供一种所述的金针菇多糖fvp在制备调节肠道内菌群结构的制剂中的应用。

本发明还将纯化后的金针菇多糖fvp通过动物实验验证fvp对大鼠急性结肠炎的干预效果。

实施例4

金针菇多糖fvp对大鼠急性结肠炎的干预试验

1)实验材料

sd大鼠，雄性，8周至9周龄，体重170-200g。正式实验前适应一星期，饲养环境：specificpathogenfree(spf)级；动物室温度：22-25℃，相对湿度：55-70％；12h开灯和关灯循环，饲养标准动物饲料，自由摄食饮水。

2)实验分组

48只sd大鼠随机分为6个组，每组8只：正常组(ng)、模型组(mg)、金针菇多糖fvp低剂量组(50mg/kg，lpg)、中剂量组(100mg/kg，mpg)和高剂量组(200mg/kg，hpg)和阳性药物组(5-氨基水杨酸即5-asa100mg/kg，apg)。

3)实验方法

ng组，正常饮水，每天灌胃同体积蒸馏水。

mg组第一至六天正常水，第七天饮水改为5％硫酸葡聚糖(dss)，同时每天灌胃同体积蒸馏水。

lpg组、mpg组和hpg组，第一至六天正常饮水，第七天饮水改为5％dss，同时每天灌胃相应剂量的金针菇多糖fvp。

ap组第一至六天正常饮水，第七天饮水改为5％dss。

同时以上六组大鼠每天灌胃5-asa，每天灌胃体积为0.1ml/10g。第15天实验结束，将所有动物用水合氯醛麻醉后，采集腹主动脉血，分离血清；收集大鼠结肠组织进行病理检测；同时，收集结肠内容物进行肠道菌群测序、盲肠内容物进行短链脂肪酸的测定。

4)实验结果：正常组大鼠结肠外观正常，未见充血，成形颗粒样粪便。与正常组比较，模型组大鼠结肠缩短，结肠黏膜水肿充血、有血便。同模型组比较，多糖组(低、中、高剂量)和阳性药物组的结肠水肿和血便情况有不同程度减轻。

实施例5

大鼠结肠组织病理检测

1)实验方法

取大鼠结肠组织0.5cm，于质量分数为10％中性甲醛中固定，采用常规石蜡包埋，制片，用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色，在显微镜下观察变化。

2)实验结果

如图2所示，正常组大鼠结肠黏膜完整，黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层结构清晰。模型组大鼠结肠黏膜上皮受损，未见分层结构、杯状细胞缺失，可见大量炎性细胞浸润。同模型组比较，金针菇多糖fvp不同剂量组和阳性药物组大鼠黏膜结构基本完整，可见少量炎性细胞浸润。

实施例6

金针菇多糖fvp对大鼠短链脂肪酸生成影响的实验

1)实验方法

a:取1g盲肠内容物，加入1ml蒸馏水，置于1.5mlep管中，在漩涡混匀器上混合均匀，超声10min后，再于4℃、13000rpm下离心10min；

b:取上清(加入内标)，置于4mlep管中；

c:加入10ul50％的硫酸溶液；

d:加入0.5g无水硫酸钠，漩涡混匀；

e:加入2ml乙醚；

f：6000r/min离心10min；

g:取1.5ml放在进样瓶中，即可在气相色谱仪上进样，检测乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸6种短链脂肪酸。

其中，气相色谱仪型号(agilent6890)，用tg-waxms色谱柱30m×0.25mm×0.25um(thermo)。进样口温度：250℃；进样量：1.0μl；进样方式：不分流进样；柱温：90℃保持1min，以20℃/min升至210℃，保持2分钟；载气：he，载气流速1.0ml/min。

2)实验结果

如表1所示，金针菇多糖fvp对短链脂肪酸的影响同正常组比较，模型组大鼠盲肠内容物短链脂肪酸均下降，其中乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸显著下降，差异有统计学意义(p<0.05)。给予金针菇多糖fvp后，各处理组大鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量均出现不同程度的升高，以乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸的变化尤为明显，中剂量(100mg/kg)和高剂量(200mg/kg)金针菇多糖fvp都显著提高了其含量。

此结果表明金针菇多糖fvp对大鼠急性结肠炎的改善作用可能是通过提高肠道内短链脂肪酸的含量而实现的。

表1不同处理组肠道内容物中scfas的含量

注：n为正常组，m为模型组，lp为低浓度组，mp为中浓度组，hp为高浓度组，ap为阳性药物组，*，p<0.05,m组与n组比较；#，p<0.05，多糖组、ag组与m组比较。

实施例7

金针菇多糖fvp对大鼠肠道菌群影响的实验

1)实验方法

a:取每只实验大鼠结肠内容物1.0g，根据qiaampdnastoolminikit的操作说明，进行样品基因组dna的提取，并采用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度。

b:将所得dna样品保存于-20℃备用；合成带有barcode的特异引物，扩增16srdna基因v3-v4可变区域。

其中，扩增时采用bio-radt100梯度pcr仪，进行pcr扩增；

pcr扩增程序：98℃预变性1min；共30个循环(包括:变性98℃，10s；退火50℃，30s；延伸72℃，30s)；终末延伸72℃，5min。根据pcr产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1×tae浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化pcr产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，割胶回收目标条带。

注：产物纯化试剂盒使用的是thermoscientific公司genejet胶回收试剂盒；对测序结果进行深入的生物信息分析之前，先对数据进行去杂化过滤。

d:使用flash软件，对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即rawtags。使用质量控制软件，对拼接得到的rawtags进行过滤，得到高质量tags数据(cleantags),再件鉴定并去除嵌合体序列，得到有效数(effectivetags)，用于后续生物信息学的分析。

e:利用qiime软件对tags在97％的相似水平下优化序列进行otu(operationaltaxonomicunits)聚类分析和物种分类分析。对每个otu的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。分析了每个样品在门、纲、目、科、属等不同分类水平的优势类群。通过qiime和r软件对单样本的多样性和样本之间的多样性进行分析。

2)实验结果

a:各样本在97％相似水平下的稀释曲线趋向平坦，说明测序数据量合理，测序深度可靠。

b:如图1所示，通过对各组别的样本在“门”水平肠道菌群多样性进行分析，从图中可以看出，各组别大鼠结肠内容物优势菌群(排在前三位)均为厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes))和变形菌门(proteobacteria)，后壁菌门(f)在各组中所占的比例均最大，其次是拟杆菌门(b)。各组f/b值差异较大，同正常组(3.33±2.18)相比，模型组f/b值(1.62±0.29)下降。给予多糖后，f/b值有不同程度的回升，以中剂量组(4.24±1.29)尤为显著，同模型组相比，差异具有显著性(p<0.05)。

c:如表2所示，同正常组比较，模型组丰富度(以ace和chao指数表示)和多样性指数(以shannon指数表示)明显下降，差异有统计学意义(p<0.05)。给予金针菇多糖fvp后，菌群丰富度指数和多样性指数均有不用程度的提升，以低剂量组尤为显著(p<0.05)。说明金针菇多糖fvp在增加大鼠肠道内容物菌群丰富度和多样性方面具有明显效果。

表2各组别大鼠结肠内容物菌群丰富度及多样性指数比较

注：n为正常组，m为模型组，lp为低浓度组，mp为中浓度组，hp为高浓度组，ap为阳性药物组，*，p<0.05,m组与n组比较；#，p<0.05，多糖组、ag组与m组比较。

d:如图3所示，从金针菇多糖fvp高剂量、中剂量组同模型组样本的ldaeffectsize分析结果可见，同模型组比较，多糖处理后肠道乳酸菌数量显著增加(p<0.05)，说明金针菇多糖fvp可能通过增加急性结肠炎大鼠肠道内益生菌数量，从而达到减轻结肠炎的病理损伤，进而在防治结肠炎方面具有明显功效。

另外本发明还包括对制备的金针菇多糖fvp进行的结构、成分及图谱分析。

1、金针菇多糖fvp相对分子量的测定

1.1色谱条件

通过高效凝胶渗透色谱法测定金针菇多糖fvp分子量的分布，在图谱中可见到单一洗脱峰，洗脱峰处的分子量为54.78kda。

2、金针菇多糖fvp单糖组成分析分析

称取10mg金针菇多糖fvp于安培瓶中，加入浓度为2mol/l三氟乙酸(tfa)4ml，将安瓿瓶封口后置于110℃条件下水解6小时。水解液冷却至室温后，加入适量的甲醇，混合均匀后，减压浓缩至干，再加入适量的甲醇，混匀，减压浓缩至干，重复5次以完全去除残留的tfa。

2.1单糖的衍生化

向干燥后的金针菇多糖fvp水解物中加入10mg盐酸羟胺、1.0ml吡啶和1mg肌醇六乙酰酯，置于90℃条件下震荡反应30min。反应完成后冷却至室温，加入醋酸酐0.5ml，于90℃条件下进行35min的乙酰化反应，产物为糖腈乙酸酯衍生物。单糖标准品(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖)也按照上述步骤进行衍生化，得到单糖气相衍生物。上述得到的单糖气相衍生物过0.22μm微孔滤膜，接着可按照气相色谱条件进行金针菇多糖fvp的单糖组成分析。

2.1.1gc色谱条件

1)色谱仪：agilent7890a气相色谱仪；(2)色谱柱：hp-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；(3)载气：氮气，流速25ml/min；空气流速为450ml/min，氢气流速为25ml/min，不分流。(4)升温过程：初始温度为100℃，以3℃/min速度升温至160℃后，再以10℃/min升温至250℃，并保持恒温5min；(5)检测器：fid检测器，温度为250℃；进样量为1.0μl。

2)单糖标准品、内标物肌醇和金针菇多糖fvp经三氟乙酸水解和衍生化后，通过气相色谱分析，得到色谱图。

2.1.2实验结果

由单糖标准品色谱图分析，色谱峰按照保留时间从小到大的顺序，对应的单糖为鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及内标物肌醇。

由金针菇多糖fvp色谱图分析，通过比较单糖标准品气相色谱图和金针菇多糖fvp气相色谱图，推断出金针菇多糖fvp主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。根据内标法计算出这三种单糖的摩尔百分比为：甘露糖(7.74％)、葡萄糖(70.41％)和半乳糖(16.38％)。

3、金针菇多糖fvp紫外光谱分析

3.1实验方法

称取1mg金针菇多糖fvp，溶解于蒸馏水中，配制成1mg/ml的溶液，以蒸馏水为空白对照，于200-800nm波长范围内进行紫外全扫描。

3.2实验结果

紫外光谱图显示在波长为280nm处没有出现吸收峰，表明金针菇多糖fvp没有蛋白成分。

4、金针菇多糖fvp红外图谱分析

4.1实验方法

称取2mg金针菇多糖fvp，加入适量的溴化钾(kbr)粉末，混合均匀后进行研磨，研磨后再进行压片。将制好的压片放入傅里叶变换红外光谱仪(ft-ir)内进行扫描，扫描区间为400-4000cm-1。采集样品的红外吸收图谱，通过nexus系统软件对图谱进行分析。

4.2实验结果

金针菇多糖fvp的红外光谱图在3398.4cm-1处出现一个强的吸收峰，属于多糖糖链中非游离o-h的特征吸收峰。在2932.8cm-1处出现的峰是c-h伸缩振动引起的吸收峰，属于多糖类物质的特征吸收峰。1617.6cm-1处出现的峰可能是糖的水合物吸收峰。1421.1cm-1处出现的峰属于h-o变角振动和c-h伸缩振动引起的吸收峰。研究表明，在1010-1100cm-1范围内有3个吸收峰的多糖为吡喃糖，在1010-1100cm-1范围内有2个吸收峰的多糖为呋喃糖。红外光谱图显示，在1010-1100cm-1范围内有2个吸收峰，说明是呋喃糖。

5、金针菇多糖fvp核磁共振波谱分析

5.1实验方法

称取25mg金针菇多糖fvp溶于0.5ml重水中，混合均匀。通过核磁共振仪进行氢谱和碳谱的分析。

5.2实验结果

金针菇多糖fvp碳谱中可以看到，在δ95.0～110ppm之间有信号峰，属于d-葡萄糖、d-半乳糖和l-甘露糖的异头碳信号，该结果同前面所述单糖组成测定结果一致。在60.45-75.52ppm范围内出现强信号，表明金针菇多糖fvp中有较多的c6位连接的葡萄糖,该结果也与单糖组成测定结果一致。

金针菇多糖fvp氢谱可以看到，在4.39-5.20ppm之间出现强信号峰，提示有α-型葡萄糖。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与与描述的图例。