一种春兰CgWRKY53基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种春兰cgwrky53基因及其应用。

背景技术：

春兰（cymbidiumgoeringii）为兰科（orchidaceae）兰属（cymbidiumsw.）多年生草本植物，在我国分布于黄河流域以南大部分地区，生于海拔300～3000m的山地林缘、林中空地及灌丛草坡等多石湿润坡地上，是我国兰科植物（国兰）中分布最广、品种资源最丰富的种类之一。春兰株型纤小，清秀脱俗，花色淡雅，香气清幽，素有“花中君子”和“天下第一香”之美称，具有极高的观赏价值和经济价值。

wrky转录因子是一类主要存在于植物中的转录调控因子。研究表明wrky转录因子参与多种生物和非生物胁迫反应，比如在水稻中，oswrky45-1、oswrky45-2基因的表达均在细菌病原菌侵染过程中被诱导。其中，oswrky45-1和oswrky45-2这两个基因过量表达会使得水稻的抗病能力增强。在较高温度下处理拟南芥植株后，atwrky25和atwrky26受正调控表达，atwrky33受负调控表达。这3个基因的突变体植株对热胁迫更敏感，表现出发芽减少及存活率降低的现象。研究发现，wrky转录因子除了在植物防卫反应中起重要作用外，还参与植物生长发育等一系列生命活动，包括种子生长发育、果实的成熟、叶片的衰老、胚胎形成等过程。水稻oswrky31的过量表达抑制了侧根的形成和伸长，分析发现过表达植株中的生长素早期响应基因如osiaa4和oscrl1呈组成性表达。拟南芥wrky13通过直接结合于nst2的启动子上正调控茎中木质素的生物合成。oswrky78rnai植株表现为半矮秆，粒形变小，而过表达植株与野生型一样，说明oswrky78对水稻茎伸长和种子发育具有调节作用。利用基因工程技术，从春兰中克隆获得cgwrky53基因，该基因在低温胁迫下表达差异较为明显，因此将cgwrky53基因转入植物中，将具有广泛的用途。

技术实现要素：

发明目的：针对现有育种技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种春兰cgwrky53基因。本发明的另一目的是提供春兰cgwrky53基因在兰花育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种春兰cgwrky53基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述的春兰cgwrky53基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述的春兰cgwrky53基因在植物生产和育种中的应用。

含有所述的的春兰cgwrky53基因的载体。

含有所述的春兰cgwrky53基因的宿主细胞。

有益效果：与现有技术相比，本发明通过对春兰cgwrky53基因的克隆与鉴定，基因的表达分析，验证其功能，发现过表达cgwrky53基因的拟南芥植株生长发育迟缓，植株矮化，叶片缩小，且卷曲变形等表型，可见该基因在兰花和其他植物生产、育种中将具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是春兰cgwrky53基因克隆和构建的过表达载体图；

图2a图是cgwrky53在春兰各组织中的表达情况，其中，r表示根，p表示假鳞茎，l表示叶，f表示花；b图是春兰cgwrky53基因在春兰低温胁迫0h、2h、6h、12h、24h、48h的表达情况；

图3a图是酶切结果图，其中，m：dl2000marker；cgwrky53与pbi121连接后用smai和snabi双酶切；b图是阳性重组子的筛选图，其中，m：dl2000marker，目的条带大小为1080bp；

图4是转基因拟南芥植株pcr结果图，其中，m：dl2000marker；ck⁺：以载体质粒dna为阳性对照；ck^-：野生型dna为阴性对照；水：空白对照；

图5是转cgwrky53基因植株与野生型拟南芥植株株型比较图，图中wt，野生型拟南芥；1-3，转cgwrky53基因的不同株系；

图6是转cgwrky53基因植株与野生型col拟南芥叶片比对图；wt，野生型拟南芥，3，转cgwrky53基因株系3；

图7是转cgwrky53基因植株与野生型col拟南芥叶片比对图；wt，野生型拟南芥；1-3，转cgwrky53基因的不同株系；

图8是转cgwrky53基因植株与野生型拟南芥在低温胁迫下，冷胁迫相关基因表达情况比对图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

本实施例所采用的材料是春兰‘宋梅’叶片，采后速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。

1）春兰叶片总rna的提取

按照takara植物总rna提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将超低温冻存的春兰叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品加入到含有450μlbufferpe的1.5ml灭菌tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌tube中。加入上清液1/10体积的buffernb，vortex振荡混匀，12,000rpm，4℃离心5钟；将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌tube中，加入450μl的bufferrl，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到rnaspincolumn中；12,000rpm，离心1分钟，弃滤液，将rnaspincolumn放回到2mlcollectiontube中；将500μl的bufferrwa加入至rnaspincolumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；600μl的bufferrwb加入至rnaspincolumn中，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；向rnaspincolumn膜中央加入50μldnasei反应液，室温静置15分钟；向rnaspincolumn膜中央加入350μl的bufferrwb，12,000rpm离心30秒钟，弃滤液；将rnaspincolumn重新安置于2mlcollectiontube上，12,000rpm离心2分钟；将rnaspincolumn安置于1.5ml的rnasefreecollectiontube上，在rnaspincolumn膜中央处加入50μl的rnasefreedh2o室温静置5分钟，12,000rpm离心2分钟洗脱rna。所得rna经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μlrna利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28s和18s条带较为清晰，28s条带亮度约为18s的两倍，rna质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测rna纯度，od260/od280为2.03，od260/od230为2.01，完整性较好，可用于反转录。

2）第一链cdna的合成

以所得到的的总rna为模板，使用takara反转录试剂盒进行反转录，使用oligo(dt)作为锚定引物，反转录合成第一链cdna。具体操作如下：

在离心管中配制按照下列模板rna/引物的顺序配制混合物，总量为10μl：模板1μg，oligo(dt)primer(50μm)1μl，dntpmixture(10mmeach)1μl,剩余体积用rnase-freeddh2o补齐。65℃保温5min后，冰上迅速冷却；将该离心管离心，使离心管中的混合物均沉于管底。在新的离心管中配制反转录反应液（20μl）：上述变性后反应液10μl，5×primescriptbuffer4μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl，primescriptrtase(200u/μl)1μl，rnasefreedh2o补齐20μl。缓慢摇匀，在pcr仪上，30℃保温10min，42℃保温30min，95℃保温5min使酶失活，冰上放置，得到cdna溶液。

3）目的基因引物的设计及克隆

根据现有的春兰转录组测序数据，利用其它物种的wrky相关基因序列进行blast同源比对。利用oligo6.0，prime5.0设计相应引物，引物序列为：

cgwrky53-f：5'-atggagagcagcatgatcacct-3'，

cgwrky53-r：5'-agataaaccaaaagggaaatcagt-3'。

以cdna第一链为模板，利用primerstarmax高保真酶进行春兰cgwrky53基因的克隆。pcr扩增体系（50μl）为：25μllprimerstarmax，2μlforwardprimer，2μlreverseprimer，2μltemplatedna，19μlddh2o。pcr程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

pcr反应完成后，取全部pcr产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并切割目的片段，凝胶回收纯化pcr目的扩增产物。采用天根公司的dna凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液bl，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入等体积溶液pn（如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlpn溶液），50℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱ca2放入收集管中；向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液w，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱置于室温放置5min，彻底晾干；将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μlddh2o，室温静置2min，12000rpm离心2min收集dna溶液。取2μl回收纯化后的产物，使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。

4）目的片段与载体连接

克隆载体为全式金公司的peasy-blunt载体，进行连接反应，连接体系（5μl）：4μlpcr纯化产物，1μlpeasy-bluntvector，轻轻吸打混匀后，室温放置5min，将离心管置于冰上。

5）连接产物的转化

从超低温冰箱中取出感受态细胞trans5α菌株，置于冰上融化。吸取5μl的过夜连接产物加入到100μl感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴30min；42℃水浴锅中水浴，热激90s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2min；在超净台中加入800μl无抗生素的液体培养基，37℃、200rpm摇1h复苏；4000rpm离心3min，吸去800μl上清；将沉淀的菌体重悬，涂于lb平板（amp的浓度为100mg/l），37℃培养过夜。

6）重组质粒的筛选及验证

挑取在含有抗生素（amp）的lb固体培养基上过夜生长的单菌落，接种到含有同样抗生素的750μl的lb液体培养基中。200rpm，37℃过夜培养。

pcr扩增体系为：10ulgreentaqmix，1μlm13-f/r，1μl菌液，7μlddh2o补充到20μl。

pcr程序为：94℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30cycles；72℃5min；16℃forever。

吸取5µl的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。验证后，将条带大小正确的菌液样品委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序引物为通用引物m13f/r。测序结果在ncbi上进行比对分析。

根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个春兰wrky编码基因，命名为cgwrky53基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，cgwrky53基因编码长度为1080bp，含有atg起始密码子和tga终止密码子，其中orf全长为1080bp，编码359个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例2

研究结果表明wrky53基因在春兰中各个组织器官中均有表达（图2a），但是该基因在春兰花中的表达量最高，说明该基因在花中功能活跃。通过对春兰低温胁迫处理的叶片进行表达分析（图2b），证明cgwrky53基因在春兰叶片能够响应低温胁迫，并在此过程中发挥重要的调控作用。

本实施例所用的植物材料为拟南芥(arabidopsisthaliana)col（columbia）野生型种子。

本实施例所用的大肠杆菌菌株为trans5α；农杆菌菌株为gv3101，分别用于转化拟南芥；试验中所用植物表达载体为pbi121。所用菌株分别购自全式金生物公司和普利斯生物公司。

1）cgwrky53基因过表达载体的构建

将实施例1获得的cgwrky53基因orf全长序列与植物表达载体pbi121进行连接，构建的载体如图1。

2）质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10ml菌液，12000rpm离心1min，去掉上清液；取500μlp1溶液（含rnasea）加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μlp2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μlp3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μl平衡液bl加至吸附柱cp4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱cs中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱cp4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放回收集管；取500μl去蛋白液pd加至吸附柱cp4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱cp4重新放回收集管；取600μl漂洗液pw（含无水乙醇）加至吸附柱cp4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱cp4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μlddh2o；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

3）特异酶切位点的添加

以cdna为模板，通过pcr方法在目的基因的两侧添加特异性酶切位点。春兰cgwrky53基因两侧添加smai和snabi酶切位点。pcr反应体系、程序及所使用引物如下：

pcr扩增体系（50μl）：25μlprimerstarmax，2μlforwardprimer，2μlreverseprimer，2μltemplatedna，19μlddh2o。pcr程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

所使用的引物序列：

cgwrky53-smai-f：5'-cccgggatggatgacagtatatccatttt-3'，

cgwrky53-snabi-r：5'-tacgtaagataaaccaaaagggaaatcagt-3'。

将得到的pcr产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，使用天根琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行回收纯化，将回收后的产物与pbi121载体连接，构建表达载体。

4）双酶切反应

将提取的pbi121质粒用smai和snabi在37℃条件下酶切15min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μl：pbi121质粒20μl，5×buffer5μl，smai1μl，snabi1μl，ddh2o23μl。酶切结果如图3a所示，其中，m：dl2000marker；1：cgwrky53，与pbi121连接后用smai和snabi双酶切。

5）连接反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pbi121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。其中，目的片段分子数：载体分子数=3:1-5:1，连接反应体系为：线性化pbi121载体7μl，插入片段3μl，5×ceiibuffer4μl，exnaseii2μl，ddh2oupto20μl。在37℃下反应30min，放置于冰上降温冷却。

6）连接产物转入大肠杆菌

将目的片段与载体pbi121连接后的产物转入大肠杆菌trans5α感受态细胞中，方法同实施例1。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（卡那霉素）的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液pcr，以筛选阳性克隆。筛选后的阳性克隆送南京金斯瑞公司测序。同时使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致。结果如图3b所示，为目的引物pcr结果，条带大小为1080bp。

8）农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌gv3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5ml液体lb培养基中，28℃、250rpm摇菌培养20-24h；吸取2ml菌液，接种到含有50ml液体lb培养基的三角瓶中，28℃、250rpm摇菌至od600值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清；加入10ml经预冷的0.1mo1/lcacl2溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000rpm离心5min，弃去上清；加入1ml预冷的20mmo1/lcacl2溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的gv3101感受态细胞，用离心管将其分装成100µl/管，迅速加入20%的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将1-5µl经回收纯化后的质粒加入到200μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴30min；使用液氮速冻lmin，37℃水浴锅中热击1-5min，迅速置于冰上1-2min；加入800μl不含任何抗生素的lb培养基，28℃，100rpm复苏2-4h；4000rpm离心3min，吸掉部分培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂抹于添加50mg/l卡那霉素和50mg/l链霉素（eha105）或100mg/l的庆大霉素（gv3101）的固体lb培基上；28℃倒置培养30-48h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，220rpm培养过夜；使用35s-f分别搭配如下引物进行菌液pcr，引物序列为：

35s-f：5'-gatagtggaaaaggaaggtg-3'，

35s-cgwrky53-r：5'-tacgtaagataaaccaaaagggaaatcagt-3'。

pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段；鉴定出的阳性克隆，扩大培养后，采用碱裂解法提取质粒，进行双酶切验证；鉴定后的阳性克隆加入适量无菌甘油，于-80℃保存备用。

9）农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥(col野生型)保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌eha105菌株。挑取单菌落，接种于5ml含有卡那霉素和链霉素的lb培养基上，28℃、200rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10h；吸取1ml菌液，接种到三角瓶中(50ml)摇菌24h，至od值约为0.8左右；将菌液5000rpm在室温下离心5min，去除上清后收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入silwetl-77，浓度为0.05%(500μl/l)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15-30s，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，4℃，放置24h；揭开锡箔纸，正长条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

5%蔗糖溶液重悬液各成分如下：ms培养基，添加蔗糖50g/l，mes0.5g/l，silwet-77500μl/l。（注意：配制后ph调制5.8，菌液离心重悬后再加入silwetl-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液od*菌液体积=0.8*重悬液）。

10）转基因植株的筛选

收集的t1代转基因拟南芥的种子，用酒精和升汞进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5ml离心管中，用75%酒精浸泡30s；10%次氯酸钠灭菌2min30s；无菌水冲洗3-4次，第一次冲洗后更换经高压灭菌的新离心管；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50mg/l和头孢霉素100mg/l）的1/2ms固体培养基上。22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长，结果如图4所示。

11）转基因植株的检测

取适量拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用ctab法提取dna，具体操作步骤为：将适量叶片置于灭菌处理后的2ml离心管中，加入700µl的ctab溶液，用球磨仪彻底研磨，65℃静置10min；加入等体积的氯仿：异戊醇，数次颠倒使其混合均匀，14000rpm离心10min；将上清移至新的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置2min，14000rpm离心10min，倒掉上清；加入70%的无水乙醇，使用移液枪吹打洗涤两次，14000rpm离心1min，弃去上清；吹干表面液体，加入20µlddh2o溶解。取上述提取的转基因和野生型拟南芥的dna，用cgwrky53基因的特异性引物进行pcr检测。

春兰cgwrky53基因转化拟南芥后，共获得5个过表达cgwrky53基因拟南芥株系。以重组质粒为阳性对照，以野生型为阴性对照，以水为空白对照，pcr结果如图4所示，阳性对照为cgwrky53基因载体pcr结果，阴性对照以水为代替模板，wt是以野生型拟南芥dna为模板。

12）表型观察

不同代转基因植株的获得：收获的转基因t1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获t1代种子，进行编号，得到t2代；同t1代一样，将t2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的t2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性t2代植株继续进行编号，收集种子，得到t3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的t3代植株，全部存活并且没有出现分离的为t3代纯合植株。

对得到的转基因株系分批次进行观察。

（1）选取其中表型明显的3个转基因植株进行观察，结果发现与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥植株生长发育缓慢，植株矮化（图5）；转基因植株叶片缩小，且卷曲变形（图6、图7）

（2）对野生型和转基因拟南芥进行4℃低温胁迫处理，检测与低温相关基因atcor47、atcor15a和atrd29a的表达量，见图8，结果发现在野生型拟南芥和转基因拟南芥中，3个基因均受低温诱导表达，但在野生型植株中表达量明显高于转基因植株，推测cgwrky53抑制了转基因植株冷信号下游基因的表达；cgwrky53过表达通过调控atcor47、atcor15a及atrd29a基因的表达从而调控植株的抗寒性。

本实施例将过表达的春兰cgwrky53基因的35s:cgwrky53转入模式植物拟南芥中，进行表型观察和分析。从结果可以看出，过表达35s:cgwrky53的拟南芥t2代植株出现生长发育迟缓，植株矮化，植株矮化，叶片缩小，且卷曲变形等表型；cgwrky53超表达可能通过调控冷信号下游基因atcor47、atcor15a和atrd29a基因的表达调控植株的抗寒性。

<110>南京林业大学

<120>一种春兰cgwrky53基因及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1080

<212>dna

<213>春兰cymbidiumgoeringii

<400>1

atggagagcagcatgatcacctgcgacatgggcatgcttattaatgtgctaactcaaggc60

aacgagcatatgagagagcttcaggtccaactcgaccaacctttctctgctgaaacttgc120

aaactgttagcagccaaggctacgtctgcggtatcatcagccatctccatggccaggcta180

ctcgagccggcttgccgaagaccgaccggcctcgactcaccgccatcggcaagcgatagc240

ccaaagagcgatggttctgataaggctttcaaggagctggagcgcagagagaattgcaag300

aagaggaagactttgccacgttggagcagccaggtgcgagcttgctctagttcatccatg360

gatgggccatttgatgacggctatagctggagaaagtatggccaaaaggacattcttgga420

gccaagtttccaagaggctattataggtgcacataccggcacacccatggctgcctcgcc480

acgaagcaagttcagcgctccgacgacgacaactcgctcttcgacgtcacttaccgcggc540

gctcacacctgcaatcacagcctgcagagaaaccgaactccgtctcacagagaagaaaac600

ctggactccaaccaaacgccaccgaagcctcaaactcatcctcatcagcagcaacaactg660

ctacttctcgagcatctgaaaacaggcctcagggtaaagaccgaaggcttcaactccgac720

gaccggctcctagattcttctccttccttctccttcccctccacgccagcatactatatt780

aagcctcaaagcagtaacaatctcttctcttccgcttcttcgatgctggagaatcagttc840

atgggaaactactcgcctacttttgtgtcgaccaccacttcagctgagtcgaattacttc900

tctctctctccctgcggcgtgaacaactatggtggtgggttcaatcttcaaggattagat960

atggagatggcagaaataatctctgccgcgacttcgacgacgaattccccgatggttggg1020

atggatttcccagtggagcagattgagtttgagactgatttcccttttggtttatcttga1080

<210>2

<211>359

<212>prt

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>2

metglysersermetilethrcysalametglymetleuilealaval

151015

leuthrglyglyalaglyhismetalaglyleuglyvalglyleuala

202530

glyproproseralaglythrcysleuleuleualaalaleualathr

354045

seralavalserseralailesermetalaalaleuleuglyproala

505560

cysalaalaprothrglyleualaserproproseralaseralaser

65707580

proleuseralaglyseralaleualaproleuglyleuglyalaala

859095

glyalacysleuleualaleuthrleuproalathrserserglyval

100105110

alaalacyssersersersermetalaglyproproalaalaglythr

115120125

serthralaleuthrglyglyleualaileleuglyalaleupropro

130135140

alaglythrthralacysthrthralahisthrhisglycysleuala

145150155160

thrleuglyvalglyalaseralaalaalaalaserleuproalaval

165170175

thrthralaglyalahisthrcysalahisserleuglyalaalaala

180185190

thrproserhisalaglyglyalaleualaseralaglythrpropro

195200205

leuproglythrhisprohisglyglyglyglyleuleuleuleugly

210215220

hisleuleuthrglyleualavalleuthrglyglyproalaserala

225230235240

alaalaleuleualaserserproserproserproproserthrpro

245250255

alathrthrileleuproglyserseralaalaleuproserserala

260265270

sersermetleuglyalaglyprometglyalathrserprothrpro

275280285

valserthrthrthrseralaglyseralathrproserleuserpro

290295300

cysglyvalalaalathrglyglyglyproalaleuglyglyleuala

305310315320

metglymetalaglyileileseralaalathrserthrthralaser

325330335

prometvalglymetalaproprovalglyglyileglyproglythr

340345350

alaproproproglyleuser

355

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>3

atggagagcagcatgatcacct22

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>4

agataaaccaaaagggaaatcagt24

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>5

cccgggatggatgacagtatatccatttt29

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>6

tacgtaagataaaccaaaagggaaatcagt30

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>7

gatagtggaaaaggaaggtg20

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artiartificialsequence)

<400>8

tacgtaagataaaccaaaagggaaatcagt30