一种诊治胶质瘤的分子标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种诊治胶质瘤的分子标志物及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

人脑胶质瘤是最常见和最致命的原发性脑瘤，约占所有原发性脑肿瘤的75％。根据世界卫生组织(世卫组织)，胶质瘤在组织病理学上分为4个肿瘤级别(i-iv)。世卫组织iv级或多型胶质母细胞瘤(gbm)预后最差，在初次诊断后，平均生存时间仅为12至15个月。

mirna是一类内源性20-22核苷酸(nt)长的单链非编码rna，已被确认为转录后水平基因表达的负调控因子。microrna(mirna)在人类癌症的发生发展、进展和复发中发挥了重要作用。let-7首先在秀丽隐杆线虫中被鉴定为一种基因，由于幼虫生长异常，其突变对这些生物是致命的。生物信息学分析表明let-7microrna在不同动物物种中高度保守，支持其在早期发育阶段的关键作用。let-7确保与退出细胞周期和终端分化相关的事件的正确时间。发明人发现，mir-let-7家族低水平表达已在许多胶质瘤中得到报道，包括胰腺癌、人类结肠癌、人类肺癌和乳腺癌细胞。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种诊治胶质瘤的分子标志物及其应用。经试验研究证明，gale(udp-半乳糖-4-差向异构酶)基因及其表达产物在胶质瘤中上调表达，且与胶质瘤分级的增加呈正相关；同时，研究进一步发现，mir-let-7i-5p具有靶向调控gale基因的作用，mir-let-7i-5p通过与通过gale3'-utr结合，抑制gale蛋白产生，从而降低胶质瘤细胞增殖和迁移，诱导人胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡。因此，mir-let-7i-5p和gale基因及其表达产物可以作为诊治胶质瘤的分子标志物。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用。

进一步的，mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；

所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(i-ii级)和高级别胶质瘤(iii-iv级)；

其中，所述mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物均可为人源。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p和/或gale的转录；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p调控的靶基因的表达情况或gale表达产物情况的物质。

其中，所述靶基因包括gale基因；

优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p和/或gale的转录；采用elisa、胶体金试纸条、蛋白芯片检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p调控的靶基因的表达情况或gale表达产物情况；

更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物。

本发明的第三个方面，提供能够促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质和/或抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a')-(c')至少一种中的应用：

(a')抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(b')抑制胶质瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；

(c')抑制胶质瘤细胞的生长，或者制备用于抑制胶质瘤细胞生长的产品。

所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(i-ii级)和高级别胶质瘤(iii-iv级)；

本发明的第四个方面，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质和/或抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质；

对于促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质而言，包括采用基于rna的microrna功能性获得技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-let-7i-5p表达和/或促进其活性；优选为人工合成mir-let-7i-5p的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调mir-let-7i-5p表达的启动子。

对于抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质而言，包括gale蛋白特异的抗体、针对galemrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的迁移、增殖和/或生长。

进一步的，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。

优选的，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

进一步优选的，所述药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明有益效果：本发明首次证明gale(udp-半乳糖-4-差向异构酶)基因及其表达产物在胶质瘤中上调表达，且与胶质瘤分级的增加呈正相关；同时，研究进一步发现，mir-let-7i-5p具有靶向调控gale基因的作用，mir-let-7i-5p通过与通过gale3'-utr结合，抑制gale蛋白产生，从而降低胶质瘤细胞增殖和迁移，诱导人胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡。因此，mir-let-7i-5p和gale基因及其表达产物可以作为诊治胶质瘤的分子标志物，为胶质瘤等相关疾病的诊断和治疗提供了新的靶点，从而指导临床医师为受试者提供预防方法或者治疗方案，就有良好的实际应用之价值。

附图说明

图1为gale的表达与胶质瘤的肿瘤分级相关系列图；其中，图1a为定量分析tcga数据集中galemrna在胶质瘤中的表达水平图；图1b和图1c分别是在tcga(n＝667)数据库中分析gale在低级别胶质瘤lgg和胶质母细胞瘤gbm患者中的预后意义图；图1d为不同级别胶质瘤和正常脑标本gale免疫组化染色的代表性图，图1d中上方图放大倍数×200，下方图放大倍数×400，分界点设在gale表达量的中值。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图2为gale沉默可降低胶质瘤细胞的增殖系列图；其中，图2a和图2b为实时荧光定量pcr分析显示，si-gale转染后gale的相对mrna水平显著降低，以gapdh为对照，免疫印迹的溶解产物(12μg)从u87和u251细胞转染和阴性对照(nc)和galesirnas孵化与gale抗体；β-actin作为内参；图2c和图2d为cck-8检测基于od450的u87和u251细胞生长曲线图；图2e和图2f为edu分析在转染48小时后进行图；图2g为si-gale处理胶质母细胞瘤细胞克隆性降低图。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图3为gale沉默降低胶质瘤细胞的迁移系列图；其中，图3a为24小时内用u87细胞进行vm形成实验；图3b为用nc或si-gale转染u87细胞经transwell法孵育6小时后细胞迁移图；图3c为用nc或si-gale转染u87，进行伤口愈合实验图，恢复时间为24h；图3d为用nc或si-gale转染u251，进行伤口愈合实验图，恢复时间为24h；图3e为用nc或si-gale转染u87经transwell法孵育6小时后迁移细胞数柱状图；图3f为用nc或si-gale转染u87和u251细胞伤口愈合率柱状图，恢复时间为24h。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图4为gale的下调导致人胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡系列图；其中，图4a用nc或si-gale转染u87和u251细胞，采用流式细胞术进行细胞周期分析图；图4b为用nc或si-gale转染u87和u251细胞，采用流式细胞术中annexinv-fitc抗体和pi染色检测细胞凋亡图；图4c为用nc或si-gale转染u87细胞，采用流式细胞术进行细胞周期分析柱状图；图4d为用nc或si-gale转染u251细胞，采用流式细胞术进行细胞周期分析柱状图；图4e为用nc或si-gale转染u87和u251细胞，采用流式细胞术中annexinv-fitc抗体和pi染色检测细胞凋亡百分比柱状图；图4f-i为使用westernblot检测已知细胞周期调控因子、凋亡、emt标志物及可能的细胞信号通路蛋白表达水平图。β-actin被用作内参。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图5为mir-let-7i-5p直接靶向gale；其中，图5a为gale中mir-let-7i-5p结合位点序列及3'-utr荧光素酶测定结果；利用生物信息学预测gale3’-utr中mir-let-7i-5p结合位点；将3’-utr载体与mir-let-7i-5p或mirna阴性对照共转染u251细胞，转染48h后测定细胞裂解液中荧光素酶的相对活性；将荧光素酶活性水平与mirna阴性对照转染的细胞进行归一化至1；图5b-e为实时荧光定量pcr分析显示，转染mir-let-7i-5pmimics后gale的相对mrna水平显著降低，以gapdh为对照，gale的下调表达经mir-let-7i-5pmimics转染后，经westernblotting证实，β-actin被用作内参。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图6为过表达mir-let-7i-5p可降低胶质瘤细胞的增殖系列图；其中，图6a和图6b为edu分析在转染48小时后进行，用mir-let-7i-5p模拟物治疗胶质母细胞瘤细胞，图6c降低细胞克隆性图；图6d为通过westernblot比较nc组与mir-let-7i-5pmimics组emt标志物表达、细胞周期调控因子等可能的细胞信号通路蛋白表达图。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图7为mir-let-7i-5p的过表达降低胶质瘤细胞的迁移系列图；其中，图7a为24小时内用u87细胞进行vm形成实验；图7b为用nc或mir-let-7i-5pmimics转染u87细胞；经transwell法孵育6小时后评估细胞迁移情况图；图7c为用nc或mir-let-7i-5pmimics转染u87细胞，进行伤口愈合实验图，恢复时间为24h；图7d为用nc或mir-let-7i-5pmimics转染u251细胞，进行伤口愈合实验图，恢复时间为24h；图7e为用nc或mir-let-7i-5pmimics转染u87细胞；经transwell法孵育6小时后评估细胞迁移柱状图；图7f为用nc或mir-let-7i-5pmimics转染u87和u251细胞，伤口愈合率柱状图，恢复时间为24h。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图8为敲除gale抑制体内肿瘤发生系列图；其中，图8a采用生物荧光成像(biolescenceimaging,bli)系统评价各组balb/c裸小鼠原位异种移植胶质瘤的肿瘤进展；图8b为测量肿瘤大小柱状图(mm³)；图8c为植入u87mg阴性对照或sh-gale细胞的动物生存分析(log-rank检验p<0.01；每组5只)；图8d为he染色的鼠脑u87mgnc组或sh-gale异种移植组的切片；图8e-h为异种移植切片中gale、bcl-2、ki-67和mmp2的免疫组化图；放大倍数：200倍和400倍。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明中术语解释和说明：

mirna表达谱芯片：原理是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

核酶保护分析技术(rpa)：mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高。

rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)：是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞和肿瘤中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析。

原位杂交(insituhybridization)：原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。

高通量测序(high-throughputsequencing)：又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。

免疫检测方法：是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabellingtechnique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)，胶体金免疫层析法等。

酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定od值判定结果。

胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜、聚酯膜、尼龙膜和pvdf膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中硝化纤维膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。硝化纤维膜可捕获一定量的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、硝化纤维膜和吸水纸依次固定于pvc板，即成试纸条。

基于rna的microrna功能获得性技术：即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性mirmimics技术：该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。

如前所述，mir-let-7i-5p与胶质瘤进展的关系尚不清楚；因此有必要对mir-let7i-5p在胶质瘤中的具体分子机制进行研究分析。

同时，现有技术中公开了gale是一种双功能酶，其作为半乳糖代谢的leloir通路的一部分，催化dp-半乳糖(udp-gal)向udp-葡萄糖(udp-glc)的可逆转化，并在nad⁺的存在下由udp-n-乙酰半乳糖胺(udp-galnac)生成udp-n-乙酰半乳糖胺(udp-galnac)，这是生成糖基糖蛋白合成糖基的必要步骤。

gale在各种代谢环境中被动态调节。据报道，udp-半乳糖转化为udp-葡萄糖的缺陷导致半乳糖血症的一般特征，包括呕吐、低通气、癫痫、黄疸、半乳糖尿和肝肿大。

而在本发明中，研究发现gale(udp-半乳糖-4-差向异构酶)基因及其表达产物在胶质瘤中上调表达，且与胶质瘤分级的增加呈正相关；同时，研究进一步发现，mir-let-7i-5p具有靶向调控gale基因的作用，mir-let-7i-5p通过与通过gale3'-utr结合，抑制gale蛋白产生，从而降低胶质瘤细胞增殖和迁移，诱导人胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡。

有鉴于此，本发明一个具体实施方式中，提供mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用。

本发明又一具体实施方式中，提供mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。

本发明又一具体实施方式中，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的增殖、生长和/或迁移；

本发明又一具体实施方式中，所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(i-ii级)和高级别胶质瘤(iii-iv级)；

本发明又一具体实施方式中，其中，所述mir-let-7i-5p和/或gale基因及其表达产物均可为人源。

本发明又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p和/或gale的转录或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p调控的靶基因的表达情况或gale表达产物情况的物质。

其中，所述靶基因包括gale基因；

本发明的又一具体实施方式中，采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p和/或gale的转录；采用elisa、胶体金试纸条、蛋白芯片检测胶质瘤样品中mir-let-7i-5p调控的靶基因的表达情况或gale表达产物情况；

本发明又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物。

本发明又一具体实施方式中，提供能够促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质和/或抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a')-(c')至少一种中的应用：

(a')抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(b')抑制胶质瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；

(c')抑制胶质瘤细胞的生长，或者制备用于抑制胶质瘤细胞生长的产品。

所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(i-ii级)和高级别胶质瘤(iii-iv级)；

本发明又一具体实施方式中，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质和/或抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质；

对于促进mir-let-7i-5p表达和/或活性提高的物质而言，包括采用基于rna的microrna功能性获得技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-let-7i-5p表达和/或促进其活性；优选为人工合成mir-let-7i-5p的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调mir-let-7i-5p表达的启动子。

对于抑制gale基因及其表达产物和/或活性降低的物质而言，包括gale蛋白特异的抗体、针对galemrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的迁移、增殖和/或生长。

本发明又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。

本发明又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

本发明又一具体实施方式中，所述药物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例

1.1cox比例风险模型

使用cox比例风险模型来选择与患者生存相关的基因，并为未来的预测建立一个预测模型。结果时间定义为无病生存月。选择n个基因构建cox回归模型；对于每个基因gj(j＝1,2，…，n)，建立以下cox模型，以考虑t时刻生命状态或死亡的危害。

其中为基因gj的基线危险函数，x1、x2、…、xp为协变量。调整的协变量包括种族、年龄、性别、kpm(karnofskyperformance)评分、肿瘤状态和新辅助治疗的历史。通过以上方法，选择了gale。

1.2组织样本及资料库

本实施例包括来自山东大学齐鲁医院神经外科的神经胶质瘤样本和正常脑组织。本研究方案经医院制度审查委员会批准，并经每位受试者书面知情同意。患者常规手术治疗获得4例正常脑、4例whoi级、8例whoii级、7例iii级、9例iv级(gbm)组织标本。胶质瘤标本由两名经验丰富的临床病理学家根据who肿瘤分类进行验证和分类。癌症基因组图谱研究网络样本的临床信息(n＝667：采用tcga,http://cancergenome.nih.gov)进行分析，见表1。

表1gale在具有多种临床病理特征的人脑胶质瘤患者中的表达相关性；

p值由卡方和费雪精确检验得到

1.3细胞培养和试剂

人胶质母细胞瘤细胞株u87和u251购自中国科学院细胞库。所有细胞使用含10％胎牛血清的dmem培养基培养并在37℃和含5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育。

1.4细胞转染

由genepharma(shanghai,china)设计并提供了成熟的mir-let7i-5p模拟物、mir-let7i-5p抑制剂和阴性对照双链(nc)sirna拮抗gale(简称sigale)。使用lipofectamine3000(invitrogen，卡尔斯巴德，美国，ca,ca)按照制造商的说明进行细胞转染和共转染。实时荧光定量pcr检测转染效率。转染48小时后，取胶质瘤细胞进行后续实验。

1.5细胞生存能力分析

u251和u87细胞在96孔细胞培养皿中，密度为3000细胞/孔。转染24、48、72h后用细胞计数kit-8分析细胞增殖情况。每孔添加10μlcck-8溶剂，然后在细胞培养箱中孵育1h。然后利用ensight(perkinelmer)在450nm处测量光密度。在适当的sigale、mir-let7i-5p或nc处理后，使用eduapollo567体外试剂盒(cell-light)测定在24孔培养皿中培养的细胞的dna合成。edu测定结果采用徕卡dmi8显微镜检测。

1.6愈合试验

在6孔板中每孔铺1×10⁵个细胞并孵育一夜之后，使用sigale，mir-let7i-5p或阴性对照来转染细胞。以90％的聚合度，无菌吸管尖划破细胞单层，pbs去除游离细胞。划伤板在1％胎牛血清dmem中培养。在徕卡显微镜下，在0到12小时沿着刮线拍摄图像。根据相对于原始划伤距离偏移的距离，得到相对划伤宽度。

1.7细胞迁移实验

细胞迁移实验使用的是transwell小室(测量直径6.5毫米，8μm孔隙大小，corning公司生产)。transwell小室的上室中使用无血清培养基铺5×10⁴转染后的细胞。加入10％胎牛血清的培养基至下室中。12、24和48小时后，使用棉棒去除小室内面未迁移的细胞。迁移至下表面的细胞使用结晶紫染色固定15min，显微镜下计数。使用5个随机视图来计细胞数。

1.8生物信息学预测和荧光素酶报告分析

利用tcga数据集中可用的基因表达谱对gale进行相关分析。利用多目标预测程序，包括在线mirna预测工具targetscanhuman7.2和mirbase，识别了计算机辅助算法预测的常见mir-let-7i-5p目标。从济南biosune获得mir-let-7i-5p-gale和mir-let-7i-5p-mutgale(目标种子序列突变)的报告子序列。胶质瘤细胞用荧光素酶报告物和lipofectamine3000检测物质或载体共转染。转染细胞48小时后，根据制造商说明，采用双荧光素酶报告试剂盒(promega)分析荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性通过紫苏荧光素酶活性归一化。

1.9rna提取和实时定量pcr

采用trizol试剂，按照制造商协议提取总rna。然后，根据制造商的说明书，用mirnastem-looprt引物或u6rt引物利用revertraaceqpcrrt试剂盒对总rna进行逆转录，生成cdna。使用sybrpremixextaqtm试剂盒进行实时pcr，引物见表2。本实验使用480ii仪器进行。u6和gapdh表达水平作为内源性对照。绝对的表达水平被计算成浓度比率使用罗氏480ii系统。

表2寡核苷酸序列

af,正向引物；r,反向引物；

b野生型靶点区域采用斜体加粗表示；突变型靶点区域采用下划线表示.

1.10免疫印迹分析

采用含1％pmsf的ripa缓冲液提取总蛋白。将等量的蛋白质装入10％的sdspolyacrylamide凝胶中。接下来，蛋白印记使用一抗在4℃冰箱过夜,然后用辣根过氧化酶标记的二抗在室温孵育1h。最后,蛋白质条带使用chemidocxrs+(bio-rad)和imagelab软件来显像。主要使用抗体是gale抗体(1:5000abcam)和其他相关的蛋白质抗体，内参使用β-actin。

1.11免疫组织化学染色

用4％甲醛固定取自小鼠的人脑胶质瘤组织样本或实体瘤。肿瘤石蜡包埋组织切片5μm厚度和固定在载玻片上，使用1mmol的edta来进行抗原修复。在含有3％过氧化氢的甲醇中孵育切片以灭活内源性过氧化物酶活性，然后切片放置在pbs中冲洗6分钟。接下来,切片使用山羊血清在室温下孵化2h，然后加一抗4℃孵育过夜。然后用pbs冲洗切片，用辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔抗体或抗小鼠抗体孵育，然后用二氨基联苯胺反应，用mayer的苏木精反染。

1.12流式细胞术分析

流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡水平。细胞周期分析,转染神经胶质瘤细胞被胰蛋白酶化收集,使用冷pbs冲洗三次,然后使用70％乙醇固定后4℃过夜。pbs洗涤后，转染的细胞与碘化丙铵在室温下黑暗中孵育15min。最后，使用facscan流式细胞仪(bd,usa)对细胞进行分析。

根据制造商说明书，使用annexinv-fitc凋亡检测试剂盒(invitrogenlifetechnologies,ca)分析细胞凋亡。收集转染的细胞，室温下与annexinv-fitc和pi在暗处孵育15min。然后，使用facscan流式细胞仪(bd,usa)对这些细胞进行分析。每个实验进行三次。

1.13小鼠大脑原位种植胶质瘤模型

为了进行动物体内实验，人胶质瘤细胞异种移植是通过仪器定向植入转染luciferase-labeledu87细胞(1×10⁶个细胞/鼠)入雄性balb/c裸鼠的大脑(江苏jicuiyaokang生物科技有限公司、南京)。采用慢病毒载体lv3-gale-home-899或lv3阴性对照(genepharma,shanghai)对培养的荧光素酶标记的u87细胞进行标准方案感染。将小鼠随机分为两组(nc、shgale)，每组5只。perkinelmerivis每5天对动物进行一次成像。根据伦理准则，当最终图像显示两组老鼠在第20天之间有足够显著的差异时，老鼠被处死；取整脑，4％多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋。连续切片(5μm厚)并进行h&e染色，然后在显微镜下观察。小鼠的处理和实验程序按照实验动物指南进行。实验符合中国卫生部动物管理规定，实验方案经山东大学动物保护与利用委员会批准。

1.14统计分析

所有实验进行三次重复。利用spss22.0和graphpadprism软件生成统计分析和生成实验图形。描述性统计，包括均值±sd，t检验，kaplanmeier分析，log-rank检验，单因素方差分析和斯皮尔曼相关性检验,用于分析差异的显著性,*p<0.05,**p<0.01,还有***p<0.001被认为是具有统计学意义。

2.结果

2.1gale表达增加与神经胶质瘤分级级别呈正相关

为研究gale在胶质瘤发育中的作用，从tcga数据集中分析了gale在gbms、低级别胶质瘤(lggs)以及正常脑组织中的基因表达水平。gbms中galemrna水平明显高于tcga中lggs和正常脑组织(图1a)。采用免疫组织化学方法检测了来自济南市齐鲁医院的人脑胶质瘤(32例)和正常脑组织(4例)的gale蛋白水平。与mrna表达结果一致，gale蛋白在gbms中高于lggs或正常大脑(图1d)。因此，在公开的数据库和原发性肿瘤标本队列中，gale与肿瘤分级的增加呈正相关。

2.2gale表达与预后不良相关

在kaplan-meier生存曲线中检验gale表达在神经胶质瘤患者总体生存(os)中的预后价值。在tcga(n＝667)中，lgg(p<0.001)和gbm(p<0.05)患者中，gale表达与预后显著差于gale表达(图1b,1c)。因此，gale可能是一种新的神经胶质瘤生物标志物。

2.3gale沉默可以减少胶质瘤细胞在体外的增殖和迁移

为了直接检测gale在胶质瘤细胞存活和增殖中的作用，将细胞转染sirna敲除gale，并进行cck-8和edu实验。gale的下调导致转染48h后u87和u251细胞中od450值和edu阳性细胞百分比均有统计学意义的下降(图2c-2f)。为了进一步确定gale是否会影响细胞生长，使用了一个克隆试验来评估gale对细胞增殖的影响。值得注意的是，在sirna处理组中，gbm细胞株对细胞克隆增值有明显的抑制作用(图2g)。以上结果提示gale调控gbm细胞的增殖。

采用创伤愈合试验和transwell试验观察gale在gbm细胞迁移中的作用。u87和u251细胞分别用nc或sigale处理，与nc组相比，sigale组在创面愈合实验和transwell实验中创面闭合效果较差，染色细胞较少(图3)。结果表明，gale的抑制导致了gbm细胞系迁移能力的显著抑制。其次，利用westernblot对gale下游目标进行了研究。gale基因敲除显著降低了n-cad、mmp-2和包括胶质瘤在内的各种类型癌症进展所必需的一些基因/通路的水平(图4h,4i)。

2.4gale的下调可诱导人胶质瘤细胞周期阻滞和凋亡

流式细胞术细胞周期分析也表明，gale敲低可增加g1期u87和u251细胞的数量(图4a,4c,4d)。此外，gale沉默促进u87和u251细胞系细胞凋亡，与对照相比(图4b,4e)。在westernblot分析中，gale沉默后，细胞周期蛋白依赖性激酶2(cdk2)、cdk4、细胞周期蛋白a2和bcl-2表达降低。与此相反，bax和c-caspase3被认为是肿瘤抑制因子，在sigale组中表达增加(图4f,4g)。综上所述，gale的缺失可以抑制神经胶质瘤细胞的细胞周期进程和诱导细胞凋亡。

2.5mir-let-7i-5p靶向调控gale

一般认为，mirna通过与靶基因的3’-utr结合进行转录后调控。为了找到gale调控细胞运动和侵袭能力的靶点，使用生物信息学预测软件targetscan(http://www.targetscan.org/)。在这成千上万的候选对象中，关注的是mir-let-7i-5p。为了发现mir-let-7i-5p是否通过gale3’-utr调控细胞运动和侵袭能力，进行了荧光素酶报告试验。使用u251胶质瘤细胞进行荧光素酶检测(图5a)。转染mir-let-7i-5p的细胞中荧光素酶活性下降到大约76.8％。为了检测mir-let-7i-5p在蛋白水平上的抑制作用，在mir-let-7i-5p抑制剂后48h进行westernblot分析，并模拟转染到u251和u87细胞中。可以看出，与阴性对照mirna转染的胶质瘤细胞相比，u251和u87细胞的gale蛋白水平明显下降。

2.6gale参与mir-let-7i-5p诱导的gbm细胞增殖和迁移的抑制

为了探究mir-let-7i-5p在gbm细胞中是否具有类似gale的功能，采用了rna的方法。mir-let-7i-5p的过表达被real-timert-pcr和westernblot证实(图5b-5e)。在过表达mir-let-7i-5p后，对u87和u251细胞系进行了edu和菌落形成检测。mir-let-7i-5p过表达组与nc组在两组实验中均有显著差异(图6a-6c)。

然后，伤口愈合和transwell实验观察mir-let-7i-5p在gbm细胞迁移中的作用。u87和u251细胞分别用mir-let-7i-5pmimics处理，mir-let-7i-5pmimics组在创面愈合实验和transwell实验中，与nc组相比，创面愈合实验和transwell实验中，分别表现为创面闭合迟缓和染色细胞较少(图7)，westernblot实验结果与sigale组相似(图6d)。这些结果表明，mir-let-7i-5p的过表达导致了显著的迁移能力抑制，与gale沉默的模式基本相同。

2.7gale基因沉默抑制体内肿瘤的发生

为了进一步研究gale蛋白在人脑胶质瘤中的作用，对肿瘤生长进行了体内评估。荧光素标记的u87胶质瘤细胞被表达gale靶向shrna或控制shrna的慢病毒转导。将sh-gale或阴性对照细胞植入裸鼠体内，建立原位异种移植。每组每周通过生物发光成像(bli)系统评估肿瘤的发展。与对照组相比，携带sh-gale细胞的动物肿瘤大小显著降低(图8a,8b)，边界更加明确(图8d)，存活率增加(图8c)。免疫组化证实sh-gale细胞产生的异种移植物gale蛋白水平降低。sh-gale异种移植物bcl-2、mmp-2和增殖指数ki-67也下降(图8e-8h)。这些结果表明，gale的抑制导致胶质瘤细胞在体内生长和侵袭的减少。

综上，本实施例结果证明了gale在胶质瘤特别是高级别胶质瘤中高表达，而mir-let-7i-5p可有效抑制gale蛋白产生，从而降低胶质瘤细胞增殖和迁移，表明gale可作为胶质瘤特别是高级别胶质瘤的生物分子标志物，而mir-let-7i-5p可作为一种新的胶质瘤抑制mirna。此外，gale可以是恶性胶质瘤，尤其是gbm患者潜在的治疗靶点。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

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<110>山东大学齐鲁医院

<120>一种诊治胶质瘤的分子标志物及其应用

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