一种检测细胞色素氧化酶CYP3A4的双光子型荧光探针的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子荧光探针的应用。

背景技术：

细胞色素p450为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，是表达于内质网膜上的混合功能氧化酶系统末端氧化酶，在多种内源化合物如脂肪酸、维生素、胆固醇及甾体类的代谢激活以及外源物包括药物、致癌物、环境污染物等物质的体内代谢过程中均发挥中重要作用。

cyp3a4是细胞色素p450的重要亚族，主要分布于肝细胞、肝脏胆管上皮细胞和空肠绒毛柱状上皮细胞，是肝脏中最多的肝药酶，约占肝脏中总cyp450的30％，在肠道中参与代谢约90％的药物。在骨髓、肺、肾等器官组织中也有分布，脑组织也有发现，但在中枢神经系统中的作用尚未明确。此外，在肿瘤细胞中均发现有cyp3a4，但存在细胞结构中的分布差异，应用cyp3a4抗体检测发现，正常乳腺组织中细胞质染色为68％，而肿瘤细胞为100％，可能与肿瘤细胞的高代谢有关。

cyp3a4参与50％以上临床用药的ⅰ相代谢，酶结构中有变异区和稳定区来适应代谢需要，是许多药物相互作用的根源。对其底物、诱导剂和抑制剂的研究，为完善联合用药提供了理论依据。基因多态性是影响酶功能的重要因素，测定用药者的遗传变异将成为临床个体化治疗的趋势。cyp3a4基因存在种族差异，提示进口药于我国上市前进行以中国人为对象的临床试验有重要意义。诱导作用、p-糖蛋白、受体多态性、病理状态、年龄、性别、饮食等多种因素也可引起酶活性、分布和数量的差异。

因此，开发高选择性的cyp3a4的近红外荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子型荧光探针及其应用，该双光子型荧光探针底物没有荧光，羟化产物具有荧光，且具有双光子性质，能够减少背景荧光干扰。利用该探针反应可对多种生物体系中cyp3a4的分布和功能进行定量评价。

本发明提供了一种检测细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子型荧光探针，该探针可被cyp3a4特异性催化生成相应的羟化产物，其结构通式如式（1）所示，n-烷基-1,8-萘酰亚胺类结构，其结构通式如下：

式（1）

其中，r为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环丁基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基、苯基、4-甲基苯基、苄基、4-溴苯基、正十二烷基、2-羟基乙基、4-羧基丁基、2-n，n-二甲基乙基、2-吗啉基乙基。

本发明中n-烷基-1,8-萘酰亚胺类化合物具有代谢酶高选择性（主要由cyp3a4代谢）、代谢产物易于检测，且灵敏度高等特点。

本发明还提供了所述检测细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子型荧光探针，采用上述式（1）化合物作为cyp3a4亚酶的特异性底物，进行羟化反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其羟化产物的生成率，来定量测定不同生物体系（包括重组表达cyp3a4单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系）中cyp3a4活性；具体测定方法为：

——体系中以n-烷基-1,8-萘酰亚胺类化合物作为双光子型探针底物；底物浓度选择1/10~10km；单点测定时底物浓度优选km。

——在pbs缓冲液中，反应温度为20^oc至60^oc之间，优选37^oc为最优反应时间；孵育体系ph介于5.5~10.5之间，优选ph7.4为最优反应ph值；

——反应时间为5~120分钟，确保以上底物相应的羟化产物达到定量限，且底物转化率不超过20%时终止反应；

——测定单位时间内底物减少量或羟化产物生成量作为cyp3a4活性的评价指标。

本发明提供的细胞色素氧化酶cyp3a4的双光子型近红外荧光探针及其应用，该探针底物没有荧光，其羟化产物具有双光子荧光属性，可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；羟基化产物荧光检测条件分别为：激发波长450nm（或800nm），最大发射波长为558nm。

该特异性探针底物为双光子型荧光探针，其在cyp3a4活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组cyp3a4、人及动物组织制备液及各类组织细胞中cyp3a4酶活力的定量测定；同时也可作为在体及动物整体cyp3a4的探针底物，评估代谢酶cyp3a4的个体及种属差异。该探针底物及羟化代谢产物的荧光检测方法，还可用于cyp3a4抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

采用重组细胞色素氧化酶cyp3a4单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，重组单酶代谢反应，特异性抑制实验，以及酶反应动力学几方面的证据，证明n-烷基-1,8-萘酰亚胺类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶cyp3a4代谢，生成羟化产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。

作为高特异性的细胞色素氧化酶cyp3a4单酶的双光子荧光探针底物，该化合物可以用来检测cyp3a4的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的cyp3a4酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、s-9等制备物中cyp3a4的活性标定。该探针能够检测肿瘤中cyp3a4活性，且能够检测人原代肝细胞、老鼠以及斑马鱼中cyp3a4的活性。

选用本发明所述细胞色素氧化酶cyp3a4单酶的双光子型荧光探针反应检细胞色素氧化酶cyp3a4单酶活性具有以下突出优势：

(1)高特异性：n-烷基-1,8萘酰亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶cyp3a4单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即羟化产物。

(2)廉价易得：n-烷基-1,8萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。

(3)高灵敏度：具有n-烷基-1,8萘酰亚胺类化合物羟基化产物具有良好的双光子光谱特性，能更好的减少背景荧光干扰。

附图说明

图1.n-烷基-1,8-萘酰亚胺化合物的结构通式。

图2.n-乙基-1,8-萘酰亚胺的¹h-nmr谱图。

图3.n-乙基-1,8-萘酰亚胺的¹³c-nmr谱图。

图4.n-乙基-1,8-萘酰亚胺的高分辨质谱图。

图5.n-苄基-1,8-萘酰亚胺的¹h-nmr谱图。

图6.n-苄基-1,8-萘酰亚胺的¹³c-nmr谱图。

图7.n-苄基-1,8-萘酰亚胺的高分辨质谱图。

图8.n-乙基-1,8-萘酰亚胺的人cyp重组单酶筛选试验结果

图9.13例hlm对n-乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢图。

图10.cyp3a4蛋白浓度标准曲线测定图。

图11.原代肝细胞双光子激光共聚焦成像图。

图12.肝组织中双光子激光共聚焦成像图。

图13.斑马鱼双光子激光共聚焦成像图。

图14.cyp3a42介导n-乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢通路。

图15.n-烷基-1,8-萘酰亚胺的合成路线。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1.n-乙基-1,8-萘酰亚胺的合成

将5毫摩尔1,8-萘酐和5.5毫摩尔乙胺加入到30毫升乙醇中，加热回流12小时，冷却，过滤固体，滤饼用乙醇淋洗，干燥，得到乳白色固体（收率63%）。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.65–8.58(m,2h),8.21(d,j=8.3hz,2h),7.79–7.73(m,2h),4.26(q,j=7.1hz,2h),1.34(t,j=7.1hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ163.93,133.77,131.52,131.04,128.05,126.85,122.72,35.46,13.34.hrmscalcdfor[m+h]⁺226.0863,found226.0683.

注：化合物n-乙基-1,8-萘酰亚胺的¹h-nmr谱图、¹³c-nmr谱图以及高分辨质谱谱图如图2、3、4所示。

实施例2.n-苄基-1,8-萘酰亚胺的合成

将5毫摩尔1,8-萘酐和5.5毫摩尔本甲胺加入到30毫升乙醇中，加热回流12小时，冷却，过滤固体，滤饼用乙醇淋洗，干燥，得到淡乳白固体（收率55%）。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.61(dd,j=7.3,0.9hz,2h),8.20(d,j=8.3hz,2h),7.75(t,j=7.8hz,2h),7.55(d,j=7.2hz,2h),7.30(t,j=7.4hz,2h),7.24(d,j=7.3hz,1h),5.39(s,2h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ164.13,137.35,133.96,131.47,131.32,129.08,128.45,128.03,127.52,126.88,122.53,43.54.hrmscalcdfor[m+h]⁺288.1019,found288.1024.

注：n-苄基-1,8-萘酰亚胺的¹h-nmr谱图、¹³c-nmr谱图以及高分辨质谱谱图如图5、6、7所示。

实施例3.体外测定人重组cyp单酶的选择性

（1）预先准备90µlcyp代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液（100mm）、重组人cyp各单酶，n-乙基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37^oc条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入10µl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

（3）40分钟后，加入50µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4^oc，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测（ex=450nm，em=558nm）；重组人cyp3a4酶的选择性最高约是其它单酶的29倍左右（图8）。

实施例4.不同个体来源肝微粒体中cyp3a4的活性定量评估

（1）选取13例人肝微粒体（hlm），准备cyp3a4代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液（100mm）、人肝微粒体(0.25mg/ml)、nadp⁺10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，mgcl240mm，n-乙基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μm，于37^oc条件下震荡预孵3分钟；

（2）向反应体系中加入10µl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

（3）30分钟后，加入10µl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

（4）用高速冷冻离心机在4^oc，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测（ex=450nm，em=558nm），将所获荧光强度代入标准曲线后得到13例人肝微粒体（hlm）对n-乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率（图9）。

实施例5.cyp3a4蛋白浓度标准曲线测定

实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，n-乙基-1,8-萘酰亚胺10μm，nadp⁺10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp3a4单酶0mg/ml~0.45mg/ml，ph7.4的pbs缓冲液50mm，总体积为100μl，37^oc下孵育60min，产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与蛋白浓度做标准曲线，每条标准曲线的r²＞0.99，表明标准曲线线性范围宽广，可准确定量cyp3a4的含量。（图10）

实施例6.原代肝细胞中cyp3a4活性评估

实验在共聚焦上进行测定，三组细胞分别为正常组，加利福平组以及加酮康唑组。利福平组细胞预先加入10μm利福平处理三天，随后加入n-乙基-1,8-萘酰亚胺10μm孵育1小时，磷酸缓冲溶液清洗残余探针后，并拍照；酮康唑组细胞在加入n-乙基-1,8-萘酰亚胺10μm的同时加入酮康唑50μm孵育1小时，磷酸缓冲溶液清洗残余探针后，并拍照（ex=800nm，em=520-560nm）。（图11）

实施例8.肝组织中cyp3a4活性评估

取小鼠新鲜肝组织制成约300微米厚肝切片。肝切片滴加n-乙基-1,8-萘酰亚胺50μm的pbs溶液于37度条件下孵育1小时。孵育结束后利用磷酸缓冲溶液清洗残余探针，并拍照；同时设立酮康唑处理组，既在滴加n-乙基-1,8-萘酰亚胺50μm的pbs溶液的同时加入酮康唑50μm于37^oc条件下孵育1小时。孵育结束后利用磷酸缓冲溶液清洗残余探针，并拍照（ex=800nm，em=520-560nm）。（图12）。

实施例9.斑马鱼中cyp3a4活性评估

选取斑马鱼幼鱼，并在培养液中加入n-乙基-1,8-萘酰亚胺50μm于28度孵育1小时。同时设立酮康唑抑制剂组，既在加入n-乙基-1,8-萘酰亚胺的同时加入酮康唑50μm一同孵育。孵育结束后利用磷酸缓冲溶液清洗残余探针，并拍照（ex=800nm，em=520-560nm）（图13）。