一株嘴突凸脐蠕孢菌及其在防治水田杂草千金子中的应用的制作方法

本发明涉及微生物领域，特别涉及一株嘴突凸脐蠕孢菌及其在防治水田杂草千金子中的应用。
背景技术：
：千金子俗称节节草、百节草，为禾本科千金子属一年生杂草，种子繁殖力强，种子细小，在土壤中生命力很强，随稻田灌溉水流、风力、农家肥料传播扩散。千金子种子感光性强，在强光下易萌发出草。它在5叶期前与稗草几乎一模一样，叶片光滑无毛，但在叶枕部有膜状叶舌，6叶期以后开始匍匐生长，茎节落地生根，并开始分枝，很快呈丛生状。千金子秆脆易断，且叶色与稻叶相近，人工拔除较为困难。水稻是世界上重要的粮食作物，杂草的发生严重影响着水稻的产量，一年生禾本科杂草千金子在部分直播田的危害已经超过了稗草。千金子在逆境(水淹和旱地)环境中也有很好的生长和生存能力，具有较强的分蘖能力以及较高的成株率，且对常用除草剂不敏感(董立尧等2003，chauhanetal2013)，导致千金子防治困难。meenakanit等报道，以千金子为主的恶性杂草导致泰国中部及南部80.3％稻区产量降低(meenakanitetal1998)。在马来西亚地区超过50％的水稻种植区都有千金子的发生(begumetal2005)。千金子在直播田已成为仅次于稗草的恶性杂草，在部分直播稻田的危害甚至已经超过稗草，严重影响着水稻生长及其产量，对粮食安全构成了严重威胁(陆云梅等2001，程勤海等2011)。由于其危害严重，在生产中化学防治仍然是防治千金子的重要措施。如二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、丁草胺、丙草胺、丁·恶乳油，但这些除草剂对其防治效果并不理想(徐加健等，2007)。氰氟草酯是一种新型的accase抑制剂类除草剂，于2006年在我国取得登记，由于其对水稻安全，对千金子特效，成为水稻防治千金子等一年生禾本科杂草的重要除草剂品种之一。但是，最近的研究表明，许多地区的稻麦田千金子对氰氟草酯产生了高抗性，且明确了千金子对常见除草剂具有交互抗性(董立尧等，2017)。对化学除草剂产生抗性，且施用化学除草剂过多，会对环境造成二次污染，存在化学物质残留和超标，危害公众健康。这是现如今农业生产上不可避免的问题。而微生物除草剂绿色环保对人体无害并对水稻安全性极高，且杂草对其不易产生抗药性。因此，目前开发微生物除草剂已经引起了各杂草学家们的广泛关注。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株嘴突凸脐蠕孢菌。本发明的另一目的在于提供所述嘴突凸脐蠕孢菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一株嘴突凸脐蠕孢菌，分类命名为exserohilumrostratum(嘴突凸脐蠕孢)y9511，保藏编号为gdmccno:60535，于2019年1月3日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)。一种上述嘴突凸脐蠕孢菌的孢子。所述的嘴突凸脐蠕孢菌的孢子的制备方法，包括如下步骤：将嘴突凸脐蠕孢菌接种到pda培养基上，于28℃～30℃下进行培养，然后过滤去除菌丝，，得到嘴突凸脐蠕孢菌的孢子。所述的培养的时间优选为14天。所述的过滤为用纱布进行过滤；优选为用四层纱布进行过滤。所述的嘴突凸脐蠕孢菌和/或嘴突凸脐蠕孢菌的孢子在制备生物除草剂中的应用。所述的草为千金子；优选为水稻田千金子。一种用于千金子生物防治的生物制剂，其活性成分为上述嘴突凸脐蠕孢菌和/或嘴突凸脐蠕孢菌的孢子。所述的千金子优选为水稻田千金子。所述的生物制剂中嘴突凸脐蠕孢菌的孢子的浓度为105～107孢子/ml；优选为106孢子/ml。所述的生物制剂中还含有乳化剂和水等。所述的乳化剂在所述生物制剂中的浓度为体积百分比0.05％。所述的乳化剂优选为吐温80(tween80)。所述的嘴突凸脐蠕孢菌，嘴突凸脐蠕孢菌的孢子，和/或用于水稻田千金子生物防治的生物制剂在防治水田杂草千金子中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)嘴突凸脐蠕孢菌y9511菌株为水稻田中千金子叶片上分离的对水稻等作物安全无害，且对千金子具有防治作用，在运用中具有安全性，适用于稻田千金子的生物防治。(2)使用方法简单实用：将嘴突凸脐蠕孢菌制成水乳剂，工艺简单实用。(3)防治效果显著且稳定：嘴突凸脐蠕孢菌菌株孢子悬液对处于二叶一心时期的千金子具有显著地防除效果。附图说明图1是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511的孢子形态图；其中，图a为y9511在显微镜下放大10倍的孢子形态；图b为y9511在显微镜下放大20倍的孢子形态；图c和d为y9511的显微镜的孢子长度测量图。图2是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511菌丝形态图；其中，图a和b均为y9511菌丝在显微镜下的形态图。图3是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511菌落形态图；其中，图a为培养嘴突凸脐蠕孢y9511的平板的正面；图b为培养嘴突凸脐蠕孢y9511的平板的背面。图4是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对千金子的防治效果图；其中，图a、b、c和d为空白对照，图a、b、c和d为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d和21d后千金子的生长状态。图5是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对水稻安全性图；其中，图a、c、e为空白对照，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后水稻的生长状态。图6是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对小麦及高粱的安全性图；其中，图a、c、e为空白对照(小麦)，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后小麦的生长状态；图g、i、k为空白对照(高粱)，图h、j、l为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后高粱的生长状态。图7是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对甘蔗及苦瓜的安全性图；其中，图a、c、e为空白对照(甘蔗)，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后甘蔗的生长状态；图g、i、k为空白对照(苦瓜)，图h、j、l为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后苦瓜的生长状态。图8是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对大豆及玉米的安全性图；其中，图a、c、e为空白对照(大豆)，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后大豆的生长状态；图g、i、k为空白对照(玉米)，图h、j、l为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后玉米的生长状态。图9是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对花生及菜心的安全性图；其中，图a、c、e为空白对照(花生)，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后花生的生长状态；图g、i、k为空白对照(菜心)，图h、j、l为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后菜心的生长状态。图10是本发明的嘴突凸脐蠕孢y9511对返枝苋及稗草的安全性图；其中，图a、c、e为空白对照(返枝苋)，图b、d、f为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后花生的生长状态；图g、i、k为空白对照(稗草)，图h、j、l为嘴突凸脐蠕孢y9511菌菌液处理48h、7d、14d后稗草的生长状态。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得；其中：pda培养基配方为：马铃薯葡萄糖琼脂(pda)40.1g，5g琼脂，用1l水溶解。实施例1一、病原菌的采集2017年10月在江西赣州石城小松镇罗源村(北纬26°25′52″，东经116°18′26″)采集感病千金子。将发病的整株或叶片采集后，将其平展在报纸内带回实验室。二、病原真菌的分离及纯化1、病原菌的分离将发病的叶片剪下后放在滤纸上，在无菌操作台内，用75％(v/v)的酒精浸泡30s后，再用无菌水浸泡30s，进行表面消毒，从发病叶片的病健交界处上选取0.5～1cm长的病斑，用已消过毒的剪刀将其剪下，然后置于pda培养基上，在28℃恒温培养箱中培养。2、病原菌纯化及培养将步骤1中分离得到的菌株置于28℃的恒温培养箱中连续培养一周后，挑取培养基边缘的菌丝到新的pda培养基上，待其不再长出杂菌后，挑取单孢进行纯化。三、简单的接种筛选为了确定分离到的菌株是千金子的致病菌，而不是其他的杂菌，将分离到的5株病原菌(将其分别命名为y9510、y9511、y9512、y9513、y9515)回接在千金子上，鉴定是否能在千金子上致病。具体操作的步骤如下：(1)病原菌纯化及培养：在多次纯化后菌落边缘挑取菌丝接种于pda平板培养基上，并将其置于28℃的连续黑暗的恒温培养箱内培养。两周后，用0.05％(v/v)tween80水溶液洗下，在无菌条件下经四层纱布过滤获得孢子悬液；(2)接种：将步骤(1)中洗下的5种孢子悬液分别接种100μl到千金子离体叶片上，对照用自来水进行处理。(3)是否致病测定：在培养基中放入一片滤纸，用5ml无菌水将其润湿，将接种过病原菌的千金子离体叶片放入滤纸上，置于28℃的恒温培养箱中培养48小时(12小时光照，12小时黑暗)，然后移至气候室(温度30℃，湿度80％，12h光照/12h黑暗)中，记录其病斑大小。最后将对千金子具有致病性的菌株用10ml离心管制作的斜面培养基保存在4℃下，留作试验菌种。(4)结果如表1所示。表1病原菌对千金子离体叶片的致病力测定序号菌株病斑长度(cm)1y951002y95111.25±0.17a3y95120.50±0.09b4y951305y95150从病原菌对千金子离体叶片致病力测定的结果，我们选择了y9511作为防除水田杂草千金子的生防菌株。四、嘴突凸脐蠕孢菌株y9511菌种鉴定1、嘴突凸脐蠕孢菌株y9511的形态特征采用培养皿培养法，将菌株接种于pda培养基上，30℃培养，待长出菌落后，进行单胞分离，挑取单菌落在pda培养基上纯化，用于分类鉴定。挑取纯化好的菌株于有适量无菌水的载玻片上，在显微镜线观察菌株形态，其孢子及菌丝形态如图1和图2所示。菌丝灰褐色到黑褐色，不规则分枝。分生孢子为(50～120)×(12～22)μm，隔膜大多为6～15个，顶端屈膝状延伸，较中下部略粗，多隔膜，浅褐色到深褐色，长喙状，两端钝圆，两端细胞颜色较浅，脐点周围和顶端半透明。挑取纯化好的菌株于新的pda培养基上，30℃培养14天，观察菌丝落形态及菌落颜色。如图3所示，嘴突凸脐蠕孢菌株y9511菌落圆形，铺展，菌丝体为灰褐色至黑褐色，有气生菌丝，7d左右开始产孢，随时间的推移菌落中央孢子逐渐增多直至向边缘扩散，菌落边缘依旧为灰褐色，菌落背面也是灰黑色。2、嘴突凸脐蠕孢菌株y9511的分子生物学鉴定(1)基因组dna提取按sk8259(真菌)试剂盒操作。(2)pcr扩增pcr反应体系：试剂体积(μl)template(基因组dna20～50ng/μl)0.510×buffer(withmg2+)2.5dntp(各2.5mm)1酶0.2its1或its1(10um)0.5its2或its2(10um)0.5加双蒸h2o至25pcr循环条件：(3)使用引物its1：5’-agaagtcgtaacaaggtttccgtagg-3’；its2：5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’；以及brn1：5’-gccaacatcgcaaacatgg-3’；brn2：5’-gcaagcagcaccgtcaataccaat-3’。以菌株y9511的基因组dna为模板，对其its、brn序列进行扩增，分别扩增到长度为232bps和792bps，将菌株的扩增序列上传到ncbi网站进行blast比对分析，结果表明菌株y9511的its和brn基因序列与嘴突凸脐蠕孢(exserohilumrostratum)的同源性均为100％。通过对菌株y9511的分生孢子和菌丝形态观察，以及分子鉴定结果，鉴定该菌株为嘴突凸脐蠕孢。将所述菌株命名为嘴突凸脐蠕孢y9511，于2018年12月7日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，保藏编号为gdmccno:60535。实施例2一、嘴突凸脐蠕孢菌株y9511的除草效果1、y9511菌株孢子悬液制备将y9511菌株接种到9cm的含pda培养基的培养皿中，在30℃下培养14天，获得产出大量孢子的嘴突凸脐蠕孢菌；然后用0.05％(v/v)的tween80水溶液洗下，再在无菌条件下过四层纱布滤除菌丝得到孢子悬液；再将其配制成的浓度为106孢子/ml(用血球计数板计算孢子浓度)的孢子悬浮液。2、培养试验用千金子千金子采集于华南农业大学宁西试验基地，在28℃的恒温培养箱中培育到种子出苗，然后移栽至盆中，每盆移6株千金子，4次重复，置于室外生长。3、试验方法配置106孢子/ml的孢子悬液和0.05％(v/v)的tween80溶液。等千金子长至二叶一心时期，进行茎叶喷雾(喷施孢子悬液，喷施量为10ml；同时以tween80溶液为对照(ck))，一次施药，将喷完药的千金子放在28℃～30℃、80％湿度的人工气候室保湿培养48h，之后移入温室进行自然生长，14d以后调查株防效，21天后调查株防效和鲜重防效。根据调查数据，按式(1)计算各处理的株防效和鲜重防效(％)。根据调查数据，按式(1)计算各处理的株防效和鲜重防效(％)。式中：r为杂草生长抑制率，x0为对照的株数或鲜质量，x1为处理的株数或鲜重。4、试验结果通过上述试验，测定了菌株y9511的防除千金子的效果，试验结果见表2和图4，结果表明菌株y9511在第14d对千金子的室内鲜重防效可以达到94.68％，第21d可以达到100％。表2喷施106孢子/ml孢子悬液后对千金子防除(室内)效果二、嘴突凸脐蠕孢菌株y9511对水稻的安全性1、y9511菌株孢子悬液制备将y9511菌株接种到9cm的培养皿中，在30℃下培养14天，用0.05％(v/v)的tween80，过四层纱布滤除菌丝得到孢子悬液，配制孢子悬浮液的浓度为106孢子/ml。2、培养试验用水稻水稻品种为软华优6100(购于广州华农大种业有限公司)，在28℃的恒温培养箱中培育到种子出苗，然后移栽至盆中，每盆移6株水稻，4次重复，置于室外生长。3、试验方法配置106孢子/ml的孢子悬液和0.05％(v/v)的tween80溶液。等水稻长至二叶一心时期，进行茎叶喷雾(喷施孢子悬液，喷施量10ml；同时以tween80溶液为对照(ck))，一次施药，将喷完药的水稻放在28℃～30℃、80％湿度的人工气候室保湿培养48h，之后移入温室进行自然生长，7d和14d后分级并调查发病情况，按处理后植株叶片病害程度的不同将病害分级赋值。水稻不同病害程度分级参照陈勇(2001)的分级标准。水稻病害分级标准如下：0级：水稻无病害，用ns表示；1级：水稻叶片有病斑但不超过整片叶的1/2，用hs表示；2级：水稻全叶枯死，用s表示。4、试验结果通过上述试验，测定了菌株y9511对于水稻的安全性，试验结果见表3和图5，结果表明菌株y9511不侵染水稻。试验表明菌株y9511运用于水田时，其寄主范围专一。表3喷施106孢子/ml孢子悬液14d对水稻的安全性(室内)测定序号菌株编号感病程度1y9511ns三、病原菌y9511的寄主范围测定1、测定植物：小麦、高粱、甘蔗、苦瓜、大豆、玉米、花生、菜心、返枝苋、稗草。2、测定方法：配置106孢子/ml的孢子悬液和0.05％(v/v)的tween80溶液。等待测定植物分别长至一叶一心至三叶一心时期，进行茎叶喷雾(喷施孢子悬液，喷施量为10ml；同时以tween80溶液为对照(ck))，一次施药，将喷完药的植物放在28℃～30℃、80％湿度的人工气候室保湿培养48h，之后移入温室进行自然生长，7d和14d后分级并调查发病情况，按处理后植株叶片病害程度的不同将病害分级赋值。水稻不同病害程度分级参照陈勇(2001)的分级标准。水稻病害分级标准如下：0级：水稻无病害，用ns表示；1级：水稻叶片有病斑但不超过整片叶的1/2，用hs表示；2级：水稻全叶枯死，用s表示。3、试验结果通过上述试验，测定了菌株y9511对于其他八种作物及两种杂草的安全性，试验结果见表4和图6～10，结果表明菌株y9511不侵染小麦、高粱、甘蔗、大豆、苦瓜、花生、菜心、返枝苋；但在第48h时会在稗草和玉米叶片有少许病斑，但都不会超过整株的1/2，且长至14d后，病斑逐渐消失，植物恢复正常。表4第14d时病原菌y9511寄主范围测定上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一株嘴突凸脐蠕孢菌及其在防治水田杂草千金子中的应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物its1<400>1agaagtcgtaacaaggtttccgtagg26<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物its2<400>2gctgcgttcttcatcgatgc20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物brn1<400>3gccaacatcgcaaacatgg19<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物brn2<400>4gcaagcagcaccgtcaataccaat24当前第1页12