本发明涉及一种无血清培养基的燕麦水解物添加剂及其制备方法，具体涉及细胞培养
技术领域：
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背景技术：
：动物细胞被广泛用于重组蛋白药物和疫苗的生产，而动物细胞大规模培养的关键技术在于培养基。用传统的培养基培养细胞，需要在传统培养基中加入5-10％的血清，为培养基提供蛋白成分。血清价格昂贵，容易被病毒和支原体感染，每批次间的质量不稳定，并且血清中含有大量的蛋白质，给重组蛋白细胞产品的分离纯化带来很大的困难。为了克服以上难题，现有技术中多以重组蛋白质的方式为无血清培养基提供蛋白成分，例如中国专利文献cn107760651a中公开一种细胞培养基及生产蛋白质的方法，中国专利文献cn106635953a中公开了无血清无蛋白细胞培养中采用重组蛋白，这些文献中均记载了重组蛋白质的技术手段。这种方法虽然解决了外来蛋白污染问题，但其生产成本较高。因此，寻找替代血清和重组蛋白的添加剂，是无血清培养基技术研究的一项重要课题。燕麦属于禾本科燕麦属一年生草本植物，在我国种植历史悠久。燕麦中营养物质含量非常丰富，含有丰富的可溶性膳食纤维、维生素、矿物质及抗氧化成分。其中，燕麦蛋白质含量在11.3-19.9％之间，一般在16％左右，在粮食作物中居首位。燕麦中蛋白质主要是醇溶蛋白(10-15％)、球蛋白(约55％)、谷蛋白(20-25％)，且燕麦中谷蛋白比小麦中谷蛋白分子量小，且不具备粘弹性，不容易成团。燕麦中蛋白质的氨基酸组成比较全面，必需氨基酸含量较其他粮食作物高两倍左右。肽是由氨基酸组成的，但它具有氨基酸所不能替代的功能，肽与蛋白质都是氨基酸以酰胺键互相连接在一起形成的化合物。两者的区别在于，肽的氨基酸聚合度小，蛋白质的聚合度大。肽和单个氨基酸具有不同的吸收机制，比单个氨基酸的吸收更有效，并能直接参加蛋白质合成，因此提高了生物可利用度。本发明从燕麦中提取蛋白，用于无血清培养基。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中血清安全稳定性低且重组蛋白成本高的技术问题，提供一种安全且成本较低的无血清培养基添加剂。为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：一种无血清培养基，包括以下组分：基础培养基，表皮细胞生长因子添加量1-2.5μg/l、成纤维细胞生长因子添加量1-2.5μg/l，微量元素添加量10-100μg/l，激素添加量5-60μg/l,燕麦水解物添加剂添加量1-4.5g/l。优选地，培养基中还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂为维生素e和还原型谷胱甘肽。优选地，所述维生素添加量0.8-2.5μg/l，所述还原型谷胱甘肽添加量5-8μg/l。优选地，所述表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，所述成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l,所述燕麦水解物添加量3g/l，所述微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l。更优选地，本发明还提供一种燕麦水解物制备方法，该燕麦水解物用于无血清培养基中：一种燕麦水解物制备方法，包括如下步骤：1)将燕麦粉碎，过筛，得到燕麦粉末；2)将步骤1)中所得的燕麦粉末与温水混合，所述燕麦粉末与温水的比重为1：10-30；3)在燕麦粉末与水的混合物中加入蛋白酶进行水解；4)分离出蛋白酶，过滤、脱盐处理得到燕麦水解蛋白物。优选地，所述温水温度为30-55℃。优选地，在步骤2)中，水解时间为0.5-3h，水解温度为30-55℃，调节ph为6-10。优选地，所述蛋白酶用量为燕麦重量的10-20％。更优选地，所述水解时间为2h，所述水解温度为40℃，ph为9，所述蛋白酶用量为15％。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明涉及一种无血清培养基的燕麦水解物添加剂，特别是提供一种细胞无血清培养基，避免了血清污染，提供一种低成本的燕麦水解物提供蛋白，且培养基能够长时间保持细胞活性，延长细胞培养时间，同时还提供一种高效且低成本的生成燕麦水解物的方法，降低了无血清培养基成本。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。一种无血清培养基，包括以下组分：基础培养基，表皮细胞生长因子添加量1-2.5μg/l、成纤维细胞生长因子添加量1-2.5μg/l，微量元素添加量10-100μg/l，激素添加量5-60μg/l,燕麦水解物添加剂添加量1-4.5g/l。无血清培养基即为不含血清的培养基，由于含血清培养基容易被病毒和支原体感染，每批次间的质量不稳定，并且血清中含有大量的蛋白质，给重组蛋白细胞产品的分离纯化带来很大的困难。因此，一般地，无血清培养基作为动物细胞等的培养基。本发明中的无血清培养基选自hybridomasfm(gibco)、cdhybridoma培养基(gibco)、nctc-109培养基或pfhm-ii无蛋白杂交瘤细胞培养基。当然，需要说明的是，无血清培养基不限于上述指出的培养基。表皮细胞生长因子，即egf(epidermalgrowthfactor)，是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。egf的主要功能是促进皮肤细胞的分裂，还可以用于诊断各种肿瘤和溃疡病。成纤维细胞生长因子(fgf，fibroblastgrowthfactor)由内皮细胞、平滑肌细胞或巨噬细胞分泌。fgf能够促进内皮细胞的游走、平滑肌细胞的增殖和新血管形成，修复损害的内皮细胞。实施例一无血清细胞培养基中添加了抗氧化剂，抗氧化剂为维生素e和还原型谷胱甘肽，两者可产生协同作用，进一步提高培养基对动物细胞的培养效果。所述维生素添加量0.8-2.5μg/l，所述还原型谷胱甘肽添加量5-8μg/l。优选维生素添加量1.5μg/l，还原型谷胱甘肽添加量6μg/l。为了研究添加维生素e和还原型谷胱甘肽对培养动物细胞的培养效果，设置实验组1和对照组1-3。其中实验组1培养基：础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l，微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l，维生素添加量1.5μg/l，还原型谷胱甘肽添加量6μg/l,燕麦水解物添加剂添加量3g/l。对照组1培养基：础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l，微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l，维生素添加量1.5μg/l,燕麦水解物添加剂添加量3g/l。对照组2培养基：础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l，微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l，还原型谷胱甘肽添加量6μg/l,燕麦水解物添加剂添加量3g/l。对照组3培养基：础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l，微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l,燕麦水解物添加剂添加量3g/l。将cho细胞接种于上述的无血清培养基中培养操作，培养容器为方瓶、摇瓶或生物反应器。表1示出各组的培养检测结果对比：细胞转化率分裂相指数实验组160％12％对照组133.5％7.1％对照组232.1％7.9％对照组324％4.4％上述结果表面，添加维生素e和还原型谷胱甘肽能够提高细胞转化率和分裂相指数，且单独添加维生素e或还原型谷胱甘肽均能提高培养效果，但是，维生素e和还原型谷胱甘肽具有相互协同作用，共同添加培养效果更加突出。实施例二一种无血清培养基，包括以下组分：基础培养基，表皮细胞生长因子添加量1-2.5μg/l、成纤维细胞生长因子添加量1-2.5μg/l,燕麦水解物添加剂添加量1-4.5g/l，微量元素添加量10-100μg/l，激素添加量5-60μg/l。进一步的，燕麦水解物添加剂添加量2-4g/l，采用此添加量的燕麦水解物添加剂，有利于提高细胞的培养效果。在其中一些实施例中，燕麦水解物添加剂的添加量为3g/l。为了研究添加燕麦水解物添加剂对培养动物细胞的培养效果，设置实验组1和对照组1。其中实验组1培养基：基础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l,微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l，维生素添加量1.5μg/l，还原型谷胱甘肽添加量6μg/l,燕麦水解物添加剂添加量3g/l。对照组1培养基：基础培养基，表皮细胞生长因子添加量1.5μg/l，成纤维细胞生长因子添加量1.5μg/l，微量元素添加量60μg/l，激素添加量45μg/l，维生素添加量1.5μg/l，还原型谷胱甘肽添加量6μg/l。将cho细胞接种于上述的无血清培养基中培养操作，培养容器为方瓶、摇瓶或生物反应器。表1示出各组的培养检测结果对比：上述结果表明，添加燕麦水解物添加剂，大大提高细胞培养效果，这是因为燕麦中蛋白质的氨基酸组成比较全面，必需氨基酸含量较其他粮食作物高两倍左右，添加燕麦水解物，能够产生大量细胞合成和生长所必须的蛋白成分。通过在无血清培养基中添加燕麦水解物，各组分相互协同作用，提高细胞密度和生长状况。实施例三本发明还提供一种燕麦水解物的制备方法，该燕麦水解物用于无血清培养基中。一种燕麦水解物制备方法，包括如下步骤：1)将燕麦粉碎，过筛，得到燕麦粉末；2)将燕麦粉末与温水混合，燕麦粉末与温水的比重为1：10-30；3)在燕麦粉末与水的混合物中加入蛋白酶进行水解；4)分离出蛋白酶，过滤、脱盐处理得到燕麦水解蛋白物。优选地，所述温水温度为30-55℃。优选地，在步骤2)中，水解时间为0.5-3h，水解温度为30-55℃，调节ph为6-10。优选地，所述蛋白酶用量为燕麦重量的10-20％。更优选地，所述水解时间为2h，所述水解温度为40℃，ph为9，所述蛋白酶用量为15％。综上所述，本发明涉及一种无血清培养基的燕麦水解物添加剂，特别是提供一种细胞无血清培养基，避免了血清污染，提供一种低成本的燕麦水解物提供蛋白，且培养基能够长时间保持细胞活性，延长细胞培养时间，同时还提供一种高效且低成本的生成燕麦水解物的方法，降低了无血清培养基成本。应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3