敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种敲除zdhhc17基因的n2a细胞系及其构建方法和试剂盒。

背景技术：

n2a细胞全称mouseneuroblastoman2acells，也被称为neuro-2a，是小鼠来源神经瘤母细胞。该细胞贴壁良好，多数成神经元样，具有轴突样结构；该细胞系主要用于实验室培养该细胞系作为体外病理研究的细胞模型；用于神经突增生、神经毒性、阿尔兹海默症和哺乳动物细胞系不对称分裂的研究。

棕榈酰化修饰是一种可逆的蛋白质翻译后脂化修饰，影响蛋白质的结构和稳定性，调节蛋白的互作，转运及蛋白质的膜定位。人的棕榈酰化修饰由23种棕榈酰转移酶(zdhhcs)介导。棕榈酰化修饰在神经细胞中广泛存在，调节神经细胞的生长发育、细胞分化、突触的可塑性，并参与多种神经系统疾病的发生。

亨廷顿疾病(hd)是一种常染色体显性遗传疾病，来源于染色体4p16.3短臂亨廷顿基因(htt)中延伸的cag重复(36以上重复)。亨廷顿疾病(hd)对人的神经功能有广泛的影响，引起大脑神经细胞渐进性退化，通常表现为行动障碍，认知及精神障碍。

zdhhc17是棕榈酰化酶dhhc家族的一个重要成员。dhhc家族蛋白是一类重要的翻译后棕榈酰化修饰酶，在调节蛋白质的膜定位，蛋白质的分拣及蛋白质折叠和稳定性等重要生理过程中起重要作用。相关研究表明dhhc活性紊乱与神经疾病相关。zdhhc17又称为亨廷顿蛋白互作蛋白(hip14)，能通过n端锚蛋白重复结构域(ank)与亨廷顿蛋白(htt)结合，调节htt的棕榈酰化，参与亨廷顿疾病的发病过程。

基因组编辑是研究基因功能的重要手段，目前已经发展出多种基因组编辑技术，例如zfn技术、talen技术和crispr-cas9基因编辑技术。talen为转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)。zfn为锌指核酸酶(zinc-fingernuclease)。crispr是指规律成簇间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)，cas是指crispr相关蛋白。crispr-cas基因组编辑技术是通过一段rna来识别打靶位点，通过cas核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因组的定点编辑，因此该技术也叫做rna指导的核酸内切酶技术。以上技术各有特点，根据要实现的基因组编辑效果选择适合的技术并优化技术方案是应用的关键，兼顾质量和效率是要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种准确高效地构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法。

本发明提供的构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法，为基于crispr-cas9系统的构建方法。

优选地，所述方法以seqidno:1所示zdhhc17基因序列中符合5′-20n-ngg-3′或5′-ccn-20n-3′序列排列规则的序列中的"20n"所示序列作为靶序列；n为a或t或c或g。

优选地，所述靶序列为seqidno:1所示zdhhc17基因序列的第264-283位或第298-317位。

优选地，所述方法包括如下步骤(a)和(b):

(a)包括如下步骤(a1)-(a3):

(a1)合成名称为正向单链dna1和名称为反向单链dna1的两个单链dna；所述正向单链dna1的序列如seqidno:2所示；所述反向单链dna1的序列如seqidno:3所示；

(a2)将所述正向dna1和所述反向dna1进行退火反应，得到双链dna1；

(a3)将所述双链dna1连接到px458质粒的限制性内切酶bbsi的切割位点处，得到的重组质粒记为px458-zdhhc17-1；

(b)包括如下步骤(b1)-(b4):

(b1)合成名称为正向单链dna2和名称为反向单链dna2的两个单链dna；所述正向单链dna2的序列如seqidno:4所示；所述反向单链dna2的序列如seqidno:5所示；

(b2)将所述正向dna2和所述方向dna2进行退火反应，得到双链dna2；

(b3)将所述双链dna1连接到px458质粒的限制性内切酶bbsi的切割位点处，得到的重组质粒记为px458-zdhhc17-2；

(b4)将所述px458-zdhhc17-2质粒与(a3)所述px458-zdhhc17-1质粒共转染n2a细胞，从转染后的n2a细胞中获得zdhhc17基因被敲除的n2a细胞系。

优选地，步骤(a2)和步骤(b2)中，所述的退火反应的条件均为：95℃作用5min，95℃降温至25℃，降温速率为6℃/min；步骤(b4)中，将所述px458-zdhhc17-1和px458-zdhhc17-2质粒共转染n2a细胞时，所述px458-zdhhc17-1和px458-zdhhc17-2质粒的质量比为1：1。

本发明的第二目的是提供敲除zdhhc17基因的n2a细胞系，所述细胞系为利用任一项所述的构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法获得的小鼠神经瘤母细胞n2a-ko-zdhhc17。

本发明的第三目的是提供成套质粒，其由以上所述构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法中的所述px458-zdhhc17-1质粒和所述px458-zdhhc17-2质粒组成。

其中所述成套质粒中的两种质粒可以分别单独包装，也可以按照质量比为1：1的比例混合包装。

所述成套质粒的用途也属于本发明的保护范围，所述用途为基于crispr-cas9敲除n2a细胞中的zdhhc17基因。

本发明的第四目的是提供一种基于crispr-cas9构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的试剂盒，所述试剂盒含有以上所述的成套质粒及说明书；所述说明书中记载有以上任一项所述构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法。

所述的敲除zdhhc17基因的n2a细胞系在zdhhc17棕榈酰化底物的功能研究和亨廷顿疾病的发病机理研究中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的优点在于：本发明的构建敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的方法能够兼顾质量和效率，能够准确高效的获得敲除zdhhc17基因的n2a细胞系。打靶位点的特异性进行了反复的计算验证，利用荧光流式单细胞分选技术，提高了获取敲除细胞的效率，与普通的药物筛选相比大大缩短了细胞株筛选时间。敲除zdhhc17基因的n2a细胞系，或缺少zdhhc17基因的一部分，或由于敲除或插入某些片段而引起移码突变，故不能正确的表达zdhhc17蛋白，为了避免剪切变体的影响，敲除位点设计在各个变体的公共区域。由于zdhhc17是一种棕榈酰化修饰酶，zdhhc17蛋白的缺失导致其底物蛋白无法正常棕榈酰化修饰，无法正常行使蛋白功能，同时zdhhc17与亨廷顿疾病的发病机理相关；故敲除zdhhc17基因的n2a细胞系能够用于其修饰底物的功能研究及亨廷顿疾病的发病机理研究。敲除zdhhc17基因的n2a细胞是敲除zdhhc17基因小鼠的补充与扩展，与敲除zdhhc17基因的小鼠相比，敲除zdhhc17基因的n2a细胞更容易获得大量的生物样本，通过质谱进行棕榈酰蛋白组学分析，获取zdhhc17潜在的靶蛋白信息；靶蛋白在敲除zdhhc17基因的n2a细胞中进行超表达，更容易对其靶蛋白进行调控机制的研究及相关信号通路的研究。

附图说明

图1为pcr鉴定结果。

图2为westernblot鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

px458质粒：将grna人工插入该质粒后组成的重组质粒具有导向作用，可以与所要编辑的基因组中相应的位置进行结合，起到导向的作用。该质粒能同时表达cas9，cas9与grna结合后到达所要编辑的基因组的位置实现其对基因组的切割功能。记载于“fannran,patrickdhsu,jasonwright,vineetaagarwala,davidascott&fengzhang.2013.genomeengineeringusingthecrispr-cas9system.natprotoc；8(11):2281-2308.”一文，公众可以从addgene购买(cat.#：48138)。

px458质粒能够表达egfp荧光蛋白，egfp荧光蛋白可用于荧光流式细胞分选单克隆细胞，可获得基因敲除的细胞系。

大肠杆菌dh5α：购自biomed公司，货号bc102-01。

n2a细胞系：atcc公司购买(cat.#：ccl-131)

实施例一：敲除zdhhc17基因的n2a细胞系的构建

1.待敲除基因靶序列的确定

通过http://asia.ensembl.org/index.html查看zdhhc17基因的剪切拼接及结构域信息，选取zdhhc17基因部分序列(seqidno:1所示，含内含子序列)为待敲除基因序列。利用http://crispor.tefor.net/对seqidno:1所示序列进行分析，在此基础上人工筛选合适的靶序列。对于seqidno:1所示序列，本发明的发明人最终设计了两个靶序列，分别为seqidno:1所示序列的第264-283位(tttatccatggttgtacaac，记为靶序列1)和第298-317位(gcagacccctccttaattga，记为靶序列2)。

在进行靶序列确定时，本发明的发明人是按照如下原则进行的：

(1)依据http://crispor.tefor.net/对序列表序列1分析的结果，选取特异性较高的靶序列(特异性评分>80)。

(2)一般选择外显子上的符合(1)中要求的序列为靶序列，一般同一个敲除的细胞系同时设立两对符合要求的靶序列。

(3)选择两对符合要求的靶序列时两者最好要间隔一定的距离(40-150bp)。

(4)所选择的靶序列最好位于所翻译的蛋白质的较重要的功能结构域，这样能更好的保证敲除效果。

2.dnaoligo引物设计

根据步骤1确定的靶序列，设计两对dnaoligo引物，具体序列如下：

合成了两对寡核苷酸引物用于制备grna,序列如下：

针对靶序列1的dnaoligo引物：

zdhhc17-grna-up1：5’-caccgttgtacaaccatggataaa-3’(如seqidno:2所示)

zdhhc17-grna-down1：5’-aaactttatccatggttgtacaac-3’(如seqidno:3所示)

针对靶序列2的dnaoligo引物：

zdhhc17-grna-up2：5’-caccgcagacccctccttaattga-3’(如seqidno:4所示)

zdhhc17-grna-down2：5’-aaactcaattaaggaggggtctgc-3’(如seqidno:5所示)

3.表达grna的重组质粒的构建

(1)寡核苷酸单链退火获得双链寡核苷酸

将合成的针对靶序列1的两条dnaoligo单链(正向单链dna1和反向单链dna1，分别如seqidno:2和3所示)退火，得到双链双链寡核苷酸1(双链dna1)；

将合成的针对靶序列2的两条dnaoligo单链(正向单链dna2和反向单链dna2，分别如seqidno:4和5所示)退火，得到双链双链寡核苷酸2(双链dna2)；

退火反应体系及退火反应条件均如下：

退火反应体系：zdhhc17-grna-up1或zdhhc17-grna-up2(浓度100μm)1μl；zdhhc17-grna-down1或zdhhc17-grna-down2(浓度100μm)1μl；nebt4ligasebuffer10x1μl；nebt4pnk0.5μl；ddh2o6.5μl；总体系10μl。

退火反应条件：将上述体系混合均匀后放入pcr仪中，37℃作用30min；95℃作用5min；95℃降温至25℃，降温速率为6℃/min；65℃作用10min。4℃保存，直接用于连接。

(2)酶切及连接反应

用axygen质粒小量提取试剂盒提取px458质粒，然后用neb限制性核酸内切酶bbsi进行酶切，酶切条件为37℃切12h。将酶切后的质粒进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果并进行胶回收，胶回收所用试剂盒为axygen公司产品。

因退火产物直接含有与px458载体酶切位点互补的粘末端，故可以直接用于连接实验。

将胶回收后的酶切质粒与胶回收退火产物进行连接反应，具体体系及条件如下：

连接体系：退火产物(双链寡核苷酸1或双链寡核苷酸2)1μl；胶回收后的酶切px458载体(浓度50ng/μl)1μl；nebt4连接酶1μl；nebt4ligasebuffer10x1μl；ddh2o6μl；总体系10μl。

连接条件：pcr仪中21℃连接4h。

(3)转化

于超净工作台中将10μ1连接产物加入50μ1的大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰浴30min,然后42℃水浴中热激90s,接着冰浴5min,然后加入800μ1无抗lb液体培养基后，37℃，160rpm震荡培养45min后，涂布氨苄抗性的lb固体平板，37℃培养箱中培养过夜。待出现单菌落后，挑取3个大小适中的菌落，3ml液体培养8h，制备甘油管，菌体交由武汉金开瑞公司进行测序。

将经测序表明在px458质粒的酶切位点bbsi处插入“5’-gttgtacaaccatggataaa-3’”如seqidno:6所示dna片段的重组质粒命名为:px458-zdhhc17-1；将经测序表明在px458质粒的酶切位点bbsi处插入“5’-gcagacccctccttaattga-3’”如seqidno:7所示dna片段的重组质粒命名为:px458-zdhhc17-2。

(4)重组质粒的提取

将测序正确的克隆进行15ml液体培养，用去内毒素的小量中提质粒提取试剂盒(天根公司)提取重组质粒并测定质粒浓度，提取重组质粒的具体操作步骤严格按照说明书进行。

4.转染及单克隆的筛选

将构建的重组质粒px458-zdhhc17-1和px458-zdhhc17-2共转n2a细胞，具体操作步骤如下：

(1)将n2a细胞分至6孔细胞培养板后培养过夜，所用培养基为含10％(体积分数)fbs的mem培养基，待次日早细胞汇合度达到70％左右时进行下步操作。

(2)将细胞汇合度达到70％的细胞换液至opti-mem中，2h后进行转染。然后将两种质粒(各1ug)和p3000(4μ1)稀释至125μ1的opti-mem中，混匀室温静置5min；lipofectaminetm3000(5μ1)稀释至125μ1的opti-mem中，混匀室温静置5min；稀释后的lipofectaminetm3000加入至稀释后的质粒和p3000混合体系中，轻轻混匀；静置30min后，轻轻滴加提前换至opti-mem培养基的细胞中，置于37℃细胞培养箱中进行培养，4-6h后将细胞换液至含10％(体积分数)fbs的mem培养基中继续培养。

(3)待加完质粒24h-48h后，荧光显微镜下观察egfp的表达情况。大部分细胞出现绿色荧光时，准备进行流式单细胞分离。

(4)准备2个96孔板每孔添加200μ1新鲜mem(含fbs)，用于单细胞培养。

(5)1.5ml37℃预热的胰酶(0.25％trypsin)处理6孔板中的细胞1-3min，至细胞完全分散；加1.5mlmem(含fbs)终止胰酶消化。将悬浮的细胞转移至无菌的15ml离心管，500g离心5min，弃掉上清；用2ml新鲜mem(含fbs)培养基重悬细胞，转移至流式管，进行流式分选。

(6)egfp荧光流式分选获得单细胞，分选获得的单细胞置于96孔板中培养；2-3天补加120μ1新鲜mem(含fbs)，观察孔中单克隆的生长情况，每7天更换一次孔板中的培养基；单克隆细胞长成细胞团大概需要14天时间，将细胞吹散之后转移至24孔板培养，培养2-3天后每孔对应转移至6孔板的2个孔，1孔用于细胞冻存，1孔用于pcr鉴定和westernblot验证。

(7)pcr鉴定阳性克隆

收集扩大至6孔板的单克隆细胞，取一部分细胞裂解并用蛋白酶k处理；细胞裂解液稀释后直接用于pcr鉴定。剩余细胞ripa裂解后冻存，用于westernblot验证。pcr试剂为东盛生物的plusmixcat.#：p2032。

用于pcr鉴定zdhhc17基因敲除的n2a细胞系的引物序列如下：

pcr-kozdhhc17-up:5’-ctcctcaagtctgcgctttc-3’(序列seqidno:1的第181-200位)

pcr-kozdhhc17-down:5’-acgcacactattgagagttcc-3’(序列seqidno:1的第404-424位的反向互补序列)

采用pcr-kozdhhc17-up和pcr-kozdhhc17-down引物对扩增得不到大小为244bp目的条带(序列seqidno:1第181-424位)的克隆为阳性。

实验同时以野生型的n2a细胞系基因组为模版作为对照组。

结果显示，以野生型的n2a细胞系基因组为模版作为对照组。采用pcr-kozdhhc17-up和pcr-kozdhhc17-down引物对扩增得到大小为244bp目的条带(序列seqidno:1第181-424位)。而部分共转染重组质粒px458-zdhhc17-1和px458-zdhhc17-2的n2a细胞，采用pcr-kozdhhc17-up和pcr-kozdhhc17-down引物对扩增得不到大小为244bp目的条带(序列seqidno:1第181-424位)，仅扩增得到偏小的条带，鉴定为阳性克隆。结果如图1所示，泳道1为dnamarker；泳道2为以野生型n2a细胞系基因组为模版的对照组；泳道5为潜在的杂合敲除细胞系；泳道3、4、6、7为敲除了部分zdhhc17基因后的n2a细胞系的阳性克隆的扩增结果。

(8)westernblot验证zdhhc17的表达情况

准备要验证的阳性细胞系和野生型n2a细胞系的ripa裂解液，并用bca的方法对样品的总蛋白量进行定量(bca试剂盒由天根公司生产)。取等量样品与电泳loadingbuffer混合，95℃处理5min，处理好的样品用于后续检测。

将准备好的样品进行westernblot分析。具体操作步骤为：

a.按照《分子克隆》所述的方法进行sds-page,用预染的蛋白质marker作为指示剂，电泳结束后，将凝胶放入电转缓冲液中平衡2min后进行转膜。

b.使用bio-rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300-400ma，转膜时间为90min。

c.转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的western洗涤液中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。

d.吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。

e.洗涤液洗涤5-10min,共洗涤3次。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。

f.洗涤液洗涤5-10min,共洗涤3次。将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。取发光液(天根公司产品)a液、b液等体积混合均匀。将ecl混合液滴加到转印膜上，反应3min。放入clinx化学凝胶成像仪中成像。

结果如图2所示，泳道1为蛋白maker；泳道2为野生型n2a细胞系zdhhc17的表达结果(得到大小约72kd的目的条带)，泳道3、4、5、6为敲除部分zdhhc17基因后的n2a细胞系zdhhc17的表达结果(无目的条带)。β-actin为样品内参。从结果可以看出，敲除部分zdhhc17基因后的n2a细胞系检测不到zdhhc17蛋白的表达，表明该细胞系敲除成功。

sequencelisting

<110>新乡医学院

<120>敲除zdhhc17基因的n2a细胞系及其构建方法和试剂盒

<130>zdhhc17

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>583

<212>dna

<213>musmusculus

<400>1

tacttaaataggttttttgggggttttaagatcatattggaatgaactcacttaataatt60

actatgctttcattaagttatcaaagctgttgctccaattaagactttgaagaactgtga120

actcctgtgtcttgttttaaagcaacttgataaaatgtgtgctttgattccatccttacg180

ctcctcaagtctgcgctttcctagaagactttggaatcacttaatgtctaaatgctcgtc240

ttcctgttttttagacaaggccatttatccatggttgtacaactaatgaaatatggtgca300

gacccctccttaattgatggggaaggatgcagctgtatccacttggctgctcagttcgga360

catacctcaattgttgcttatcttatagcaaaaggacaggtaaggaactctcaatagtgt420

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gttatttttgtactaagttttaatgtacttaaagtaagagcaa583

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

caccgttgtacaaccatggataaa24

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<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

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