血液中circ-DLG1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用的制作方法

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体为一种血液中circ-dlg1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用。

背景技术：

食管癌是严重威胁人类健康的最常见恶性肿瘤之一，主要有两种病理分型：鳞癌和腺癌。90％的食管癌是鳞状细胞癌，其分布具有明显的地域差异。我国escc发病率占全世界70％以上，预后较差，5年总体生存率只有15％-25％。2016年临床医师癌症杂志报道，食管癌已经成为中国发病率最高的五种肿瘤之一，其发病率在男性中排第三位，女性中排第五位。

环状rna(circrnas)是一种新的内源性非编码rna，在20世纪90年代早期被确定为乱序外显子的转录本，其结构、功能和机制被相继报道，成为后来20年的研究热点。不同于以5'端和3'端为末端的传统线性rna，circrnas是缺少5'端帽和3'端poly(a)尾的特殊闭环结构，且与哺乳动物细胞中微小rna(mirnas)和长链非编码rna(lncrnas)相比，具有更高的稳定性和序列保守性，是因为它们具有核酸酶抗性。近期大量研究报道，在不同物种中circrnas均有表达。基于生物信息学分析和高通量测序技术的迅速发展，研究人员发现了数以万计的circrnas，发现它们参与血管病变、神经系统疾病、肿瘤等疾病发生发展。circrnas芯片分析技术已应用于许多肿瘤，包括消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，头颈部肿瘤等，如下咽鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌、基底细胞癌、胰腺导管腺癌、escc、肝细胞癌、甲状腺乳头状癌等。然而，在食管鳞癌中，circrnas鲜有报道。

目前escc尚没有血浆肿瘤标志物来评估病情，内镜是金标准，但是创伤大，患者不易接受。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明公开了一种血液中circ-dlg1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用，针对目标人群对食管癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的食管鳞癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在食管鳞状细胞癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。血浆中的circ-dlg1可作为escc患者的血浆标志物，这一检查方法容易被受检者接受，更可成为escc患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。

为了达到以上目的，本发明供如下技术方案：

一种血液中circ-dlg1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用，所述circ-dlg1分子标志物的核苷酸序列为seqidno.1。circ-dlg1的id号为circ_0007203，剪切处序列为cgatgaggtcggagtgattcccagtaaacesccagagttgagaagaaagaacgaesccccgattaaaaacagtgaaattcaattctaaaacgagagataaaggesccttcttctcaesccctgttgataaccatgttaesccccatcttccttcttggescccagacaccaesccatctccaescccagatactccccagtttctaaaesccagtact。

进一步的，用于诊断食管鳞癌分期中的试剂为实时定量pcr试剂盒。

本发明，根据核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物设计了2对引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5。

特异性引物分别如下：

本发明还公开了一种circ-dlg1分子标志物的检测方法，包括样品总rna提取、rna反转录、实时定量pcr扩增。

第一步，总rna提取

a.血浆总rna提取

血浆、血清总rna提取使用mirvanapariskit(ambion1566,usa)试剂盒，具体步骤如下：

所有试剂均需恢复到室温下使用，取出血浆/血清样本冰面上融化备用，洗脱液95℃预热备用；

400μl血浆/血清样本加入已经添加等体积的2xdenaturingsolution的ep管中，充分震荡混匀；

加入等体积的acid-phenol:chloroform，震荡混匀1min，随后室温下10000g离心5min；小心转移上层水相至新的ep管，并记录转移水相体积，随后添加1.25倍体积100％乙醇至ep管中，充分混匀后转移裂解液/乙醇混合物通过滤器(10000g离心30s)；

加700μlmirnawashsolution1清洗滤器1次(10000g离心15s)，随后加入500μlwashsolution2/3清洗滤器2次(10000g离心15s)；

50μl95℃预热的无核糖核酸酶水洗脱滤器上的rna(10000g离心30s)，-80℃长期保存；

紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。

b.组织总rna提取trizol法提取组织及细胞总rna,具体步骤如下：

清洗瓷质研体后，用depc液浸泡过夜(至少12h)，然后高压蒸汽灭菌后放入超低温冰箱冷藏；

准备无菌无酶枪头、ep管、离心机4℃遇冷备用

从超低温冰箱内取出冻存组织(约50mg)，擦去表面冻存液，研钵(-40℃预冷)内充分研磨，边研磨边添加液氮以防止组织rna降解。待组织样本研磨成粉状；

每份样本添加1mltrizol裂解液，用枪头吹匀后转移裂解液至ep管，冰面上静置5min，使其完全分解；

加氯仿0.2ml，剧烈震荡15s，室温下静置2min，4℃，12000g离心15min；

小心转移上层水相至新的ep管中，尽量避免吸取絮状中间层。随后加0.5ml异丙醇，震荡混匀、室温下静置10min,随后4℃，12000g离心10min。现配75％乙醇备用；

小心弃去上清，加入75％乙醇1ml震荡清洗沉淀，随后7500g，4℃离心5min；

最后弃去上清，用枪头尽可能吸去残余液体，室温风干，根据沉淀大小，加入30-60μldepc水溶解rna沉淀；

紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。

第二步，rna反转录和实时定量pcr

使用prime-script将rna逆转录成cdnatm一步法rt-pcr试剂盒，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作内部对照。使用abi7500系统和sybrgreenpcrmastermix进行所有qrt-pcr反应。为了准确验证escc中circ-dlg1表达的倍数变化，将计算的ct值相对于从相同样品扩增的gapdh(δct＝cttested-ctgapdh)标准化，并且使用-δct方法来估计变化的价值。每个样本重复三次，所有反应独立重复三次以确保所有数据的可重复性。circ-dlg1的cutoff值为-13.22，当检测出的-δct大于这个值时为escc，其特异性为74.55％，敏感性为74.55％。

数据分析：采用t检验和卡方检验及生存分析的方法circ-dlg1与escc患者临床分期资料及预后的相关性。进行受试者工作特征(roc)曲线来评估其诊断价值。所有统计分析均使用spssforwindowsv.17.0进行。对于所有结果，p<0.05被认为有统计学意义。

本发明还公开了一种用于诊断食管鳞癌分期的实时定量pcr检测试剂盒，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物设计并合成出特异性用于实时定量pcr的检测引物；特异性引物如序列表中seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5。

本发明的目的在于提供一种核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物。

本发明具有如下优点：

(1)提出了circ-dlg1的用途。(2)环状rna具有机构稳定、丰度度和样本特异性表达等特征，且circ-dlg1在escc患者和正常人血液样本中表达量存在差异，并且与分期相关，因此circ-dlg1具有成为食管鳞癌生物标志物的应用前景。

本发明是针对目标人群对食管癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的食管鳞癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在食管鳞状细胞癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。血浆中的circ-dlg1可作为escc患者的血浆标志物，这一检查方法容易被受检者接受，更可成为escc患者的早诊、病情进展的判断以及预后评估的有效手段。

附图说明

图1，escc组织中circ-dlg1表达水平的表达显着高于相邻的非癌组织；

图2，escc血浆中circ-dlg1水平的表达显着高于正常血浆；

图3，roc曲线下面积为0.7861；

图4，escc血浆中circ-dlg1水平与分期正相关。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明公开了一种血液中circ-dlg1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用，circ-dlg1分子标志物的核苷酸序列为seqidno.1。

进一步的，用于诊断食管鳞癌分期中的试剂为实时定量pcr试剂盒。

本发明，根据核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物设计了2对引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5。

本发明中，circ-dlg1分子标志物的检测方法，包括样品总rna提取、rna反转录、实时定量pcr扩增。

本发明还公开了一种用于诊断食管鳞癌分期的实时定量pcr检测试剂盒，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物设计并合成出特异性用于实时定量pcr的检测引物；特异性引物如序列表中seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5。

本发明还提供一种核苷酸序列为seqidno.1的circ-dlg1分子标志物。

具体实施方式，如下：

1.实验对象

本研究以南京医科大学附属南京医院肿瘤外科为研究基地，肿瘤外科常年收治食管鳞癌患者，并建立标本库，能为本研究提供丰富的病例资料。研究患者组织及血液来源于2013年至2017年8月期间在我院接受根治或姑息性手术切除的食管鳞癌患者。正常对照血液样本均来源于南京市第一医院健康体检人群，健康对照人群排除恶性肿瘤病史以及食管相关疾病病史。本实验所有标本均获得患者或其委托人签署知情同意，所有涉及人体标本的研究均获得南京市第一医院伦理委员会批准。

研究患者纳入标准如下：

a.经术后病理学证实为食管鳞状细胞癌(按照第7版(2009年)食管癌tnm分期标准进行临床分期)；

b.住院期间接受根治或姑息性切除的患者，同时排除术前放化疗者；

c.现病史、家族史、个人史以及各种检查资料均完善。

本研究中escc癌症患者血样35例，正常人血样28例，escc组织和癌旁组织55对。

2.临床资料采集

临床资料的收集主要分为食管鳞癌患者和正常人两部分，均需包含一般资料：包括患者的姓名、性别、年龄、职业、既往病史、家族史、女性月经史以及婚育史等。食管鳞癌患者主要由食管鳞癌患者的住院资料整理而来。主要包括上述一般资料外，还应包括临床特征，包括肿瘤的组织学类型、部位、大小、浸润程度、淋巴结有无转移，肿瘤细胞分化程度，肿瘤tnm分期，手术时间，术后有无放化疗以及常规辅助检查等资料。同时获得所有人的随访同意，检查结果资料完善保存。

3.标本收集

分为两部分，一部分是血液的收集，每位食管鳞癌患者术前采血一次(5ml/管)用于后续实验研究。所有血液样本应避免发生溶血。其中血浆样本收集采血管为乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticacid,edta)抗凝管，全血样本应在0.5h内完成血浆的离心收集冻存；血清样本收集采血管为常规生化促凝管，样本应在2h内完成血清的析出离心冻存。全血样本通过两步离心法以去除细胞成分影响，首先在2000g，4℃，离心10min，随后小心转移上清至新的ep管中，然后12000g，4℃，离心10min,最后完成血浆及血清样本分装(400μl/管)，放入-80℃冰箱长期保存。

还有一部分是组织标本的收集。临床收集因食管鳞癌而接受根治或姑息手术切除的患者的肿瘤组织及癌旁正常食管组织标本。对照组标本来自于同一患者的癌旁组织(距离肿瘤边缘至少5cm)，术后病理检查未发现切缘癌细胞残留。新鲜肿瘤组织和癌旁正常组织离体后首先尽快用预冷生理盐水清洗两遍，随后剪取约黄豆大小组织放入有rna保护液的冻存管中充分混匀。所有标本获取后均先速冻于液氮罐中24h，然后及时放入-80℃冰箱中长期保存，以待后续实验使用。

4.主要引物

5.总rna提取

a.血浆总rna提取

血浆、血清总rna提取使用mirvanapariskit(ambion1566,usa)试剂盒，具体步骤如下：

所有试剂均需恢复到室温下使用，取出血浆/血清样本冰面上融化备用，洗脱液95℃预热备用；

400μl血浆/血清样本加入已经添加等体积的2xdenaturingsolution的ep管中，充分震荡混匀；

加入等体积的acid-phenol:chloroform，震荡混匀1min，随后室温下10000g离心5min；

小心转移上层水相至新的ep管，并记录转移水相体积，随后添加1.25倍体积100％乙醇至ep管中，充分混匀后转移裂解液/乙醇混合物通过滤器(10000g离心30s)；

加700μlmirnawashsolution1清洗滤器1次(10000g离心15s)，随后加入500μlwashsolution2/3清洗滤器2次(10000g离心15s)；

50μl95℃预热的无核糖核酸酶水洗脱滤器上的rna(10000g离心30s)，-80℃长期保存；

紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。

b.组织总rna提取trizol法提取组织及细胞总rna,具体步骤如下：

清洗瓷质研体后，用depc液浸泡过夜(至少12h)，然后高压蒸汽灭菌后放入超低温冰箱冷藏；

准备无菌无酶枪头、ep管、离心机4℃遇冷备用

从超低温冰箱内取出冻存组织(约50mg)，擦去表面冻存液，研钵(-40℃预冷)内充分研磨，边研磨边添加液氮以防止组织rna降解。待组织样本研磨成粉状；

每份样本添加1mltrizol裂解液，用枪头吹匀后转移裂解液至ep管，冰面上静置5min，使其完全分解；

加氯仿0.2ml，剧烈震荡15s，室温下静置2min，4℃，12000g离心15min；

小心转移上层水相至新的ep管中，尽量避免吸取絮状中间层。随后加0.5ml异丙醇，震荡混匀、室温下静置10min,随后4℃，12000g离心10min。现配75％乙醇备用；

小心弃去上清，加入75％乙醇1ml震荡清洗沉淀，随后7500g，4℃离心5min；

最后弃去上清，用枪头尽可能吸去残余液体，室温风干，根据沉淀大小，加入30-60μldepc水溶解rna沉淀；

紫外分光光度计测定样本浓度和纯度。

5.rna反转录和实时定量pcr

使用prime-script将rna逆转录成cdnatm一步法rt-pcr试剂盒，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作内部对照。使用abi7500系统和sybrgreenpcrmastermix进行所有qrt-pcr反应。为了准确验证escc中circ-dlg1表达的倍数变化，将计算的ct值相对于从相同样品扩增的gapdh(δct＝cttested-ctgapdh)标准化，并且使用-δct方法来估计变化的价值。每个样本重复三次，所有反应独立重复三次以确保所有数据的可重复性。circ-dlg1的cutoff值为-13.22，当检测出的-δct大于这个值时为escc，其特异性为74.55％，敏感性为74.55％。

6、数据分析：

如图1至图4所示，采用t检验和卡方检验及生存分析的方法circ-dlg1与escc患者临床分期资料及预后的相关性。进行受试者工作特征(roc)曲线来评估其诊断价值。所有统计分析均使用spssforwindowsv.17.0进行。对于所有结果，p<0.05被认为有统计学意义。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏万成生物医学研究院有限公司

<120>血液中circ-dlg1分子标志物在诊断食管鳞癌分期中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

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<213>homosapiens

<400>1

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