本发明属于生物技术领域，涉及一种亮氨酸的分离纯化方法。
背景技术：
l－亮氨酸(l－leucine)又称白氨酸，是人体和动物的必需氨基酸之一。1819年，proust首先从奶酪中分离得到l-亮氨酸，以后bracon-not从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并命名为亮氨酸。构成人体蛋白质的氨基酸只有20种，其中有8种是必需氨基酸，从营养学的角度将，评价一种蛋白质营养价值的高低主要取决于这8种必需氨基酸的含量和种类。营养学中的完全蛋白中l-亮氨酸所占份额最高，广泛应用于医药、食品、调味剂、动物饲料及化妆品的制造等许多行业。
在医药领域，l-亮氨酸是临床上复合结晶氨基酸静脉注射液的重要原料，对维持危重病人得到营养需求，抢救患者的生命起着积极作用。在食品方面，l-亮氨酸一方面具有调节氨基酸与蛋白质代谢的作用，另一方面，l-亮氨酸的代谢产物α-酮异己酸也具有调节蛋白质代谢的作用。此外，l-亮氨酸还是许多重要物质合成的前体。以l-亮氨酸为前体合成的乙酰－l-亮氨酸和乙醇酯可作为头晕治疗及营养滋补类药物。l-亮氨酸硫酸锌复合体系在医药、食品、化妆品中有广泛的应用。l-亮氨酸的多聚化合物可以形成纤维、成膜，在纺织和生化反应中发挥着重要作用。
l-亮氨酸作为如此重要的生物化工产品，其来源非常广泛，如动物毛发、血液、香菇等植物体内，此外，还可以通过化学合成法生产，但是微生物发酵产物仍然是当今l－亮氨酸最主要的来源。但是在l-亮氨酸发酵过程中会伴随一定量的l-缬氨酸的产生，两种氨基酸的结构非常相似，等电点也接近，因此如何将l-亮氨酸中存在的l-缬氨酸有效的去除，提高l-亮氨酸的纯度，同时保证产率是目前l-亮氨酸分离纯化工艺中亟需解决的问题。目前，已有的l－亮氨酸分离纯化技术主要有沉淀法、离子交换法、乳状液膜法、反胶团萃取法等。
专利申请cn105399641a公开了一种l-亮氨酸的分离纯化方法，包括如下步骤，将l-亮氨酸发酵液进行离心、超滤，调整超滤液的ph值和离子强度；将表面活性剂加入到有机溶剂中形成反胶团体系溶液，表面活性剂为aot和dtdpa的混合液，浓度为0.03-0.06mol/l；将超滤液加入到反胶团体系溶液中进行错流萃取，萃取后取有机相加入到反萃取水相溶液中进行逆流反萃取，反萃取后取水相进行纳滤、结晶、冷冻干燥，制得纯化的l-亮氨酸。该方法采用了反胶团萃取法，虽然萃取率得到了很大的提升，但是仍然没有将l-亮氨酸和l-缬氨酸有效的分离开。余炜等(《离子交换法分离提取发酵液中l－亮氨酸》，化学世界，2005(2):109-113)依据l-亮氨酸和l-缬氨酸在水中的溶解度相差较大的特性，在发酵液预处理时，采用加入l-亮氨酸晶种和两次重结晶的方法，除去大部分杂质氨基酸，然后用732阳离子交换树脂进行分离纯化l-亮氨酸，以氯化铵作洗脱剂进行梯度洗脱，成功地将l-亮氨酸与l-缬氨酸分离，该方法虽然将l-亮氨酸和l-缬氨酸实现了分离，但是却大大降低了l-亮氨酸的收率。
技术实现要素：
基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种l-亮氨酸的分离纯化方法，有效去除亮氨酸发酵液中缬氨酸，在提高纯度的同时，保持较高的收率。
本发明提供一种l-亮氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)发酵液加入凝聚剂和絮凝剂，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液中加入氯化钠和l-亮氨酸晶种，分离析出物；
(3)析出物加水溶解，加入活性炭脱色、离心、浓缩，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过离子交换树脂层析，氨水洗脱，得到l-亮氨酸。
进一步地，所述步骤(1)中凝聚剂选自氯化铜、四氧化三铁、硫酸锌、聚合铝、聚合铝铁中的一种或多种。
更进一步地，所述步骤(1)中凝聚剂优选为硫酸锌、聚合铝、聚合铝铁中的一种或多种。
进一步地，所述步骤(1)中每升发酵液中添加凝聚剂15-22g。
进一步地，所述步骤(1)中絮凝剂选自壳聚糖及其衍生物、硅藻土、聚丙烯酰胺中的一种或多种。
更进一步地，所述步骤(1)中絮凝剂优选为壳聚糖、硅藻土中的一种或多种。
进一步地，所述步骤(1)中每升发酵液中添加絮凝剂25-40mg。
进一步地，所述步骤(2)中上清液调节ph值1.0-2.0，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.2-0.3g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，静置，分离析出物。
进一步地，所述步骤(3)中析出物加10-20倍80-90℃的水溶解，加入活性炭脱色0.5-1.5h，离心、上清液调节ph至5-6，浓缩至原体积的1/8-1/15，降温析出晶体。
进一步地，所述步骤(4)中晶体加水溶解，通过离子交换树脂层析，0.5-2mol/l的氨水洗脱，流速1-3ml/min，得到l-亮氨酸。
更进一步地，将洗脱液浓缩至晶体析出，得到l-亮氨酸。
更进一步地，所述离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂。
更进一步地，所述离子交换树脂为007×7、d001、d113中的一种。
更进一步地，所述离子交换树脂为007×7。
本发明进一步提供上述分离纯化方法制备得到的l-亮氨酸。
本发明的有益效果为：
(1)发酵液在菌种发酵过程中会产生少量的油脂，增加发酵液的难度，提高杂质去除的难度和效率，本发明在对发酵液进行预处理时采用凝聚剂和絮凝剂结合的方式，通过两种物质的相互作用，改变油脂、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其聚集、沉降，去除发酵液中的菌体、蛋白质和油脂等物质，大大提高分离的效率。
(2)本发明在发酵液上清液中同时采用加入氯化钠和l-亮氨酸晶种的方式，改变l-亮氨酸的溶解度，使其先从溶液中析出，提高l-亮氨酸和l-缬氨酸的分离效率，同时避免l-亮氨酸的过多损失。
具体实施方式
实施例1一种l-亮氨酸的分离纯化方法
(1)每升发酵液中加入20g聚合铝铁和30mg壳聚糖，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.5，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.25g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加15倍85℃的水溶解，加入溶液体积的4％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.5，浓缩至原体积的1/10，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7强阳离子交换树脂层析，1mol/l氨水洗脱，控制流速为2ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
实施例2一种l-亮氨酸的分离纯化方法
(1)每升发酵液中加入15g硫酸锌和40mg硅藻土，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.0，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.20g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加10倍90℃的水溶解，加入溶液体积的2％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.0，浓缩至原体积的1/8，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过d001阳离子交换树脂层析，0.5mol/l氨水洗脱，控制流速为1ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
实施例3一种l-亮氨酸的分离纯化方法
(1)每升发酵液中加入22g硫酸锌和25mg聚丙烯酰胺，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值2.0，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.30g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加20倍80℃的水溶解，加入溶液体积的5％的活性炭进行脱色1.5h，离心后，上清液调节ph至6.0，浓缩至原体积的1/15，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过d113阳离子交换树脂层析，2mol/l氨水洗脱，控制流速为3ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
实施例4一种l-亮氨酸的分离纯化方法
(1)每升发酵液中加入18g聚合铝和35mg壳聚糖，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.8，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.28g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加20倍85℃的水溶解，加入溶液体积的3％的活性炭进行脱色1.0h，离心后，上清液调节ph至5.8，浓缩至原体积的1/12，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7阳离子交换树脂层析，1.5mol/l氨水洗脱，控制流速为1.5ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
对比例1只使用絮凝剂进行l-亮氨酸分离和纯化
(1)每升发酵液中加入30mg壳聚糖，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.5，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.25g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加15倍85℃的水溶解，加入溶液体积的4％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.5，浓缩至原体积的1/10，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7强阳离子交换树脂层析，1mol/l氨水洗脱，控制流速为2ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
对比例2只使用凝聚剂进行l-亮氨酸分离和纯化
(1)每升发酵液中加入20g聚合铝铁，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.5，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.25g/ml，然后加入l-亮氨酸晶种，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加15倍85℃的水溶解，加入溶液体积的4％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.5，浓缩至原体积的1/10，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7强阳离子交换树脂层析，1mol/l氨水洗脱，控制流速为2ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
对比例3步骤(2)仅添加晶种进行l-亮氨酸纯化
(1)每升发酵液中加入20g聚合铝铁和30mg壳聚糖，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.5，加入l-亮氨酸晶种，浓缩至原体积1/10后，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加15倍85℃的水溶解，加入溶液体积的4％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.5，浓缩至原体积的1/10，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7强阳离子交换树脂层析，1mol/l氨水洗脱，控制流速为2ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
对比例4步骤(2)仅添加氯化钠
(1)每升发酵液中加入20g聚合铝铁和30mg壳聚糖，静置，离心得上清液备用；
(2)上清液调节ph值1.5，加入氯化钠，使氯化钠浓度达到0.25g/ml，4℃静置24h，分离析出物；
(3)析出物加15倍85℃的水溶解，加入溶液体积的4％的活性炭进行脱色1h，离心后，上清液调节ph至5.5，浓缩至原体积的1/10，静置，析出晶体；
(4)晶体加水溶解，通过007×7强阳离子交换树脂层析，1mol/l氨水洗脱，控制流速为2ml/min，收集洗脱液，浓缩即得l-亮氨酸纯品。
效果例各制备方法制备得到l-亮氨酸的收率和纯度
比较实施例1-4，对比例1-4各制备方法制备得到的l-亮氨酸收率和纯度，结果如下表：
表1各制备方法制备得到的l-亮氨酸产率和纯度
由表1可知，本发明提供的l-亮氨酸分离纯化方法在保持较高的收率的同时，大大提高了产品的纯度。在分离纯化过程中，凝聚剂和絮凝剂相互配合，去除了发酵液中的菌体、蛋白质、油脂等杂质，提高分离效率，对于提高产品收率和纯度具有重要作用。另外，本发明采用l-亮氨酸晶种和加入氯化钠两种方式协同改变l-亮氨酸在溶液中的溶解度，提高l-亮氨酸和l-缬氨酸的分离度，有效分离两种氨基酸，大大提高产品的纯度。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。