一种以回收孔为基础的高效割胶回收系统及其应用的制作方法

本发明属于核酸纯化系统，涉及一种dna割胶回收系统，尤其是涉及一种以回收孔为基础的高效割胶回收系统及其应用。

背景技术：

dna割胶回收是最基本的分子生物学操作之一，广泛用于载体构建等。近来年，以dna疫苗等为代表的核酸治疗方法的兴起，使得dna的需求量大大增加，因而，提高dna割胶纯化的效率至关重要。然而，传统的dna割胶回收方法需要加热将凝胶溶解，操作时间长，回收效率低。商业化dna割胶回收试剂盒宣称回收效率在80％左右，但实验中实际回收效率在10-20％左右。因而，如何提高回收效率，以降低生产成本显得非常重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以回收孔为基础的高效割胶回收系统，由dna电泳缓冲液，加样梳，回收梳，手提式紫外灯，玻璃板，平衡液，dna结合液，dna吸附柱，漂洗液，洗脱液组成。

dna电泳缓冲液为tae缓冲液；平衡液为ph值9.0～10.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液；dna结合液为ph值至5.0～7.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)和乙二胺四乙酸二钠(edta)的混合溶液；dna吸附柱为常用商业化硅膜吸附柱，漂洗液为无水乙醇；洗脱液为无核糖核酸酶的去离子水。

所用的dna电泳缓冲液、平衡液，结合液，dna吸附柱，漂洗液，洗脱液均可用市售成品。

本发明的另一个目的是提供上述割胶回收系统在dna割胶回收中的应用。

本发明所述割胶回收系统的应用，通过以下步骤实现：

在制备凝胶时，先使用加样梳和回收梳制备加样孔及回收孔，电泳时，保持电泳液液面略低于凝胶表面，同时向回收孔中加入电泳液，使得dna进入回收孔中溶解在回收孔内电泳液内，且回收孔内电泳液不会扩散到回收孔外。利用紫外灯实时观察，当dna通过凝胶进入回收孔时，用吸管吸取回收孔中液体，加入dna结合液，随后使用平衡液预处理dna吸附柱，将样品加入到dna吸附柱中离心，使dna与吸附柱结合，使用漂洗液漂洗，室温放置数分钟干燥，最后加入洗脱液洗脱，测定dna浓度。

本发明提供的一种以回收孔为基础的高效割胶回收系统，回收效率达70％左右，显著高于传统割胶回收效率(传统回收方法的回收率为20％左右)，且由于不用等待凝胶加热融化，操作时间可缩短至半小时至一小时左右，价格低廉，简便易行，易于推广。本发明通过制备回收孔，通过手提式紫外灯实时观察，使得凝胶中的dna电泳至回收孔，直接用回收孔内液体进行回收，大大提高了回收效率，可以减少大大减少核酸电泳前处理所用试剂量(如限制性内切酶、dna聚合酶等)，且避免加热溶胶过程，极大地节约了回收时间，简单方便，易于推广。

附图说明

图1本发明系统的部分物品结构示意图。

图2为使用本发明回收系统，dna从加样孔电泳到达回收孔，并越过回收孔后再次进入凝胶。

图3为dna电泳比较回收前，传统方法割胶回收以及使用本发明系统回收后的电泳图。

图4为计算得到的dna回收效率统计图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

如图1所示，一种以回收孔为基础的高效割胶回收系统，由dna电泳缓冲液，加样梳，回收梳，手提式紫外灯，玻璃板，平衡液，dna结合液，dna吸附柱，漂洗液，洗脱液组成。准备本发明的各项物品，图1中a为加样梳，b为回收梳，c为制备好的有加样孔及回收孔的琼脂糖凝胶效果图，d为手提式紫外灯，e为玻璃板。在制备凝胶时，使用加样梳和回收梳制备加样孔及回收孔。电泳时，保持电泳液液面略低于凝胶表面，同时向回收孔中加入电泳液，使得dna进入回收孔中溶解在回收孔内电泳液内，且回收孔内电泳液不会扩散到回收孔外。利用dnamarker进行电泳，电泳时紫外灯实时观察，在部分marker越过回收孔后，进行凝胶成像。如图2所示，marker越过回收孔后dna浓度与进入回收孔前相似，表明进入回收孔的dna不会扩散到回收孔外，而是全部重新进入凝胶继续电泳。

dna电泳缓冲液为1xtae缓冲液，平衡液配方为三羟甲基氨基甲烷(tris)：11～13克，与去离子水混合，用浓盐酸调节混合溶液的ph值至9.0～10.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升。dna结合液配方为三羟甲基氨基甲烷(tris)：11～13克，乙二胺四乙酸二钠(edta)：6～8克，将两种组分称量后与去离子水中混合，用浓盐酸调节混合溶液的ph值至5.0～7.0，最后用去离子水定容溶液至1000毫升。dna吸附柱为常用商业化硅膜吸附柱，漂洗液配方为无水乙醇：700～800毫升，称量后与去离子水中混合，最后用去离子水定容溶液至1000毫升；洗脱液为无核糖核酸酶的去离子水。本实施例所用dna电泳缓冲液、平衡液，dna结合液，dna吸附柱，漂洗液，洗脱液均购于天根生化科技(北京)有限公司成品。

实施例2

在制备凝胶时，使用加样梳和回收梳制备加样孔及回收孔。取相同量的dna，分2个孔进行电泳。电泳时，保持电泳液液面略低于凝胶表面，同时向回收孔中加入电泳液，使得dna进入回收孔中溶解在回收孔内电泳液内，且回收孔内电泳液不会扩散到回收孔外。在dna电泳至回收孔前，暂停电泳，一个孔的dna使用天根生化科技(北京)有限公司生产的大量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(货号dp210)进行回收。另一个孔的dna继续电泳，将手提式紫外灯置于玻璃板下方进行实时观察，当观察到dna条带到达回收孔时停止电泳，利用吸管收集回收孔内液体，加入dna结合液，随后使用平衡液预处理dna吸附柱，将样品加入到dna吸附柱中离心，使dna与吸附柱结合，使用漂洗液漂洗，室温放置数分钟干燥，最后加入洗脱液洗脱。将回收前的dna，以及使用传统方法和本发明所得的洗脱液重新进行电泳，比较回收效率。如图3所示，使用本发明得到的洗脱液，dna含量明显高于传统方法，并与回收前的dna含量接近，从而可大大减少核酸电泳前处理所用试剂量(如限制性内切酶、dna聚合酶等)。

实施例3

在制备凝胶时，使用加样梳和回收梳制备加样孔及回收孔。取相同量的dna，分2个孔进行电泳。电泳时，保持电泳液液面略低于凝胶表面，同时向回收孔中加入电泳液，使得dna进入回收孔中溶解在回收孔内电泳液内，且回收孔内电泳液不会扩散到回收孔外。在dna电泳至回收孔前，暂停电泳，一个孔的dna使用天根生化科技(北京)有限公司生产的大量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(货号dp210)进行回收。另一个孔的dna继续电泳，将手提式紫外灯置于玻璃板下方进行实时观察，当观察到dna条带到达回收孔时停止电泳，利用吸管收集回收孔内液体，加入dna结合液，随后使用平衡液预处理dna吸附柱，将样品加入到dna吸附柱中离心，使dna与吸附柱结合，使用漂洗液漂洗，室温放置数分钟干燥，最后加入洗脱液洗脱。测定回收前的dna，以及使用传统方法和本发明所得的洗脱液中的dna浓度，并根据洗脱液的体积，计算dna含量，分析使用传统方法和本发明所得洗脱液的回收效率。如图4所示，使用本发明所述回收孔回收方法，回收效率为70％左右，显著高于传统割胶回收方法组(传统方法核酸回收率20％左右)，从而可大大减少核酸电泳前处理所用试剂量(如限制性内切酶、dna聚合酶等)。