本发明属于dna提取技术领域，涉及一种适用于pcr鉴定的中药材前处理方法。
背景技术：
中药材是人们传统公认的具有医疗作用的材料，由于其质量好、疗效好，在长期使用中得到了医者与患者的普遍认可。中药材地道性的花粉标准主要来源于实践经验，人为因素较大，也不规范。植物药材比如陈皮、当归等来源广泛，产量高，医者和患者接触的也较多，故而对这类药材质量的判断经验较足，这类药材的质量比较稳定有保障，但是动物类药材比如鹿茸等资源非常有限，医者和患者接触较少，缺乏质量判断的经验，加之动物类药材价格也比较昂贵，市场上易存在以次充好的现象，导致药材质量严重参差不齐。
由于dna是稳定的遗传物质，且不同物种的dna差别较大，故而近年来，常常通过pcr技术扩增特定基因，并通过序列对比等手段来鉴别药材真伪。这种科学的鉴定手段可以弥补人为经验判断的不足，提高识别度，进而保证药材质量。
虽然pcr扩增技术已较为成熟，但是其受有机溶剂、蛋白质等多种因素的影响，所以该项技术对dna模板的纯度和浓度要求较高。然而现有的dna提取方法提取的dna纯度都不高，需要经过dna纯化试剂盒纯化后才能进行pcr，增加了工作难度。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，能够提取出纯度较好，浓度较高的中药材dna溶液。
本发明所采用的技术方案是，适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1，将中药材粉碎后酶解，得到酶解液；
步骤2，将酶解液进行孵育，将孵育后的酶解液进行离心处理，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入dna提取液，保温，离心，收集上清液；
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入异丙醇，混匀后静置，然后离心，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用乙醇洗涤所述dna沉淀，得到用于pcr鉴定的中药材总dna。
本发明的特点还在于：
步骤1中酶解具体按照下述方法进行：
向粉碎后的中药材中加入1mol/l的氢氧化钠溶液和脂肪酶，在40±1℃的温度下水浴30min～60min。其中，中药材、氢氧化钠溶液、脂肪酶的比例为1g:5ml:0.1g，脂肪酶为碱性脂肪酶。
步骤2中酶解液孵育的温度为65±1℃，孵育的时间为10～30min，步骤2中离心转速为12000r/min，时间为10min～15min。
步骤3中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0。
dna提取液与中药材的体积质量比为1～2ml：1g。
步骤3中37±1℃条件下水浴保温20～40min，步骤3中离心时的转速为4000r/min～5000r/min，离心时间为10min～15min。
步骤4中异丙醇经4℃预冷，异丙醇与步骤3收集的上清液的体积比为0.6:1。
步骤4静置时的温度为-20℃，静置时间为30～240min。
步骤4中离心时转速为12000r/min，时间为10min。
本发明的有益效果是
本发明适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，能够去除中药材中的脂肪和蛋白质，提出去纯度较好，浓度较高的用于pcr鉴定的中药材总dna。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1，将中药材干燥，粉碎成粉末，然后向中药材粉末中加入1mol/l的氢氧化钠溶液和碱性脂肪酶，其中中药材粉末、氢氧化钠溶液、脂肪酶的比例为1g:5ml:0.1g；
然后在40±1℃的温度下水浴30min～60min，得到酶解液；
步骤2，将酶解液在65±1℃孵育10min～30min，将孵育后的酶解液在12000r/min的转速下离心10min～15min，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入dna提取液，其中dna提取液与中药材的体积质量比为1ml～2ml：1g，在37±1℃条件下水浴保温20min～40min，然后在4000r/min～5000r/min的转速下离心10min～15min，收集上清液；
其中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃的温度下静置30～240min，然后以12000r/min的转速离心10min，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用乙醇洗涤所述dna沉淀，得到用于pcr鉴定的中药材dna。
本发明的适用于pcr鉴定的中药材前处理方法适用于动物角类药材或油脂含量高的植物类药材，其中动物角类药材如梅花鹿茸、马鹿茸、水牛角等；植物类药材如杏仁、桃仁、柏子仁、松子仁或者枣仁等。
本发明适用于pcr鉴定的中药材前处理方法中，由于动物类和高脂肪类中药材样品中含有较多脂肪和蛋白质，易对pcr产生影响，所以在提取dna时，应当尽量除去这些物质。本发明利用氢氧化钠和脂肪酶来降解脂肪和蛋白质，另外氢氧化钠还具有破壁和裂解细胞的作用；利用kci来防止提取过程中dna的降解。
实施例1
步骤1，取中药材梅花鹿茸，将梅花鹿茸在60℃的温度下干燥2h，粉碎成粉末。取1g梅花鹿茸粉末，然后向梅花鹿茸粉末中加入5ml，1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1g碱性脂肪酶(奥维科生物科技)中，然后在39℃的温度下水浴30min，期间摇动装试剂的试管1次，得到酶解液；
步骤2，将酶解液在64℃的温度下孵育10min，将孵育后的酶解液在12000r/min的转速下离心10min，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入1mldna提取液，在36℃条件下水浴保温20min，然后在4000r/min的转速下离心10min，收集上清液；
其中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃的温度下静置30min，然后以12000r/min的转速下离心10min，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用4℃预冷的体积分数70％的乙醇洗涤所述dna沉淀，风干，然后用ddh2o溶解风干的dna沉淀，得到用于pcr鉴定的梅花鹿茸dna溶液。
本实施例获得的梅花鹿茸dna溶液呈淡黄色，取2μl梅花鹿茸dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，梅花鹿茸dna溶液的od260/od280值为1.83，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为453.1ng/μl。
实施例2
取马鹿茸作为中药材样品，其余处理工艺与实施例1的工艺完全相同，得到呈淡黄色得到马鹿茸dna溶液；取2μl马鹿茸dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，马鹿茸dna溶液的od260/od280值为1.82，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为467.1ng/μl。
实施例3
步骤1，取水牛角作为中药材，将水牛角在45℃的温度下干燥4h，粉碎成粉末，然后2g粉末，加入10ml1mol/l的氢氧化钠溶液和0.2g碱性脂肪酶(奥维科生物科技)，然后在41℃的温度下水浴60min，间摇动装试剂的试管3次，得到酶解液；
步骤2，将酶解液在66℃孵育30min，将孵育后的酶解液在12000r/min的转速下离心15min，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入2ml的dna提取液，在38℃条件下水浴保温40min，然后在5000r/min的转速下离心15min，收集上清液；
其中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃的温度下静置240min，然后以12000r/min的转速下离心10min，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用4℃预冷的体积分数70％的乙醇洗涤dna沉淀，风干，然后用ddh2o溶解风干的dna沉淀，得到用于pcr鉴定的水牛角dna溶液。
本实施例获得水牛角dna溶液呈透明无色，取2μl水牛角dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，水牛角dna溶液的od260/od280值为1.80，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为462.4ng/μl。
实施例4
适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1，取杏仁作为中药材，42℃干燥2h，粉碎成粉末，取1g粉末，加入5ml1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1g碱性脂肪酶(奥维科生物科技)，于40±1℃水浴45min，期间摇动装试剂的试管2次，得到酶解液；
步骤2，将酶解液在65℃孵育20min，将孵育后的酶解液在12000r/min的速率下离心13min，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入1mldna提取液，，在37℃条件下水浴保温30min，然后在4500r/min的转速下离心13min，收集上清液；
其中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃的温度下静置180min，然后以12000r/min的转速下离心10min，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用4℃预冷的体积分数70％乙醇洗涤所述dna沉淀，风干，然后用1×te溶解风干的dna沉淀，得到用于pcr鉴定的杏仁dna溶液。
该方法获得的杏仁dna溶液透明无色，取2μl杏仁dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，杏仁dna溶液的od260/od280值为1.83，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为446.2ng/μl。
实施例5
取桃仁作为中药材，其余提取工艺与实施例5完全相同，得到桃仁dna溶液，该方法获得桃仁dna溶液透明无色，取2μl桃仁dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示桃仁样品的od260/od280值为1.81，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为489.3ng/μl。
实施例6
适用于pcr鉴定的中药材前处理方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1，取柏子仁作为中药材，然后将柏子仁60℃干燥2h，粉碎成粉末，取1g粉末，加入5ml1mol/l的氢氧化钠溶液和0.1g中性脂肪酶(奥维科生物科技)，于40±1℃水浴30min，期间摇动装试剂的试管1次，得到酶解液；
步骤2，将酶解液在64℃孵育15min，将孵育后的酶解液在12000r/min的转速率下离心12min，去除上清液；
步骤3，向去除上清液的酶解液中加入1mldna提取液，在37℃条件下水浴保温25min，然后在4200r/min的转速下离心14min，收集上清液；
其中dna提取液中包括0.1mol/l的tris-hcl、0.1mol/l的edta、1.5mol/l的nacl、10g/l的ctab和0.5mol/l的kcl，dna提取液的ph为8.0
步骤4，向步骤3收集的上清液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，在-20℃的温度下静置200min，然后以12000r/min的转速下离心10min，去除上清液，收集dna沉淀；
步骤5，用4℃预冷的体积分数70％的乙醇溶液清洗dna沉淀，风干，然后用1×te溶解风干的dna沉淀，得到用于pcr鉴定的柏子仁dna溶液。
本实施例得到的柏子仁dna溶液呈淡黄色，取2μl柏子仁dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，柏子仁样品的od260/od280值为1.82，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为513.0ng/μl。
实施例7
取松子仁作为中药材，其余提取工艺与实施例7完全相同，得到用于pcr鉴定的柏子仁dna溶液。
本实施例得到的柏子仁dna溶液呈淡黄色，取2μl柏子仁dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示松子仁样品的od260/od280值为1.82，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为498.0ng/μl。
实施例8
取枣仁作为中药材，其余提取工艺与实施例7完全相同，得到用于pcr鉴定的枣仁dna溶液。
本实施例得到的枣仁dna溶液呈淡黄色，取2μl枣仁dna溶液，在可扫描的紫外分光光度计测定检测260nm、280nm处的吸收值，用eppendorfbiophotomete型核酸蛋白质分析dna的浓度，并根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示枣仁样品的od260/od280值为1.84，在pcr容许的dna纯度范围内，浓度为476.5ng/μl。
为了验证本发明酶解处理步骤和dna提取液配方的效果，我们进行了如下对比实验，并与常规的ctab法相比，分别以梅花鹿茸、马鹿茸、水牛角和松子仁作为中药材样品，设计以下对比例。
对比例1
一种适用于中药材pcr鉴定的样品前处理方法，方法步骤与实施例1基本相同，区别在于将步骤1改为“取中药材样品，60℃干燥2h，粉碎成粉末，取1g粉末，加入5ml1mol/l的氢氧化钠溶液，于40±1℃水浴30min，期间摇动装试剂的试管1次，得到酶解液”。
该方法获得dna溶液呈褐色，dna溶液的纯度和浓度的测定结果显示，梅花鹿茸样品的od260/od280值为1.67，浓度为347.8ng/μl；马鹿茸样品的od260/od280值为1.66，浓度为321.4ng/μl；松子仁样品的od260/od280值为1.67，浓度为344.5ng/μl；水牛角样品的od260/od280值为1.65，浓度为321.4ng/μl；上述样品均不在pcr容许的1.8～2.0范围内。
对比例2
一种适用于中药材pcr鉴定的样品前处理方法，方法步骤与实施例1基本相同，区别在于将步骤1改为“取中药材样品，60℃干燥2h，粉碎成粉末，取1g粉末，加入5ml双蒸水和0.1g碱性脂肪酶(奥维科生物科技)，于40±1℃水浴30min，期间摇动装试剂的试管1次，得到酶解液”。
该方法获得dna溶液呈黄褐色，dna溶液的纯度和浓度的测定结果显示，梅花鹿茸样品的od260/od280值为1.71，浓度为322.4ng/μl；马鹿茸样品的od260/od280值为1.66，浓度为368.1ng/μl；松子仁样品的od260/od280值为1.70，浓度为354.2ng/μl；水牛角样品的od260/od280值为1.69，浓度为304.8ng/μl；上述样品均不在pcr容许的1.8～2.0范围内。
对比例3
一种适用于中药材pcr鉴定的样品前处理方法，方法步骤与实施例1基本相同，区别在于将每升dna提取液改为按照以下方法配制“0.1moltris-hcl、0.1moledta、1.5molnacl、10gctab，溶剂为双蒸水，ph8.0”。
该方法获得dna溶液呈黄色，根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，梅花鹿茸样品的od260/od280值为2.14，浓度为356.1ng/μl；马鹿茸样品的od260/od280值为2.04，浓度为391.0ng/μl；松子仁样品的od260/od280值为2.07，浓度为335.2ng/μl；水牛角样品的od260/od280值为2.11，浓度为336.1ng/μl；上述样品均不在pcr容许的1.8～2.0范围内。
对比例4
常规的ctab法提取中药材总dna，参考文献“王培训，植物中药材总dna提取方法的比较.中药新药与临床药理，1999年1月第10卷第1期”中1.4.3所述的ctab法。
该方法获得dna溶液呈黄色，根据od260/od280值来判断dna的纯度，结果显示，梅花鹿茸样品的od260/od280值为1.77，浓度为364.5ng/μl；马鹿茸样品的od260/od280值为1.66，浓度为340.7ng/μl；松子仁样品的od260/od280值为1.77，浓度为354.6ng/μl；水牛角样品的od260/od280值为2.03，浓度为367.4ng/μl；上述样品均不在pcr容许的1.8～2.0范围内。
将本发明实施例1-9与对比例1-4进行对比，得出本发明适用于pcr鉴定的中药材前处理方法提取的dna溶液均具有较好的纯度和较高的浓度，不需要dna纯化试剂盒额外提纯，可直接用于pcr扩增，而对比例1～4的dna溶液的纯度和浓度均较差，需要经dna纯化试剂盒纯化，才能有效进行pcr扩增。