一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置的制作方法

本发明属于实验装置领域，具体涉及一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置。

背景技术：

膜片钳技术是神经科学研究领域的重要研究技术。该技术可记录单个神经元的电压、电流、细胞膜电阻等电学信息，被广泛应用于神经科学研究、神经药物筛选、神经疾病模型检测、神经元状态鉴定等方面。尽管该技术是神经科学领域一项重要技术，但诸多因素制约着该技术的普及和推广。其中，如何让离体低温脑片尽可能复温孵育至与在体相近的状态是最大限制因素。为了获取可供记录的离体脑片，实验动物需在麻醉状态下迅速取出脑组织。在应激状态下，动物脑组织代谢加快，对外界的损伤耐受性降低。为了尽可能减少损伤，脑组织需浸浴在0摄氏度左右的人工脑脊液中被均匀切成厚度为300微米的脑片，此时神经元处于“休克”状态。为了使神经元恢复至与在体相近的状态，切好的脑片需转移至26～28摄氏度95％o2/5％co2持续供给的人工脑脊液中复温孵育1小时。复温孵育是否成功，直接关系到后期能否顺利进行记录。影响脑片复温孵育的主要因素为以下三点：温度、氧浓度、ph值、渗透压。

现有的复温孵育装置均为各个实验室自制，通常构成为水浴锅(用于升温)、烧杯(盛放人工脑脊液)、漂浮漏网(盛放脑片)和氧气管(提供氧气)；现有装置存在诸多不足之处：

1、无法实时监测人工脑脊液的温度。水浴锅只能监测水的温度，而真正影响复温孵育效果的是人工脑脊液；

2、无法均匀供氧和监测氧饱和度。离氧气管出口较远的脑片常常无法得到足够氧气，由于神经元对缺氧极为敏感，往往造成不可逆的损伤。现有装置只能凭经验目测，缺乏统一的衡量指标；

3、无法监测ph值的变化。神经元在生理范围之内活性较好，偏酸或偏碱均会影响神经元活性；

4、无法监测人工脑脊液的渗透压。过高的渗透压会造成细胞失水皱缩，较低的渗透压造成细胞吸水胀破。

5、缺乏避光保护装置。有些脑片内部表达有荧光，暴露在自然光下会造成荧光淬灭，无法达到预期实验目标；其次人工脑脊液暴露在空气中，易受污染；

6、盛放脑片位置有限。由于脑片在孵育过程中不可叠放(叠放处易缺氧)，每个孔洞中仅可放置一张。无法满足大批量实验需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置及操作方法，以解决离体脑片复温孵育过程中的制约因素。

为达到实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置，包括遮光盖、固定板、浴槽、面板、加热板、脑片盛放漏网、氧气供应系统、监测系统以及控制中心；其中，脑片盛放漏网设置在固定板上，固定板设置在浴槽的上部；监测系统包括渗透压检测探头、温度检测探头、氧气浓度监测探头、ph值监测探头以及面板，监测系统连接控制中心，面板上设置有温度显示屏、渗透压显示屏、氧气浓度显示屏、ph值显示屏、警示灯、温度调节按键以及开关；氧气供应系统设置在浴槽内的底部，氧气供应系统连接氧气源；加热板设置在浴槽的内侧面，浴槽的外侧设置有电源插口。

氧气供应系统包括单向电控阀门、氧气供应管路以及氧气吹泡头，氧气供应管路包括一条总管路和若干支管路，支管路在浴槽底部均匀设置，支管路上均匀设置氧气吹泡头；单向电控阀门设置在主管路上的氧气入口处，单向电控阀门连接控制中心。

警示灯包括加热指示灯、恒温指示灯、氧气警示灯、ph值警示灯以及渗透压指示灯，警示灯连接控制中心；连接电源插口的总电路上设置有过载保护器。

脑片盛放漏网的数量与氧气吹泡头的数量相等，脑片盛放漏网位于氧气吹泡头的正上方。

浴槽的底部设置有氧气供应管路卡槽，氧气供应管路设置在所述氧气供应管路卡槽中。

固定板的总长度大于浴槽的前后壁的距离，固定板的一端的两侧开设有豁口，固定板沿长度方向均匀开设有用于安装脑片盛放漏网的孔。

浴槽为立方体凹槽，浴槽壁上开设u型槽，浴槽内部设有固定板搁置架，u型槽底面的高度高于固定板搁置架顶端，固定板的一端搁置在固定板搁置架上，手持段卡入u型槽，手持端还设置有防脱落结构。

固定板为弯折形结构，所述弯折形结构包括手持段、连接段和孵育段；孵育段上均匀设置脑片盛放漏网，手持段与孵育段平行。

遮光盖为不透光的黑色盖体，遮光盖的底面还设置有与u型槽大小、形状以及数量对应的遮光片。

浴槽的外侧设置有保温层。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明利用加热板直接对人工脑脊液进行加温和温度调整监测，测温更准确、调温更便捷；实现了温度精准控制，能实时使多个脑片复温恢复至在体状态，提高脑片保活率，进一步提高实验检测效率，节省时间和脑片资源，而且检测结果也更准确；首次引入氧气浓度、ph值和渗透压实时监测的应用使得脑片复温孵育精准化、规范化并统一化，不再高度依赖实验人员的个人经验；本发明从实验需求出发，设计精巧、针对多项制约因素进行创新，有效提高了离体脑片复温孵育成功率，为后续的神经元记录实验奠定了良好的基础。

进一步的，在浴槽底部铺设氧气管路，对应每个脑片盛放漏网下方均有氧气吹泡头进行供氧，保证氧气供应无死角。

进一步的，脑片盛放装置拆装灵活，可根据实验需要进行加装和拆卸，可满足各类型实验需求。

进一步的，本发明浴槽顶部设有遮光盖，有效保证脑片不受外界光线影响，同时尽可能减少了人工脑脊液的污染。

进一步的，氧气管路均通过卡槽固定于浴槽之中，方便拆卸清洗和更换。

附图说明

图1是本发明的正视结构示意图；

图2是本发明的俯视结构示意图；

图3是本发明的右视结构示意图；

图4是本发明的功能模式图；

图5是本发明的氧气供应系统正视结构示意图；

图6是本发明的氧气供应系统俯视结构示意图；

图7是本发明的氧气供应系统右视结构示意图；

图8是本发明的脑片盛放装置正视结构示意图；

图9是本发明的脑片盛放装置俯视结构示意图；

图10是本发明的脑片盛放装置右视结构示意图。

附图中，1-遮光盖，2-固定板，3-浴槽，4-面板，5-温度调节按键，6-恒温指示灯，7-开关，8-过载保护器，9-氧气接口，10-电源插口，11-固定板搁置架，12-加热板，13-脑片盛放漏网，14-氧气供应管路，15-氧气吹泡头，17-温度监测探头，18-氧气浓度监测探头，19-ph值监测探头，20-单向电控阀门，21-氧气供应管路卡槽，

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

遵从上述技术方案，参考图1至图10，实时监测状态的离体脑片复温孵育装置具体实施方式及操作方法，提高离体脑片复温孵育成功率。

如图1～图3所示，一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置，包括遮光盖1、固定板2、浴槽3、面板4、加热板12、脑片盛放漏网13、氧气供应系统、监测系统以及控制中心；其中，脑片盛放漏网13设置在固定板2上，固定板2设置在浴槽3的上部；监测系统连接控制中心，监测系统包括渗透压检测探头16、温度检测探头17、氧气浓度监测探头18、ph值监测探头19以及面板4，面板4上设置有温度显示屏、渗透压显示屏、氧气浓度显示屏、ph值显示屏、警示灯、温度调节按键5以及开关7；氧气供应系统设置在浴槽内的底部，氧气供应系统连接氧气源；加热板12设置在浴槽3的内侧面，浴槽3的外侧设置有电源插口10。

如图2、图5和图7所示，氧气供应系统包括单向电控阀门20、氧气供应管路14以及氧气吹泡头15，氧气供应管路14包括一条总管路和若干支管路，支管路在浴槽3底部均匀设置，支管路上均匀设置氧气吹泡头15；单向电控阀门20设置在主管路上的氧气入口处，单向电控阀门20连接控制中心；浴槽3的底部设置有氧气供应管路卡槽21，氧气供应管路14设置在所述氧气供应管路卡槽21中。

脑片盛放漏网13的数量与氧气吹泡头15的数量相等，脑片盛放漏网13位于氧气吹泡头15的正上方。

如图4所示，警示灯包括加热指示灯、恒温指示灯6、氧气警示灯、ph值警示灯以及渗透压指示灯，警示灯连接控制中心；连接电源插口10的总电路上设置有过载保护器8。

如图8～图10所示，固定板2的总长度大于浴槽3的前后壁的距离，固定板2的一端的两侧开设有豁口，固定板2沿长度方向均匀开设有用于安装脑片盛放漏网13的孔。

浴槽3为立方体凹槽，浴槽壁上开设u型槽22，浴槽3内部设有固定板搁置架11，u型槽22底面的高度高于固定板搁置架11顶端，固定板2的一端搁置在固定板搁置架11上，手持段卡入u型槽22，手持端还设置有防脱落结构。

固定板2为弯折形结构，所述弯折形结构包括手持段、连接段和孵育段；孵育段上均匀设置脑片盛放漏网13，手持段与孵育段平行。

遮光盖1为不透光的黑色盖体，遮光盖1的底面还设置有与u型槽大小、形状以及数量对应的遮光片。

浴槽3的外侧设置有保温层。

本发明一种实时监测状态的离体脑片复温孵育装置，包括监测控制系统、显示面板、氧气供应系统、脑片盛放装置、浴槽3、遮光盖1；

如图1和图4所示，监测系统包括温度监测系统、氧浓度监测系统、ph值监测系统和渗透压监测系统；监测系统均连接控制中心，浴槽3与电源接线总电路上设有过载保护器8，过载保护器8用于防止电路过载损坏电子元件。

温度监测系统包括温度监测探头17、温度显示屏、恒温指示灯6，当接通电源时，温度监测探头17将测量到的浴槽3内液体的温度反馈在显示屏上。使用者根据需要，通过温度调节按键5设定预期温度。若温度低于预设温度，加热指示灯亮起，加热板12开始工作，对浴槽3中的液体进行升温；若温度达到预设温度，恒温指示灯亮起，加热板12停止工作，停止对液体加热。

氧气浓度监测系统包括氧气浓度监测探头18、氧气浓度显示屏、氧气警示灯；当接通电源时，氧气浓度监测探头18自动检测浴槽内液体的氧气浓度，并实时反馈在氧气浓度显示屏上；若氧气浓度不在生理范围之内时，氧气浓度的生理范围为80～100mmhg，氧气警示灯亮起；低于80mmhg时，氧气供应系统中单向电控阀门20自动开放进行供氧；氧气浓度超过100mmhg，单向电控阀门20关闭，停止供氧。

ph值监测系统包括ph值监测探头19、ph值显示屏和ph值警示灯；当接通电源时，ph值监测探头19自动检测浴槽内液体的ph值，并实时反馈在ph值显示屏上，若液体ph不在生理范围内，ph值的生理范围为7.35～7.45，ph值警示灯亮起，提示实验人员进行调整。

渗透压监测系统包括渗透压监测探头16、渗透压显示屏和渗透压警示灯；当接通电源时，渗透压监测探头16自动检测浴槽内液体的渗透压，并实时反馈在渗透压显示屏上；若液体渗透压不在生理范围内，渗透压的生理范围为290mosm/l～300mosm/l，渗透压警示灯亮起，提示实验人员进行调整。

显示面板包括温度、氧浓度、ph和渗透压四个显示区域；温度显示区域设有温度显示屏、温度调节按键5、加热指示灯以及恒温指示灯6，通过温度调节按键5设置预定温度，温度显示屏显示当前状态浴槽内人工脑脊液的温度；当浴槽3内温度低于预设温度时，加热指示灯亮起，对浴槽3中的液体进行升温；当达到预设温度时，恒温指示灯6亮起，停止加热。

氧气浓度显示区域设有氧气浓度显示屏和氧气警示灯，当氧气浓度超过或低于80～100mmhg时，氧气警示灯亮起；若低于80mmhg，氧气供应系统自动供氧；若氧气浓度超过100mmhg，氧气供应系统停止供氧；ph值显示区域设有ph值显示屏和ph值警示灯，当ph值偏离7.35～7.45正常范围时，ph值警示灯亮起；渗透压显示区域设有渗透压显示屏和渗透压警示灯，当渗透压偏离290～300mosm/l正常范围时，渗透压警示灯亮起。

氧气供应系统包括氧气接口9、单向电控阀门20、氧气供应管路14以及氧气吹泡头15；氧气接口9外接95％o2/5％co2混合气；单向电控阀门20可使氧气从氧气接口9方向流入氧气吹泡头15，而防止浴槽内的人工脑脊液逆向通过氧气供应管路14从氧气接口9流出；总共管路分设四条支路，每条支路上均等距设置有四个氧气吹泡头15，氧气吹泡头15的正上方分别对应设置有脑片盛放漏网13，使得每个脑片盛放漏网13中的脑片均能得到充足而且浓度适宜的氧气供应。

脑片盛放装置包括固定板2和脑片盛放漏网13；固定板2一端置于固定板搁置架11，一段置于浴槽3内，并预设凹口，“z”字形固定板的设计使得脑片盛放漏网13更深入于浴槽，减少了人工脑脊液的用量，更加节约试剂。固定板上预留由四个圆孔，为脑片盛放漏网13放置处。脑片盛放漏网13方便为圆形漏网，脑片在此复温孵育，方便内部的液体与浴槽内的液体可以及时交换。

浴槽3为立方体凹槽，浴槽3内部设有固定板搁置架11、加热板12以及氧气供应管路卡槽21，浴槽壁上设有u型槽22、电源插口7以及氧气接口9；固定板搁置架11用于放置脑片盛放固定板2的一端，u型槽22用于脑片盛放的固定板2另一端，加热板12用于对浴槽内人工脑脊液升温；氧气供应管路卡槽21固定氧气供应管路14，防止其晃动，方便氧气供应管路安装拆卸清洗和更换。

遮光盖1为黑色矩形盖，不透光，便于对离体复温孵育脑片的保护。

本发明的工作过程如下所示：

实时监测状态的离体脑片复温孵育装置在进行复温孵育前，需进行仪器调试；首先需在浴槽3中装入配置好的人工脑脊液，将电源线插入电源线插口10并接通电源，利用塑料软管连接氧气接口10和氧气瓶；盖上遮光盖1，打开电源开关7；此时离体脑片复温孵育装置的监测探头将自动监测液体的温度、氧浓度、ph值和渗透压四项核心指标。

温度监控系统包括温度显示屏、温控电路、加热板12、加热指示灯、恒温指示灯以及温度监测探头17；接通电源后，温度监测探头17自动感知浴槽3内人工脑脊液的温度，并反馈在温度显示屏上，实验人员根据需要通过温度调节按键5设定温度，离体脑片复温孵育的适宜温度在26～28℃之间。若液体温度低于设定温度，加热指示灯亮起，加热板12工作，对人工脑脊液进行升温。当温度监测探头17监测到液体温度达到设定温度后，加热指示灯熄灭，恒温指示灯6亮起，加热板12停止工作。

氧气监控系统包括氧气浓度显示区域、控制电路、氧气浓度监测探头18以及单向电控阀门20构成；氧气浓度监测探头18实时监测浴槽内人工脑脊液的氧气浓度并反馈在氧气显示屏上，氧气浓度用氧分压计量，适宜神经元存活的氧分压为80～100mmhg。氧气浓度不在正常范围内时，氧气警示灯亮起。当氧气浓度超过上限后，单向电控阀门20关闭，停止供氧，氧气浓度低于下限后，单向电控阀门20开大，加大供氧；孵育活的神经元，会逐渐消耗溶解在浴液中的氧气，超过生理范围之后，及时停止，随着氧气消耗，人工脊液中氧浓度会降下来，当溶解在液体中的氧气浓度低于下限，则需及时补充。

ph值监测系统包括ph值监测探头19和ph值显示屏，ph值监测探头19实时监测浴槽内人工脑脊液的ph变化并将结果反馈至ph值显示屏，ph值正常范围在7.35～7.45，当超出这个范围之后，ph值警示灯亮起，提示实验人员及时调整。

氧气供应系统包括氧气接口9、单向电控阀门20、氧气供应管路14以及氧气吹泡头15。氧气接口9外接95％o2/5％co2混合气；氧气供应管路分为一条总管路和四条支管路。支管路等距接合在总管路上，并与总管路连通，氧气供应管路固定在氧气供应管路卡槽21之上。每条支管路等距设有四个出口，可安放氧气吹泡头15。

脑片盛放装置包括固定板2和脑片盛放漏网13；首先将脑片盛放漏网13安置于固定板2上预留的圆形空洞中，每个固定板设置四个脑片盛放漏网13，安装好后，将固定板放置于浴槽之中，一端搁置于固定板搁置架11上，另一端搁置于u型槽22中，固定板2和脑片盛放漏网13放置完成后确保稳定，脑片盛放漏网13完全浸没在人工脑脊液之中，切好的脑片可放置在脑片盛放漏网13上进行复温孵育。

作为本发明优选的实施例，使用时需将脑片盛放漏网13应与氧气吹泡头15对应，保证脑片能够得到足够的氧气供应，浴槽内有人工脑脊液和脑片时应盖上遮光盖1，尽可能减少人工脑脊液挥发和脑片损伤。

本发明所述实时监测状态的离体脑片复温孵育装置的操作方法，包括以下步骤：

1，向浴槽3内倒入配制好的人工脑脊液，将脑片盛放装置固定在浴槽3内；

2，接通氧气，打开电源开关7，盖上遮光盖1，装置自动检测人工脑脊液的温度、氧浓度、ph值和渗透压；

3，设定温度为28℃，加热板12自动对人工脑脊液进行加热；

4，待温度、氧浓度、ph值和渗透压达到预设参数后，进行切片；

5，将切好的脑片放入脑片盛放漏网13中进行复温孵育；

6，复温孵育一小时后可对脑片进行记录，其余脑片继续恒温孵育在装置中。