本发明涉及花青素提取技术，具体为一种从山竹果皮中提取花青素的制备方法。
背景技术：
现代研究证实花青素有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、保护心血管、降压、抗炎等多种生物活性，对80多种疾病具有直接或间接的预防、治疗作用，且尚未发现有毒副作用，在医药、保健品和化妆品等领域有着广泛的用途。山竹又称莽吉柿、凤果、倒稔子，属藤黄科藤黄属，是热带多年生常绿果树，山竹果实柔软多汁，甜而略带酸味，被誉为“果中皇后”。山竹果皮紫褐色，厚度为0.8～1.1cm，占鲜果干重的52%～68%是少数几种厚皮果实之一。山竹以鲜食为主，食用后产生的占单果鲜重的52%～68%的果皮被当作生活和工业废弃物扔掉，既浪费了山竹果皮中的大量色素和生物活性物质，又造成了环境污染问题。山竹果皮中含有一定量的花青素，以此作为提取材料，不但可以变废为宝提高其经济价值，也可为花青素的开发提供新的材料。基于此，本发明提供了一种从山竹果皮中提取花青素的方法。本发明通过提高与改进山竹果皮花青素的提取率，并评价所提取的花青素在抗肿瘤细胞活性中的作用。目前，有关山竹果皮花青素提取工艺及其应用研究较少，本发明结合传统工艺与现代工艺，细化工艺参数，采用超临界co2流体的提取方法，其工艺具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、提取纯度高等特性。
技术实现要素：
本发明提供了山竹果皮中提取花青素的方法与应用。本发明将传统工艺与现代工艺相结合，细化工艺参数，采用超临界co2流体的提取方法，其工艺具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、提取纯度高等特性。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种从山竹果皮中提取花青素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）对原料进行处理，将山竹果皮洗净，阴凉处晾干后，粉碎过60目筛，得到山竹果皮粉末；
（2）将山竹果皮粉末经微波处理后，与热水混合后经球磨提取，得上清液，山竹果皮渣继续加水后利用球磨提取2-3次，合并上清液；
（3）向上清液中加入乙醇以及无机盐后，机械搅拌10min后静置分相，取上相减压浓缩后，加入无水乙醇将盐沉淀后继续浓缩；
（4）将浓缩后的花青素提取物置于超临界流体装置中，经超临界co2除杂后得花青素纯品。
进一步的，步骤（2）中所述的微波处理条件为：功率为200-300w，处理时间为10-25min。
进一步的，步骤（2）中所述的热水的温度为60-70℃，所述的山竹果皮粉末与热水混合的质量体积比为1：10-15g/ml。
进一步的，步骤（2）中所述的球磨处理条件为：金属球的粒径为3-5mm；金属球的加入数量为20-15颗；球磨提取时间为3-5min；转速为3000-4500rpm。
进一步的，所述步骤（3）中乙醇加入量为上清液体积的35-50%v/v。
进一步的，所述步骤（3）中无机盐的种类为硫酸铵、硫酸钠以及柠檬酸钠中的一种，所述无机盐的加入量为水质量的35-50m/m。
进一步的，所述步骤（3）的减压浓缩后，浓缩浸膏的体积为原料液体积的15-25%v/v。
进一步的，所述步骤（4）中超临界co2处理时的温度为35-45℃，压强为22-24mpa，处理时间为25-35min。
进一步的，所述步骤（4）中花青素纯品的纯度不低于95%。
本发明方法简便易行，与现有技术相比，本专利所述的一种山竹果皮花青素提取物的制备方法及应用具有以下有益效果。本发明将传统工艺与现代工艺相结合，利用微波处理技术，处理山竹果皮以提高花青素的浸出率；采用球磨提取法，提高花青素提取效率，显著缩短了提取时间；采用无水乙醇-盐双水相以及超临界co2萃取对花青素进行纯化，获得纯净的花青素母液，提高产品纯度；利用体外的抗氧化活性测试以及抗肿瘤细胞活性研究以体现提取物的保健效果。
具体实施方式
实施例一
将山竹果皮洗净，自然晾干后，粉碎过60目筛，得到山竹果皮粉末；将山竹果皮粉末在250w的条件下微波处理18min后，将山竹果皮粉末与60℃的水按1：10的质量体积比g/ml混合，在球磨提取中提取装置中在金属球的粒径为4mm；金属球的加入数量为15颗，球磨提取时间为3min，转速为4000rpm条件下提取3次后，收集上清液；向上清液中加入50%的乙醇v/v，35%的柠檬酸钠w/w后机械搅拌10min，静置分相，取上相减压浓缩后，加入无水乙醇将盐沉淀后继续浓缩至原料体积的18%；将浓缩后的花青素提取物置于超临界流体装置中，在22mpa，35℃条件下，萃取25min得花青素纯品，提取物收率38.5%，总花青素纯度97.5%。
实施例二
将山竹果皮洗净，自然晾干后，粉碎过60目筛，得到山竹果皮粉末；将山竹果皮粉末在300w的条件下微波处理15min后，山竹果皮粉末与60℃的水按1：12的质量体积比g/ml混合，在球磨提取中提取装置中在金属球的粒径为5mm；金属球的加入数量为15颗，球磨提取时间为4min，转速为3500rpm条件下提取3次后，收集上清液；向上清液中加入50%的乙醇v/v，30%的硫酸钠w/w后机械搅拌10min，静置分相，取上相减压浓缩后，加入无水乙醇将盐沉淀后继续浓缩至原料体积的20%；将浓缩后的花青素提取物置于超临界流体装置中，在23mpa，40℃条件下萃取30min得花青素纯品，提取物收率48.7%，总花青素纯度97.2%。
实施例三
将山竹果皮洗净，自然晾干后，粉碎过60目筛，得到山竹果皮粉末将山竹果皮粉末在300w的条件下微波处理20min后，山竹果皮粉末与60℃的水按1：13的质量体积比g/ml混合，在球磨提取中提取装置中在金属球的粒径为3mm；金属球的加入数量为18颗，球磨提取时间为3min，转速为4000rpm条件下提取3次后，收集上清液；向上清液中加入45%的乙醇v/v，25%的硫酸铵w/w后机械搅拌10min，静置分相，取上相减压浓缩后，加入无水乙醇将盐沉淀后继续浓缩至原料体积的15%；将浓缩后的花青素提取物置于超临界流体装置中，在24mpa，45℃条件下萃取30min，获得得花青素纯品，提取物收率48.3%，总花青素纯度96.2%。
实施例1-3所得提取物的活性测试
培养人乳腺肿瘤细胞mda-mb-468，分为肿瘤细胞组、山竹果皮花青素提取物组，取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞混悬液按每孔1×104个细胞接种于96孔板中，37℃、5%co2及饱和湿度下培养24h后换无血清培养基，继续培养24h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，肿瘤细胞组加入空白培养基，山竹果皮花青素提取物低、中、高剂量组分别加入含10μg.ml-1、100μg.ml-1、1000μg.ml-1的花青素提取物，继续培养，48h后取出96孔板，每孔加入cck-8溶液20μl，继续孵育30min。酶标仪测定450nm处各孔的吸光值（a），计算抑制率，结果见表1。
表1山竹果皮花青素提取物对人乳腺肿瘤细胞mda-mb-468增殖的影响（n=6）
由表1可以看出，山竹果皮中花青素提取物对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。