一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法与流程

本发明涉及一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

鸡胚胎成纤维细胞在体外水平的研究中常作为转染、攻毒等试验的实验对象，是一种重要的体外试验模式细胞。但原代分离的胚胎成纤维细胞通常含有较多的杂细胞，其培养和增殖能力也不稳定，且细胞均一度较差，因此建立鸡胚胎成纤维细胞单细胞克隆细胞系显得尤为重要。

现在主要制备单细胞克隆的方法主要包括有限稀释法，克隆环法，美希索或琼脂凝胶克隆法，流式细胞分选法等。但有限稀释法、克隆环法挑取单克隆效率低，需要耗费大量的时间筛选单克隆；美希索或琼脂凝胶克隆法仅适用于特定种类细胞，如海拉细胞，适用范围窄；而流式细胞分选法对细胞的机械损伤大且价格昂贵。因此亟须一种新的鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系的建立的方法。

技术实现要素：

针对目前制备单细胞克隆的方法存在的缺点：效率低、价格昂贵、适用范窄等，本发明旨在克服上述缺点，发明出一种简单低廉而又高效的鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法。

本发明的技术方案如下：

一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法，其特征是，包括以下步骤：

1）备好以下物品：注射器、棉球、针管式滤器、橡皮管、bj40玻璃管；

2）去除注射器的推塞和针尖，保留带有刻度标记的针筒，然后在该针筒内塞进干净干燥的棉球；

3）两手捏在bj40玻璃管两端，将玻璃管中部在酒精灯外焰处烧软，此时两手迅速水平向两边拉开，使该玻璃管变细，从该玻璃管中部敲断，得到两只针管状玻璃管；

4）将针管式滤器的大头连接注射器针筒的针口端，然后将橡皮管的一头连接针管式滤器的小头，再将其中一只针管状玻璃管与橡皮管的另一头连接，确保各连接处密封性良好，得到重组口吸管；

5）口吸管重组后，操作者口含注射器针筒的尾部，捏住针管状玻璃管，在含有细胞的培养皿中进行操作，挑出单个细胞；将单个细胞种植入96孔板中，再依次逐渐放大种到6孔板中，收集细胞。

优选地，所述注射器为1毫升注射器。

优选地，所述针管式滤器为0.22微米针管式滤器。

优选地，所述橡皮管的内径为2.5微米，长度为10厘米。

优选地，所述针管状玻璃管的大端与橡皮管的另一头相连。

本发明中，口吸管共分为四个部分，第一部分：在注射管（针筒）中塞入干净干燥的棉球，目的为初步过滤口中的杂质；第二部分：将针管式滤器的大头连接注射器的针口，目的为过滤口中的细胞和细菌；第三部分：将橡皮管一头连接针管式滤器的小头，另一头连接处理过后的玻璃管，用于直接挑取细胞。

相比于目前制备单细胞克隆的方法，本发明中口吸管采用的材料均容易购买，且价格低廉。组装完成后，成品操作简单，使用者可以挑取特定单个细胞进行单克隆培养，所采用的重组口吸管适用于所有类型的细胞。

附图说明

图1是本发明的口吸管结构示意图；

图2是本发明中利用重组口吸管挑取单细胞培养克隆的示意图。

具体实施方式

如图1所示，依次连接好1毫升注射器1（去除活塞和针尖，保留针筒）、0.22微米针管式滤器3、内径2.5微米，长10厘米的橡皮管4、拉至成型的bj40玻璃管5（针管状玻璃管）。

具体操作如下：

第一部分：将1毫升注射器的推塞和针尖丢弃不用，在注射器管中塞入干净干燥的棉球2，目的为初步过滤口中的杂质。

第二部分：将0.22微米针管式滤器的大头连接1毫升注射器的针口，连接处应密封性良好，目的为过滤口中的细胞和细菌。

第三部分：将内径2.5微米，长10厘米的橡皮管一头连接0.22微米针管式滤器的小头，连接处应密封性良好。

第四部分：首先两只手分别捏在bj40玻璃管两端，将玻璃管中部在酒精灯外焰处烧软，此时两手迅速水平向两边拉开，使玻璃管变细。接下来用砂轮磨口，从玻璃管中部敲断，得到两只针管状玻璃管。最后，将其中一只针管状玻璃管与橡皮管另一端连接，连接处应密封性良好。

组装完成后，操作者口含1毫升注射器尾部，右手捏住玻璃管，在含有细胞的培养皿中进行操作，挑出单个细胞。将单个细胞种植入96孔板中，再依次逐渐放大种到6孔板中，收集细胞。

如图2所示，挑取单细胞培养克隆的方法，a:利用口吸管从皿中挑取单个细胞后，种到96孔板中培养；b:待生长至细胞汇合度90%时，换成24孔板，以此类推，依次传入12孔板和6孔板，最终收取细胞样。

具体做法如下：

利用上述重组口吸管，从细胞培养皿中挑出单克隆细胞，种植到96孔板中，待克隆生长一周后，将克隆团用50微升胰酶消化3分钟，再加入50微升培养基终止消化，使用移液枪吹散克隆团后转移至1.5毫升离心管中，1200rpm离心6分钟，弃去上清，重新加入500微升培养基重悬细胞，全部传至24孔板培养。

24孔板培养24小时后，用200微升胰酶消化3分钟，再加入200微升培养基终止消化，使用移液枪吹散细胞后转移至15毫升离心管中，1200rpm离心6分钟，弃去上清，重新加入2毫升培养基重悬细胞，全部传至12孔板培养。

12孔板培养24小时后，用500微升胰酶消化3分钟，再加入500微升培养基终止消化，使用移液枪吹散细胞后转移至15毫升离心管中，1200rpm离心6分钟，弃去上清，重新加入3毫升培养基重悬细胞，全部传至6孔板培养。

培养24小时后，单克隆细胞系建立完成，使用者可以用于后续实验。

注：所用细胞培养基配方均为：90%dmen(gibico公司)+10%fbs（gibico公司）。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法，属于生物技术领域。在注射管中塞入干净干燥的棉球，将针管式滤器的大头连接注射器的针口，将橡皮管一头连接针管式滤器的小头，另一头连接处理过后的玻璃管，用于直接挑取细胞。本发明中口吸管采用的材料均容易购买，且价格低廉。组装完成后，成品操作简单，使用者可以挑取特定单个细胞进行单克隆培养，所采用的重组口吸管适用于所有类型的细胞。

技术研发人员：金晶;赵瑞丰;张晨;李碧春;张亚妮;左其生;孙红艳
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2019.03.05
技术公布日：2019.06.04